تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي

ملخص

التحليل الكمي لمحتوى الخلية داخل العصب الوركي مورين أمر صعب نظراً لندرة هذه الأنسجة. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لهضم الأنسجة والإعداد التي توفر خلايا كافية للتحليل الخلوي تدفق السكان الخلايا المناعية من الأعصاب من الفئران الفردية.

الملخص

الخلايا المناعية المقيم في الأعصاب في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ضرورية للحفاظ على سلامة الخلايا العصبية في عصب صحية. الخلايا المناعية من السندات الإذنية تتأثر بالإصابة والمرض، والتي تؤثر على وظيفة العصب وقدرتها على التجدد. عادة يتم تحليل الخلايا المناعية العصبية من الفلورة (إذا كان). بينما إذا كانت ضرورية لتحديد موقع الخلايا المناعية في العصب، إذا كان فقط نصف الكمية والأسلوب الذي يقتصر على عدد العلامات التي يمكن تحليلها في وقت واحد ودرجة التعبير السطحي. واستخدمت في هذه الدراسة، التدفق الخلوي للتحليل الكمي لتسلل الكريات البيض إلى الأعصاب الوركي أو الجذرية الظهرية جانجليونس (باﻷسعار) من الفئران الفردية. تم إجراء تحليل خلية مفردة باستخدام DAPI وحللت العديد من البروتينات في نفس الوقت للتعبير سواء السطحية أو داخل الخلايا. ولدت الأعصاب الوركي كلا من الماوس واحدة التي يعاملون وفقا لهذا البروتوكول ≥ 30,000 الأحداث الأنوية وحيدة. نسبة الكريات البيضاء في الأعصاب الوركي، يحددها التعبير عن CD45، كان حوالي 5% محتوى خلية الإجمالي في العصب الوركي وحوالي 5-10% في الرسم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز أساسا على السكان الخلايا المناعية داخل السندات الإذنية، مرونة التدفق الخلوي لقياس عدد من علامات في وقت واحد يعني أن السكان خلايا أخرى موجودة داخل العصب، مثل خلايا شوان، بيريسيتيس ، الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، يمكن أيضا أن تحلل باستخدام هذا الأسلوب. ولذلك توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة لدراسة التأثيرات الجهازية على السندات الإذنية، مثل نيوروتوكسيكولوجي والنماذج الوراثية للاعتلال العصبي أو الأمراض المزمنة، مثل داء السكري.

المقدمة

الخلايا المناعية التي أدخل السندات الإذنية من التداول، حسب تعريف التعبير عن CD45 و CD11b، يساعد على المحافظة على سلامة العصب وتلعب دوراً على حد سواء في التجدد وانحطاط¹. يمكن أن تكون منحرفة الضامة (المعرفة بواسطة التعبير عنها من CD68 في الماوس) نحو النمط الظاهري تحريضية، التعبير عن MHC أكثر من الدرجة الثانية و CD86 على سطحها (M1)، أو نحو النمط الظاهري للالتهابات، معربا عن مزيد من CD206 داخل الخلايا (M2)² . انحراف من النمط الظاهري بلعم عملية دينامية وينظم من خلال Akt مما يشير إلى³، والتي تعكس مختلف مهام الضامة في الدفاع ضد العوامل الممرضة (M1) والدور في تجديد الأنسجة (M2). يتطلب التجديد العصب المتضرر أولاً البلعمه حطام المايلين التي الضامة في العصب^4،5، والالتهابات (CD68⁺CD206⁺) أظهرت الضامة M2 لتعزيز ثمرة إكسون في ⁶من السندات الإذنية. انخفاض التوظيف أو الضامة للسندات الإذنية، أو قد يؤدي ضعف القدرة على البلعمه في التجدد البصر والحفاظ على سلامة الأعصاب. التهابات الضامة M1، التعبير عن MHC الدرجة الثانية، أقل قدرة على البلعمه من الضامة M2، والتهاب الخلايا العصبية المتورطة في الآلية المرضية لعدة أمراض الأعصاب⁷.

