مقالة منهجية

نموذج الماوس إشعال الناجمة عن بينتيلينيتيترازولي

DOI:

10.3791/56573

⸱

يونيو 12, 2018

 , 
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة لإشعال المواد الكيميائية مع بينتيلينيتيترازولي هذا البروتوكول ويقدم نموذجا ماوس من الصرع. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في التعرض للاستيلاء على الاستقراء والمرضية بعد نوبات الصرع في الفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينتيلينيتيترازولي (بتز) خصم مستقبلات GABA A. حقن داخل من بتز في حيوان يدفع مصادرة حادة، شديدة بجرعة عالية، بينما استخدمت حقن متسلسلة من جرعة سوبكونفولسيفي لتطوير مادة كيميائية إشعال، نموذج لصرع. يدفع حقن جرعة منخفضة وحيدة من بتز نوبة خفيفة دون تشنج. بيد المتكررة حقن جرعة منخفضة من بتز انخفاض عتبة تثير نوبة التشنجية. أخيرا، الحث المستمر الإدارة جرعة منخفضة من بتز الاستيلاء منشط بهلوانية شديدة. هذا الأسلوب بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للصرع، الذي يعرف بأنه أمراض مزمنة التي تتضمن نوبات متكررة. هذه المادة الكيميائية إشعال البروتوكول تسبب النوبات المتكررة في الحيوانات. مع هذا الأسلوب، قدرت التأثر بوساطة بتز المضبوطات أو درجة تفاقم نوبات الصرع. وأدت هذه المزايا لاستخدام هذا الأسلوب لفحص العقاقير المضادة للصرع والجينات المتعلقة بالصرع. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذا الأسلوب للتحقيق في الأضرار العصبية بعد نوبات الصرع لأن تظهر أيضا التغييرات النسيجي لوحظت في أدمغة مرضى الصرع في أدمغة الحيوانات اوقدت الكيميائية. وهكذا، هذا البروتوكول مفيد لسهولة إنتاج نماذج حيوانية للصرع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصرع هو اضطراب عصبي مزمنة التي تتسم بالنوبات المتكررة، ويؤثر على ما يقرب من 1 في المائة شعب. لا يمكن توضيح الآليات الكامنة من جيل ابيليبتوجينيسيس وضبطها في مرضى الصرع تماما في الدراسات السريرية. ولذلك، مطلوب نموذج حيوان مناسب لدراسة الصرع1.

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من نماذج حيوانية للصرع للتحقيق في علم وظائف الأعضاء الصرع وتحديد العقاقير المضادة للصرع2،3. بين هذه النماذج، تحريض الاستيلاء الدوائي طريقة شائعة تستخدم لتوليد نموذج حيوان للتحقيق في علم الأمراض الصرع4. هذا الأسلوب غير مكلفة وبسيطة. قطب كهربائي بوساطة إشعال أيضا طريقة شائعة استخدام، ولكن تكاليف هذا الإجراء أعلى، والأسلوب يتطلب المهارات الكهربائية والعمليات الجراحية للحث على مضبوطات المتكررة5.

التعريفي الدوائية مفيد أيضا لأنه يتم التحكم في توقيت وعدد المضبوطات بسهولة. كما تستخدم نماذج الماوس الوراثية التي يحمل مضبوطات عفوية في الدراسة للصرع. ومع ذلك، قد يكون التنبؤ متى وكيف في كثير من الأحيان المضبوطات تنشأ في هذه النماذج الوراثية المستحيل6. مطلوب نظام رصد مراقبة سلوك الفئران المعدلة وراثيا6الصرع.