التغييرات التي تحدث للأعصاب المناعي المقيم نتيجة للأضرار التي قد تكون كمية، يظهر في فقدان CD45⁺ الكريات البيضاء (أو زيادة تسلل CD45⁺ الكريات البيضاء في حالة التهاب)، أو نوعية، مثل تغيير النمط الظاهري بلعم من M2 إلى النمط الظاهري M1. قد تم تحليلها في خلايا المناعة من السندات الإذنية تقليديا عن طريق إذا، استخدام الأجزاء المجمدة أو المواد جزءا لا يتجزأ من البارافين⁸. إذا كانت مطلوبة من أجل تحديد ترجمة الخلايا للفائدة. ومع ذلك، استخدام القياس الكمي إذا غالباً ما يعتمد على عد عدد صغير نسبيا من الخلايا في مقطع ضيقة للأنسجة، مما يجعل التقدير الكمي لا يمكن الاعتماد عليها وعرضه لتحيز الانتقاء. للتعرف على مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية، تزامن الكشف عن علامات خارج الخلية و/أو داخل الخلايا المطلوب، بينما يتطلب تحديد النمط الظاهري بلعم علامات على الأقل اثنين على الأقل، على وجه التحديد، CD206 و MHC الفئة الثانية. كما الأكثر شيوعاً مجاهر المتاحة تقتصر على قنوات الألوان اثنين على الأقل، مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك) وفيكوريثرين (PE)، وصف مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية التي إذا يمكن أن تتطلب التقييدية وغير مكتملة، الحاجة إلى وجود عدة شرائح، مستمدة من نفس المنطقة من الفائدة، الملون، وحلل بالتوازي. هذا الجانب تستغرق وقتاً طويلاً ولذلك لا تصلح اللازمة لتحليل عينات كبيرة من مجموعات. وعلاوة على ذلك، أن معظم من علامات الاهتمام من خارج الخلية، يمكن الكشف في الأنسجة، والتي أما تم تضمينها في البارافين أو كريوكونسيرفيد، إشكالية بسبب الإخلال بسلامة الغشاء والإخفاء من [ابيتوبس]، فضلا عن فقدان مولدات المضادات للفائدة من استخدام المذيبات، مثل الأسيتون والميثانول⁹.

في المقابل، التدفق الخلوي، الذي يقيس الضوئية والأسفار خصائص الخلايا المفردة في تعليق كما أنها تمر عبر شعاع من الضوء، يوفر وسيلة أكثر عملية وشاملة لتحليل السكان الخلية. التدفق الخلوي، بدلاً من إنتاج صورة رقمية للأنسجة، ويقدم القياس الكمي الآلي لتعيين المعلمات، التي تشمل الحجم النسبي للخلية ومؤشر يعكس، يشار إلى الأمام مبعثر (FSC)، تعقد الحبوبية/الداخلية أو الجانب-مبعثر (SSC)، وكثافة نسبية الأسفار، توفير أن الخلية قد وصفت مع فلوروفوري مناسبة، مثل جسم مترافق. Cytometer تدفق نموذجي يتكون من اثنين، الليزر تبريد الهواء؛ ليزر أرجون وتنتج الضوء الأزرق في 488 نانومتر وليزر هيليوم نيون ينتج ضوء في 633 نانومتر. هذه التركيبة تسمح لكشف وقياس، وفي نفس الوقت، مالا يقل عن خمسة أهداف على السطح أو داخل المقصورة داخل الخلايا. يمكن أن تتكون سيتوميتيرس تدفق أكثر تقدما من أشعة الليزر المتعددة، والتي تسمح للكشف عن فلوروتشروميس مختلفة تصل إلى ثمانية في وقت واحد، مما يوفر عدم تداخل موجات انبعاثات الذروة من فلوروتشروميس المحدد إلى حد كبير.

لتحليل بالتدفق الخلوي، الأنسجة للفائدة يجب أولاً أن انزيماتيكالي يهضم، عموما مع كولاجيناز، توليد تعليق خلية واحدة. تحليل مورين الوركي الأعصاب كانت صعبة بسبب كمية صغيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من كل الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، محتوى الدهون عالية المايلين حول محاور عصبية يعوق الانتعاش الخلية وتنتج كميات كبيرة من الحطام. الأسلوب الموصوفة هنا لإعداد العصب الوركي والهضم تم تكييفها من بروتوكول عزل خلايا شوان المشبك et al. ⁷، ويهدف إلى عزل خلايا كافية من أعصاب الفئران الفردية لتحليل التدفق الخلوي، بغية الحد من التباين بين الفئران. استخدام DAPI لتحديد خلايا مفردة في خلاصة النسيج الخام التي تلتف على ضرورة إزالة الحطام إكسون، الأمر الذي يؤدي عادة إلى فقدان الخلية. الغسيل عدة مرات مع الإيدز عازلة المنظفات الغنية في الإفراج عن الخلايا محاصرين داخل الحطام الدهنية، مما يؤدي إلى زيادة المحصول. الهضم من كلا الأعصاب الوركي كاملة الطول من ماوس واحدة وفقا لهذا البروتوكول يولد إيه ثري زيرو، 000 الأحداث الأنوية واحد وتم استرداد على الأقل 3 إضعاف هذا العدد من الرسم. نسبة CD45⁺ الكريات البيضاء بحوالي 5 في المائة محتوى خلية الإجمالي في الخلاصة العصب الوركي وحوالي 5-10% في الخلاصة DRG. غالبية CD45⁺ الخلايا في العصب الوركي أعرب عن علامات بلعم، CD68 و CD206.

البروتوكول

وأبقى في دائرة الضوء/الظلام ح 12 القياسية البرية من نوع C57BL/6 الفئران (الذكور؛ 10-12 أسبوعا) وتم توفير حرية الوصول إلى النظام الغذائي تشاو القياسية والمياه. جميع التجارب على الحيوانات كانت أجرته لجنة الاستخدام والعناية بالحيوانات المحلية وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات المحلية واستخدامها في الهيئة الإقليمية في كارلسروه، ألمانيا (G216/10).

1. نضح للماوس

1. التضحية بالماوس (C57BL/6؛ الذكور؛ 10-12weeks) باستخدام CO₂ أو وفقا للوائح المحلية.
   ملاحظة: النزيف الرجعية-المداري يمكن إنجازها للحصول على تحكم الكريات البيضاء، استخدام الأنابيب المغلفة يدتا 1.5 مل. هذا الأسلوب من نزيف من كفاءة فورا بعد التضحية. يمكن أن يؤديها التجويف الصفاقى، وكذلك الغسل (PCL) للحصول على مراقبة الضامة، استخدام برنامج تلفزيوني ساخن مسبقاً في 37 درجة مئوية لتجنب تراص الباردة من الدم، والتي قد تعيق التروية.
2. تطهير الماوس برش الفراء في البطن متحررا مع 70% v/v الإيثانول ومسح مرارا وتكرارا مع أنسجة مع شاش القطن. باستخدام مقص غير حادة، تقطع فتح في جلد البطن بشق طولي.
3. كشف التجويف الجنبي بأول إجراء شق في الحجاب الحاجز باستخدام مقص منحنى، كليلة وثم توسيع شق على الطول من القفص الصدري. إجراء خفض مماثل في الجانب كونترالاتيرال حتى القص يمكن بعناية رفع بعيداً.
4. مع رؤية واضحة للقلب والأوعية الرئيسية، إدراج قياس فراشة 23 إبرة، متصلاً بحقنه 50 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني المثلج، في الدائرة اليسرى من القلب.
5. جعل شق إلى الاذين الأيمن من القلب باستخدام مقص آيريس لخلق كبير من منفذ ممكن دون الأضرار بالشريان الاورطي تنازلي، وثم بلطف خفض المحاقن للمضي قدما نحو 30 مل من برنامج تلفزيوني. يجب أن يشغل الإفرازات واضحة. تطهير الكبد و/أو الكلي يمكن استخدامها كمؤشر التروية الجيدة.

2-تشريح العصب الوركي والرسم

ملاحظة: بالنسبة لتشريح الأعصاب الوركي، الجلد أعلاه عضلة يتم إزالة مكسيموس والماوس وضع الجانب البطني أسفل بينما تمتد السفلية.