حمض كينك وبيلوكاربيني وبينتيلينيتيترازولي (بتز) تستخدم على نطاق واسع كالمخدرات الذي يحفز الاستيلاء على7. حمض كينك مؤثر على مستقبلات الغلوتامات، و pilocarpine ينشط مستقبلات اتروبين. بتز حمض غاما أمينوبوتيريك (GABA)-خصم مستقبلات8. يمنع بتز وظيفة الاشتباكات العصبية المثبطة، مما يؤدي إلى زيادة نشاط الخلايا العصبية. هذه اللائحة يسبب النوبات المعممة في الحيوانات9. حقنه واحدة من حمض كينك وبيلوكاربيني يمكن أن يستحث مضبوطات الحادة، لا سيما مركز epilepticus (جنوب شرق)10،11 وكينك حمض-أو بيلوكاربيني-بوساطة سراج الدين يعزز مضبوطات عفوية والمتكررة المزمنة12 , 13-بينت تسجيلات اليكترونسيفالوجرافيك (EEG) وتحليل السلوك الالتزام بعفوية النوبات المتكررة بعد12،حقنه واحدة13شهر. حقنه واحدة لجرعة التشنجية من بتز يستحث أيضا الاستيلاء على حدة. ومع ذلك، المضبوطات عفوية المزمنة بعد حقنه واحدة من بتز صعبة لتعزيز. الإدارة المزمن من بتز مطلوب للحث على مضبوطات المتكررة14. في أي من الطريقتين، يتم توليد النوبات المتكررة قادرة على حمل علم أمراض أكثر مشابهة للصرع البشرية من جيل مضبوطات الحادة. في حالة بتز، يستحضر كل حقن من الاستيلاء، ويصبح أشد شدة الاستيلاء بطريقة تدريجية مع كل حقن. وأخيراً، يدفع حقنه بتز جرعة منخفضة وحيدة الاستيلاء منشط بهلوانية شديدة. في هذه المرحلة، يستحضر كل حقن مضبوطات الحادة. وباﻹضافة إلى ذلك، الكمون الاستيلاء والمدة أيضا تغيير على مدى الحقن. زمن الوصول للاستيلاء على منشط غالباً ما يصبح أقصر في المرحلة الأخيرة من إشعال15. وعلاوة على ذلك، تفاقم الاستيلاء يرافقه مدة حجز مطول16. التحقيق الآلية الجزيئية تنظيم شدة الاستيلاء، الكمون، ومدة مفيد لفحص العقاقير المضادة للصرع17،،من1819.

المضبوطات هي عادة الناجمة عن إدارة منهجية واحدة من بتز، والانتعاش سريع جداً، في غضون 30 دقيقة4،5. وهكذا، عدد المضبوطات يمكن التحكم أكثر في نموذج إشعال بتز. بيد أن رصد EEG أوضحت أن المسامير المعمم قد يعتبر ما يصل إلى 12 ساعة بعد وساطة بتز مصادرة20. ولذلك، ينبغي أن تظل الحيوانات يفضل أن يكون ذلك تحت المراقبة 24 ساعة بعد الاستيلاء على رمعيه أو منشط21 لتحليل أكثر دقة آليات إشعال.

إدارة العقاقير المضادة للصرع، مثل اثوسوكسيميدي، فالبرويت، الفينوباربيتال، فيجاباترين وريتيجابيني3، قبل أو بعد حقن بتز يخفف من تفاقم الاستيلاء على شدة3،22، 23. وبالمثل، أظهرت الفئران خروج المغلوب أن نقص الجينات متورطة في تفاقم مصادرة، مثل مصفوفة أية-924، 22 صندوق الأجيال القادمة25 ونيوريتين26، يحمل الاستيلاء على انخفاض حدة عقب حقنات متعددة بتز. وباﻹضافة إلى ذلك، مراقبة تغييرات نسيجية بعد نوبات الصرع ممكن مع هذا الأسلوب. في المرضى الذين يعانون من الصرع الفص الصدغي، هناك نموذجي تغييرات نسيجية في الدماغ، مثل الألياف المطحلب تنتشر الخلايا العصبية، أستروجليوسيس3027،28، الحبيبية الشاذ العصبية الهجرة29 الوفاة في قرن آمون31،32والتصلب هيبوكامبال33. ولوحظت تغييرات مماثلة في الحيوانات النموذجية الصرع. بين الأساليب المتاحة، تأجيج الكيميائية بتز بوساطة طريقة جيدة واستنساخه وغير مكلفة لإنتاج نموذج حيوان من الصرع. في طراز SE بيلوكاربيني بوساطة، الاستيلاء على التحكم صعب ويموت العديد من الفئران أو تفشل في وضع سراج الدين34. وفي المقابل، الوفيات وشدة الاستيلاء أكثر السيطرة عليها في نموذج بتز. بالإضافة إلى ذلك، بتز أقل تكلفة من حمض كينك، والمهارات في مجال جراحة الدماغ الماوس غير مطلوبة لإدارة المخدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق جميع الإجراءات التجريبية بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لطوكيو متروبوليتان معهد العلوم الطبية. بعد الولادة 8-ينصح الفئران عمرها 16 أسبوع. أي سلالة فطري مقبول للتجربة. الفئران C57BL/6 أكثر قدرة على مقاومة بتز، بينما الفئران ألبينو بالب/ج والسويسرية أكثر حساسية بتز. واستخدمت في هذه الدراسة C57BL/6. مشكلة عدم الحصانة بتز يعتمد أيضا على سن الماوس. بالمقارنة مع الفئران الأصغر سنا، الفئران الأكبر سنا أكثر مقاومة للحرارة إلى بتز35. يمكن أن يختلف عدد الحيوانات المستخدمة لهذا الأسلوب، ولكن مالا يقل عن 6-10 الحيوانات المطلوبة لكل حالة.