1. على الصعيد الثنائي تشريح الأعصاب الوركي كله بفصل أنسجة العضلات من الفخذ الظهرية العليا، ومتابعة العصب على طول العمود الفقري. قطع العصب حيث أنه يخرج من العمود الفقري، ومباشرة فوق الركبة في الطرف الآخر.
   ملاحظة: تجنب المناولة المفرطة للعصب مثل سحق أو سحب مع الملقط.
2. باستخدام الملقط، نقل nerve(s) قصت، حوالي 2 سم كل الأعصاب، إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني المثلج ومخزن على الجليد.
   ملاحظة: العصب يمكن تخزينها بين عشية وضحاها على الجليد.
   ملاحظة: لتشريح الرسم، استخدام الملقط ومشرط، فصل الجلد من الأنسجة اللينة الكامنة التي يسقط بلطف الجلد الخلفية المتبقية للكشف عن سرطان عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر مناطق العمود الفقري. إزالة الرأس بالقطع الموجودة في قاعدة الجمجمة باستخدام زوج حادة مقص.
3. قص أضلاعه متوازية مع وعلى مقربة من العمود الفقري في كلا الجانبين، قبل فصل في الأحشاء متصل بالجانب الأمامي من العمود الفقري. قص قصبة وإزالة العمود الفقري بعرضي خفض مستوى قصبة. باستخدام مقص آيريس، قطع بعيداً أي العضلات والدهون، والأنسجة الناعمة الأخرى من العمود الفقري.
4. مكان العمود الفقري مع الجانب الظهرية مواجهة وفتحه، بدءاً من نهاية والذيلية، بانزلاق طرف واحد مقص في القناة الفقري في موقف 03:00 ص وعظم مقصوص. كرر هذا الإجراء في موقف 09:00 ص.
   ملاحظة: من المهم قص بالضبط في مركز لتجنب إتلاف في الرسم.
5. كرر القطع من جنبا إلى جنب حتى يتم الوصول إلى نهاية روسترال والحبل الشوكي يتم كشفها تماما. استخدام مجهر تشريح، إزالة النخاع الشوكي لفضح الأعصاب العمود الفقري، والتي يمكن استخدامها لتحديد موقع باﻷسعار داخل العمود الفقري.
6. إزالة باﻷسعار القطني التي تشيد بلطف على الجذر الظهرية سحب الرسم في قنوات الفقري، ثم قطع الأعصاب والأنسجة الضامة مع قزحية مقص لإزالة باﻷسعار.
   ملاحظة: من الممكن لتقييد جمع "الرسم" L4-L6، التي تسهم في العصب الوركي.
7. استخدام الملقط، نقل باﻷسعار إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وتخزين على الجليد.
   ملاحظة: العصب يمكن تخزينها بين عشية وضحاها على الجليد.

3-الهضم العصب الوركي والرسم

1. تعد وسائل الإعلام الهضم (دميم، 10 مم حبيس، 5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، كولاجيناز 1.6 ملغ/مل نوع 4) تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل ديوكسيريبونوكليسي، ومخزن على الجليد.
   ملاحظة: كمية متوسطة الهضم المطلوبة للماوس (الأعصاب الوركي + باﻷسعار) 1 مل. وبمجرد إعداد، يمكن تخزين مختبرين لوسائط الإعلام الهضم عند-20 درجة مئوية.
2. نقل الأعصاب الوركي وبالاسعار من الماوس واحد في أنابيب منفصلة 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر لوسائل الإعلام في الهضم. للأعصاب الوركي، ختم المواد إلى 15-20 قطعة باستخدام مقص الربيع واحتضان ثم تعليق الأنسجة في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة).
3. تريتوراتي مرارا وتكرارا بتعليق خلية عن طريق ميليلتر 1,000 ماصة تلميح إلى أيوناتها ميكانيكيا أي أنسجة غير كامل الهضم.
   ملاحظة: إذا كان من الصعب الوقف تيتراتي، ثم قطع طرف الماصة مع مقص لخلق وضع نهاية غير حادة. احتضان تعليق الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة).
4. كرر تريتوريشن من خلال تلميح ماصة ميليلتر 1,000 واحتضانها لمزيد 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة).
5. إعداد المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع يدتا FCS ومم 1 10%)، وتخزين على الجليد. شطف ونقع على شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ مع حجم فتحات الشباك من 140 ميكرون مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 60 × 15 ملم طبق بيتري على الجليد.
   ملاحظة: ينبغي تجنب مرشحات النايلون الشاشة كما أنه يؤدي إلى خسارة كبيرة في إنتاج الخلايا المنواه.
6. مرارا وتكرارا تمرير المعلقات الأنسجة من خلال مرشح الشاشة 140 ميكرون، كما يقام على طبق بيتري، مع الملقط حادة، على الجليد. جمع تعليق خلية من طبق بيتري وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل جديدة المخزنة على الجليد.
7. دفع أي أنسجة غير كامل الهضم التي تظل في عامل التصفية من خلال طريق تريتوريشن المتكررة مع تلميح ماصة ميليلتر 1,000. شطف التصفية الشاشة مرتين مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وجمع تعليق الخلية الناتجة في طبق بتري الجمع مع تعليق خلية من الخطوة 3، 6.
   ملاحظة: إذا كان سيتوميتير تدفق المستخدمة حساسة للحطام، يمكن تمرير تعليق خلية من الخطوة 3، 7 من خلال عامل تصفية شاشة 70 ميكرومتر؛ ومع ذلك، وهذا قد يؤدي إلى خسارة في عائد الخلايا المنواه.
8. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.
9. ريسوسبيند بيليه الخلية في 150-350 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، اعتماداً على العدد من تلطيخ هي المطلوبة (150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت كل لوحة المصبوغة).