1-إعداد بتز

  1. حل 2 مغ/مل بتز العقيمة 0.9% (w/v) كلوريد الصوديوم. إعداد بتز اليوم من الاستخدام.

2-حقن بتز

  1. القيام بتجارب جميع بين 09:00 ص و 12:00 م (ظهرا).
  2. قياس وزن الجسم للحيوان.
  3. وضع الحيوان في دائرة مراقبة التعود.
  4. وخلال فترة التعود (3 دقائق)، حساب حجم الحل بتز لحقن استناداً إلى وزن جسم الحيوان وجرعة حقن سبق تحديدها.
    ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام 35 مغ/كغ بتز، مغ 0.875 من بتز مطلوب لماوس يزن 25 جرام (35 مغ/كغ × 0.025 كغ = 0.875 mg). ولذلك ينبغي أن يكون حقن ميكروليتر 437.5 حل بتز 2 مغ/مل (0.875 مغ/2 مغ/مل = 0.4375 مل). حقن جرعة بتز يعتمد على الماوس النمط الوراثي والسلالة. للفئران البرية من نوع C57BL/6، يوصي بجرعة 30-35 ملغ بتز/كغ من وزن الجسم في المحاكمة الأولى. حساسية بتز يعتمد على الماوس الضغط المستخدمة36،37. أن حقن جرعة يختلف باختلاف غرض التجربة.
  5. حقن بتز إينترابيريتونيلي بحقنه 1 مل المرفقة بإبرة قياس 27 في الربع الأيمن أو الأيسر من البطن للحيوان. تجنب الحقن في خط الوسط.
    1. تجنب تكرار الحقن في نفس الموضع.
  6. مراقبة سلوك الحيوانات لمدة 30 دقيقة بعد الإدارة بتز (الشكل 1A)، وتصنيف ونقاط السلوك الشاذ كما هو موضح أدناه. إذا كان ذلك ممكناً، الاحتفاظ بالحيوانات تحت الملاحظة 24 ساعة، أو على الأقل إضافية 6-10 ح بعد حقنه، خاصة عندما يصل إلى درجة خطورة مصادرة 3 أو أعلى.
    1. ملاحظة أي مضبوطات معتدل أو التغيرات السلوكية في الحيوانات بعد فترة 30 دقيقة الملاحظة. وهذا لفترة طويلة المراقبة قد تناول الفترة تأثير أهمية خاصة وكاملة من جرعة سوبكونفولسيفي من بتز الجيل من المضبوطات دون سابق استفزاز المزمن في الصرع.
    2. وباﻹضافة إلى ذلك، قياس مدة الاستيلاء على كل مصادرة الملاحظة كالتغييرات في مدة الاستيلاء تتصل بشدة الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، زمن الوصول إلى مصادرة الأولى بعد حقن بتز تدبيرا هاما آخر لجمع. رصد تواتر الاستيلاء، والمدة، والكمون أمر حاسم لأي دراسات ما بعد الاستيلاء الجزيئية.
  7. حقن بتز كل يوم (الشكل 1A). عدد الحقن يعتمد على هدف التجربة. فيما يلي الأمثلة التمثيلية.
    1. لتوليد الحيوانات اوقدت تماما، وبمجرد تجارب حيوان من الاستيلاء على النقطة 5 (منشط رمعي الاستيلاء)، الانتهاء من الحقن داخل الإدارات الثلاث الإضافية. وفي هذه الحالة، زيادة جرعة الحقن إذا لم زيادة درجة الاستيلاء لثلاث حكومات متتالية. يمكن أن يتلقى كل الحيوانات رقم مختلف وجرعة من حقن بتز.
    2. تحديد عدد وجرعة من حقن بتز في كل حالة لتقييم تعرض بتز، بما في ذلك تقييمات للأدوية المضادة الصرع ودراسات للنمط الظاهري للفئران المعدلة وراثيا. تعطي جميع الحيوانات بنفس عدد الحقن بتز؛ ويوصي بمجموعة من 8 إلى 12 الحقن. إذا مات حيوان، ينبغي الإشارة إلى نقاط الاستيلاء ك 6.
    3. تحديد جرعة الحقن اللازمة للحفاظ على ضبط ارتفاع نقاط (4 أو 5) لحقن 10 أو أكثر دراسة التغيرات التشريحية المرضية التي تحدث نوبات الصرع. في هذه الحالة، عدد الحقن الإجمالي يجب أن تتراوح من 25 إلى 30. إنقاص جرعة الحقن إذا كان الاستيلاء على نقاط يصل إلى 5. إذا انخفضت درجة الاستيلاء على 3 أو أقل، زيادة جرعة الحقن.