4-تلطيخ العصب الوركي والرسم مع الأجسام المضادة فلوريسسينتلي المسمى للتدفق الخلوي

1. نقل 100 ميليلتر للعصب الوركي أو تعليق خلية الرسم إلى الخامس-تتشكل أيضا في لوحة 96-جيدا على الجليد.
   ملاحظة: الخلايا الملطخة بمفرده ضرورية لجميع الأجسام المضادة المستخدمة أنها سوف توفر الضوابط اللازمة لإعداد قياس التدفق فيما يتعلق بالمكاسب الجهد (PMT) أنبوب ضوئي والتعويض، وكذلك فيما يتعلق بالمساعدة على تمييز محددة من الربط غير محددة. بسبب محدودية المواد المتاحة من العصب الوركي وبالاسعار، الدم الكريات البيضاء والضامة من PCL (خطوات 1.1-1.2) يمكن أن تستخدم الضوابط الملطخة بمفرده، وتلطيخ للذي ينبغي أن يجري بالتوازي مع تلطيخ من الوركي العصب وبالاسعار.
2. تجمع باقي الخلايا المعلقات (حوالي 50 ميليلتر كل عينة) من الأعصاب الوركي أو عينات الرسم، ليكون بمثابة عنصر تحكم أونستاينيد.
3. الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعكس اللوحة على بن وتطبيق حادة نفض الغبار من المعصم، واضغط برفق الجافة على مناشف ورقية.
4. لتلطيخ السطحية، ريسوسبيند كل من الكريات الخلية في 20 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأجسام المضادة للفائدة (CD45-A647، CD11b-بيركب/Cy5.5 و MHC Class الثاني-البيوتين) واحتضانها، محمية من الضوء، على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: تمييع جسم الأمثل (1) ينبغي أن تكون مصممة قبل استخدامها قبل تنفيذ سلسلة تمييع وفقا للشركة المصنعة معلومات المنتج؛ (2) ويمكن تخفيض ستينينجس الخاصة بعدم بالحضانة مع كتلة Fc في هذه الخطوة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ وايستب (3) مراقبة ستينينجس عموما غير مطلوبة عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مباشرة مترافق مع فلوروفوري و/أو عندما تنتج antigen(s) لمصلحة السكان متميزة.
5. إضافة 130 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل بئر والطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات خلية مرتين مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
   ملاحظة: إذا كان استخدام جسم مضاد أونكونجوجاتيد الأولية أو جسم الابتدائي مترافق إلى البيوتين، ثم يمكن إضافتها كاشف ثانوية مناسبة، مترافق فلوروفوري، في هذه المرحلة ويتم تكرار الخطوات 4.4-4.5. وفي حالة هذا البروتوكول، استخدمت streptavidin-PE/Cy7 أو ستريبتافيدين-بيركب للكشف عن MHC Class الثاني في تركيبة مع CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5، أو في تركيبة مع CD68--آسيا والمحيط الهادئ و F4/80-PE/Cy7، على التوالي.
6. للتثبيت، وبعد آخر خطوة الغسيل، ريسوسبيند الكريات الخلية في 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4). احتضان لوحة على الجليد لمدة 10 دقائق وثم الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات الخلية مرة واحدة مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
   تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة مثل القفازات والنظارات و ما إلى ذلك.
   ملاحظة: ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ومخزن محمية من الضوء، عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين. إذا كان مطلوباً لا تلطيخ داخل الخلايا، ثم الانتقال إلى الخطوة 4.11 بعد سينتريفوجينج اللوحة في ز 400 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
7. لتلوين داخل الخلايا، ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المنظفات buffer+0.5% نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء على 15 دقيقة الطرد المركزي اللوحة في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 150 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + المنظفات 0.5%. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية buffer+0.5% المنظفات التي تحتوي على الأجسام المضادة للفائدة (CD68-آسيا والمحيط الهادئ، CD206-PE) واحتضانها، محمية من الضوء، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. إضافة 130 ميليلتر من المنظفات buffer+0.5% نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل بئر والطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات خلية مرتين مع 150 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + المنظفات 0.5%.
   ملاحظة: إذا كان استخدام جسم مضاد أونكونجوجاتيد الأولية أو جسم الابتدائي مترافق إلى البيوتين، ثم كاشف ثانوية مناسبة، يضاف إلى فلوروفوري، يمكن إضافتها في هذه المرحلة، وتكرار الخطوات 4.9-4.10.
9. ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية + 0.5% المنظفات ومخزن، ومحمية من الضوء، عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين.
10. ريسوسبيند الكريات الخلية مع 150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + 0.5% المنظفات وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل DAPI واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3).
11. ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب مناسب مسمى نظام مراقبة الأصول الميدانية. تخزين في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، حتى جاهزة للتحليل.
    ملاحظة: بعد تعليق في برنامج تلفزيوني، الخلايا ينبغي تحليله في غضون ساعات، منذ DAPI سوف ننأى ببطء من الحمض النووي، مما يؤدي إلى خسارة في إشارة.