3-الاستيلاء على نقاط

  1. مراقبة في سلوك الحيوانات وتسجيل النقاط.
    1. تصنيف وتسجيل السلوكيات الصرع كالتالي38،39 (الشكل 1B):
      0: السلوك العادي، لا شذوذ.
      1: التثبيت، الكذب في البطن.
      2: رأس التقلصات الإيماء أو الوجه أو فوريليمب أو اللكتات.
      3: الهزات المستمرة التقلصات كامل الجسم، رمعيه، عقد ذيل تصنع.
      4: الضبط تربية، منشط، تسقط على جانبها.
      5: منشط رمعي الاستيلاء، تسقط على ظهرها، البرية التسرع والقفز.
      6: الموت.
  2. قم بتغيير المعايير السلوكية استناداً إلى رأسين نقاط40، تبعاً لظروف تجريبية.

4-الاستيلاء على ما بعد التحليل

  1. تحليل إيمونوهيستوباثولوجيكال
    1. تثبيت التروية
      1. إعداد
        1. حل 4% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.4). الحرارة الحل إلى ما يقارب 70 درجة مئوية بالإضافة إلى قطره من هيدروكسيد الصوديوم 1 متر (حوالي 1 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 1 لحل منهاج العمل 50 مل).
        2. إعداد المثلج 4% منهاج عمل بيجين والفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
        3. إقامة مضخة تمعجية، مع الأنبوب والإبرة. قم بتشغيل حوالي 20 مل مياه من خلال أنبوب لمسح بقايا. ثم، ضع نهاية الأنبوب مفتوح في برنامج تلفزيوني المثلج.
      2. نضح ترانسكارديال وإعداد للدماغ ثابت
        1. تخدير عميق الماوس مع الإيثانول isoflurane/50% 50% في جرة صغيرة.
        2. تبقى الماوس في وضع ضعيف بتعلق نصائح الأمامية وهيندليمبس.
        3. قطع خط الوسط البطني من البطن وكشف الحجاب الحاجز.
        4. قطع الحجاب الحاجز على طول الهامش الساحلي. ثم قطع الجانبين الأفقي من أضلاعه والجسم. قرصه عملية الرهابه بالملقط تأمين وايفرت القفص الصدري. متمسكة بموقفها عملية الرهابه التي تعلق عليه بإبرة أو معسر فإنه مع الملقط. كشف القلب.
        5. أدخل الإبرة في البطين الأيسر وقطع في الاذين الأيمن باستخدام مقص. كن على علم لا لدفع الإبرة بعيداً جداً في القلب، كما أنه يمكن بيرس الجدران داخلية.
        6. بدء تدفق مستمر لبرنامج تلفزيوني المثلج من خلال الإبرة لتغسل الدم (حوالي 15-20 مل/دقيقة).
        7. عندما تم مسح الدم من الجسم، تحريك الأنبوبة إلى حل بارافورمالدهيد 4% (حوالي 60 مل) دون إضافة فقاعات. ثم قم بإيقاف في التروية.
        8. قص الرقبة الخلفي والعمود الفقري وتقشر الجلد الرأس والجزء الظهرية الجمجمة مع تشريح المقص.
        9. قطع عظم بريماكسيلاري بين مدارات العين وإزالة الجزء الظهرية للجمجمة.