5-الإعداد للتدفق الخلوي وتشغيل عينات

1. ضمان أن سيتوميتير تدفق مجهز بأشعة الليزر المناسبة و/أو تصفية مجموعات قياس fluorophores المستخدمة لوصمة عار الخلايا. ويمكن تحديد هذا تحت التكوين الافتراضي سيتوميتير على النظام. في حالة هذا البروتوكول، حللت الخلايا باستخدام cytometer تدفق مجهزة بأشعة الليزر الثلاثة (405 نانومتر، 488 نانومتر، و 633 نانومتر) السماح للكشف عن ≤ 5 فلوروفوريس.
2. تحديد القنوات المناسبة للكشف عن فلوروفوريس للفائدة. يتم الكشف عن جميع إشارات الفلورية أفضل مع التضخيم اللوغاريتمي.
3. حدد معدل تدفق ملائم للعينات. هذه المعلمة يمكن أن تختلف تبعاً للنظام المتبع، وينبغي أن يحدد تجريبيا. وفي حالة هذا البروتوكول، استخدمت بمعدل تدفق ميد--إلى--مرحبا (35-60 ميليلتر/دقيقة) لمنع انسداد الإبرة.
4. حدد العدد الإجمالي للأحداث/الخلايا التي سيتم جمعها كل عينة. ينبغي أن يكون الحد الأدنى لعدد من الأحداث 1,000,000.
5. إنشاء التبعثر مؤامرات ضمن ورقة عمل عالمي للتعاون بين بلدان الجنوب-مقابل ألف منتدى التعاون الأمني، فضلا عن كل فلوروفوري من الفائدة مقابل FCS-ألف. إنشاء طريقة عرض إحصائية التي سيتم عرض العدد من الأحداث وشدة الفلورسنت يعني (MFI) ل fluorophores المحدد.
6. قم بتعيين الجهد قنوات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب-أ، مثل خلايا أصغر تناسب السفلي الأيسر 10% من مؤامرة مبعثر. تحديد خلفية الأسفار والأسفار عينة الحد الأدنى من الضوابط أونستاينيد من الأعصاب الوركي أو باﻷسعار. تحديد بوابة الأصل (P1) استناداً إلى مبعثر مؤامرة من DAPI فقط تلوين عناصر التحكم.
   ملاحظة: هذا ليس بوابة جمع، يعود في جزء منه، إلى الطبيعة غير المتجانسة للسكان DAPI + في السندات الإذنية.
7. استخدام مبعثر منتدى التعاون الأمني مؤامرات لكل من فلوروفوريس للفائدة، وضبط الفولتية بحيث تندرج الخلايا لعنصر التحكم أونستينيد الربع أقل من مؤامراتهم مبعثر كل منهما. ثم يتم إنشاء بوابات فوق هذه المنطقة لتحديد تلك الخلايا التي إيجابية بالنسبة لكل من كل العلامات/فلوروفوريس. ويؤكد وضع بوابة تشغيل عنصر التحكم الملطخة بمفرده (الخطوة 4، 1).
   ملاحظة: يمكن تنفيذها في هذه المرحلة تعويضاً عن تداخل أطياف الانبعاث أو تطبيق رجعي مع برمجيات التحليل المناسب.
8. بمجرد تم تعيين cytometer تدفق أعلى، كما هو موضح، يمكن تشغيل العينات.
9. بعد التشغيل، يمكن تجاهل عينة المواد المتبقية ويمكن تصدير الملفات FCS لمزيد من التحليل.