        10. خلق فجوة بين الدماغ والعظام جوجال من الجانب الخلفي وقطع الأعصاب تريجيمينال و chiasm البصرية تحت الدماغ. بعناية إزالة الدماغ ووضعه في قنينة تحتوي على 4% منهاج عمل بيجين. بعد إصلاح الدماغ في 4 درجات مئوية عن ح 12-16.
    2. إعداد شريحة الدماغ
      1. نقل الدماغ ثابت إلى 20% السكروز/برنامج تلفزيوني حتى الدماغ المصارف في حل للسماح كريوبروتيكتيون.
      2. قص الدماغ الثابتة استناداً إلى اتجاه الشريحة المطلوبة والجزء المطلوب من الدماغ.
      3. تعيين كريوميكروتومي. تعيين بليد في الموقف والحفاظ على مرحلة مبضع عند درجة حرارة تقل عن-20 درجة مئوية.
      4. مكان في الدماغ قبل قطع على المسرح ومعطف الدماغ مع السكروز 20%/برنامج تلفزيوني. حل السكروز/برنامج تلفزيوني ستجمد تدريجيا، تغطي الدماغ في المرحلة، حتى الدماغ تماما مضمن في السكروز 20% مجمدة/برنامج تلفزيوني.
      5. شريحة الدماغ (30 ميكرون سمك) من انزلاق شفرة عن طريق الأنسجة. نقل الشرائح في برنامج تلفزيوني والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.
    3. إيمونوهيستوتشيميستري نيون
      1. تغسل شرائح اللازمة في 0.1% تريتون العاشر-100/برنامج تلفزيوني (ببست) لمدة 10 دقائق، 3 مرات في درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. كتلة الشرائح التي تفرخ لهم في ببست مع 2% الماعز المصل أو 5% البقري ألبومين المصل (BSA) ح 1-2 في الرايت
      3. احتضان الشرائح في حلاً جسم مع تركيز مناسب من جسم الأولية في ببست مع 2% الماعز المصل أو 5% جيش صرب البوسنة أوفيرنايتس 1 إلى 7 في 4 درجات مئوية.
      4. تغسل الشرائح في ببست لمدة 10 دقائق، 3 مرات في الرايت
      5. احتضان الشرائح في حل جسم ثانوي مع تركيز مناسب لجسم الثانوية في ببست ح 1-2 في الرايت، محمية بالضوء.
      6. تحميل الشرائح على الشرائح الزجاجية وتغطية مع تصاعد المتوسطة وتغطية الزجاج.
      7. مراقبة الشرائح مع الفحص المجهري الأسفار.
  2. 3-دائرة الاختبار
    1. إعداد
      1. إعداد على الأقل 2 2--الفئران 129/Sv عمره 6 أشهر من نفس الجنس كالفئران هذا الموضوع أن يكون الماوس "غريب". روض جميع الفئران في القفص قبل التحليل. لكل دورة تدريبية، ضع الماوس في القفص واترك الماوس لمدة 15 دقيقة.
      2. قبل كل مرحلة التعود مع الماوس هذا الموضوع، بتنظيف الجهاز برمته وكل الأقفاص بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      3. وضع الأقفاص الفارغة في الدوائر الجانبية على الجهاز 3-الدائرة وفتح الأبواب بين الدوائر.
      4. روض الماوس الموضوع، ضع ماوس موضوع في قاعة مركز والسماح للماوس للتنقل بحرية في جميع أنحاء الجهاز حتى الماوس وحقق كلا أقفاص، بالإضافة إلى القيام حيوانات موضوع الحد أدنى 5 إضافية قد تكون خوفاً من القفص لا التحقيق في القفص لمدة 20 دقيقة، ولا ينبغي أن تستخدم لهذا التحليل. تجنب القفص مثل هذه الحيوانات ونادراً ما تقترب من القفص.