النتائج

وأعدت، وفقا للبروتوكول، من ستة صحية الفئران C57BL/6 تعليق خلية من كامل طول الوركي الأعصاب والرسم الرئيسية وتنقسم إلى ثلاثة مختبرين مساوية لتلطيخ. عداد تلطيخ مع DAPI، الذي بقع الحمض النووي، يسمح للكشف عن عدد السكان وحيد الخلية (الشكل 1A–ب، اللوحة العلوية). الغسيل DAPI، قبل تحليل التدفق الخلوي، انخفض إلى حد ما شدة الفلورسنت الأنقاض غير المنبسطة، مما يسمح لاختيار عدد السكان منفصلة خلال منتدى التعاون الأمني-محور الأحداث المنبسطة ...

المناقشة

الأعصاب الوركي تحتوي على نسبة كبيرة من الدهون، مثل نسبة الكولسترول في الدم، بسبب محتوى المايلين حول محاور عصبية. نظراً لتغيير الخصائص للدهون مع درجة الحرارة، يمكن الحصول على نتائج مختلفة عند درجات حرارة مختلفة. لضمان الحفاظ على الخلية، وكافة الخطوات في هذا البروتوكول بعد الهضم أجريت على الجليد. في حين ينصح باتساق من أجل إمكانية تكرار نتائج النتائج، قد يكون من الممكن زيادة الغلة قبل تنفيذ الخطوات 3.6 و 3.7 في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يهضم بما فيه الكفاية على الأعصاب في الخطوة 3، 8، قطع صغيرة من الأعصاب ستكون مرئية على ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
C57BL / 6 Mouse	Charles River	C57BL / 6NCrl
DMEM (+ 1 جم / لتر جلوكوز ، جلوتامين ، بيروفات)	31885023 الحرارية		مصدر هذه المادة ليس مهما
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp. ، الولايات المتحدة	LS004188
ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) I من البنكرياس البقري I	سيجما ألدريتش	DN25-1g
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	سيجما ألدريتش	E6758
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ،	Sigma-Aldrich	F4135
ضد CD11b-PerCP / Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1 / 70
الجسم المضاد ضد معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية ،	Biolegend	107603	استنساخ M5 / 114.15.2
الجسم المضاد ضد CD45-A647	Biolegend	107603	استنساخ الجسم المضاد 30-F11
ضد CD68-APC	Biolegend	137007	FA / 11
ضد CD206-PE	Biolegend	141706	استنساخ الجسم المضاد C068C2
ضد F4 / 80-PE / Cy7	Biolegend	123113	استنساخ BM8
Streptavidin-PE / Cy7	Biolegend	405206	يستخدم للكشف عن MHCII-biotin باستخدام CD45-A647 و CDllb-PerCP / Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	يستخدم للكشف عن MHCII-biotin مع CD68-APC و F4 / 80-PE / Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	خفف في PBS إلى 50x وتخزينها في 4 درجات ؛ C في الظلام
غربال تفكك الخلية - طقم طاحونة الأنسجة	Sigma-Aldrich	CD1
على شكل حرف V ، 96 لوحة بئر	Greiner / Sigma	M8185
5 مل أنبوب دائري القاع من البوليسترين ، 12 × 75 مم	BD Biosciences	352008
طبق بتري 60 × 15 مم	Greiner / Sigma	Z643084
BD LSR II مقياس التدفق الخلوي	BD Biosciences