      5. بعد انتقال الحيوان في قاعة المركز، إغلاق الأبواب وترك الماوس تتحرك بحرية في قاعة مركز لمدة 5 دقائق. وخلال هذه الفترة، وضع واحد من الفئران 129/Sv في قفص روض إلى القفص.
    2. تحليل بالمجتمع
      1. القيام بهذا التحليل مباشرة بعد فترة التعود الماوس هذا الموضوع.
      2. ضع القفص الذي يحتوي على ماوس 129/Sv، يطلق عليه "القفص غريب 1"، في واحدة من جانب الدوائر ومكان القفص فارغاً، يطلق عليه "القفص الكائن"، في قاعة جانبية أخرى.
      3. فتح الباب، ورصد سلوك الماوس هذا الموضوع.
      4. السماح لهذا الموضوع الماوس للتحرك بحرية لمدة 10 دقائق، وسجل المعلمات السلوكية التالية. إذا كان الماوس الموضوع يخاف من الماوس في القفص 1 غريب، كما هو مبين بالماوس تجنب القفص 1 غريب والمتبقية في الزاوية لإحدى الدوائر، ينبغي عدم استخدام الحيوان للتحليل.
        أ) الوقت المستغرق في كل دائرة، والدائرة 1 غريب، الدائرة الكائن، ومركز الدائرة.
        ب) الوقت المستغرق التحقيق في كل قفص والقفص 1 غريب والقفص الكائن. (الماوس تصنف على أنها للالتجلد بالماوس أو قفص أو التحقيق في القفص إذا هو استنشاق الماوس)
        ج) عدد المداخل في كل دائرة (اختياري)
        د) سافر مسافة المجموع (اختياري)
      5. بعد تحريك الماوس في قاعة مركز، قم بإغلاق الأبواب.
    3. التحليل الاجتماعي والجدة
      1. القيام بهذا التحليل بعد التحليل بالمجتمع مباشرة.
      2. مسح كلا أقفاص مع الإيثانول 70%.
      3. مكان آخر 129/Sv الماوس في أحد الأقفاص، يطلق عليه "قفص غريب 2" والقفص مكان 2 غريب في إحدى الدوائر. ضع الماوس 1 غريب في قفص آخر، يسمى "القفص غريب 1"، ووضع القفص 1 شخص غريب في غرفة أخرى.
      4. فتح الباب، ورصد سلوك الماوس هذا الموضوع.
      5. السماح لهذا الموضوع الماوس للتحرك بحرية لمدة 10 دقائق، وقياس نفس المعلمات السلوكية ووصف للتحليل بالمجتمع.
        ملاحظة: ينبغي اختيار الماوس غريب 1 و 2 غريب عشوائياً. وينبغي تحديد الدائرة 1 غريب والدائرة الكائن، فضلا عن الدائرة 1 غريب والدائرة 2 غريب عشوائياً.
  3. التمييز الخوف السياقية
    1. تكييف
      1. قبل كل محاكمة تكييف، تنظيف الجهاز التجريبي بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      2. ضع ماوس في جهاز تكييف مع الظروف المحددة (شكل الجهاز لون الجدار، الكلمة، ورائحة، والإضاءة ومواد حجم الضوضاء الخلفية ينبغي أن تحدد مسبقاً). على سبيل المثال، جهاز تكييف، استخدمت هنا كان جهاز مربعة مع الجدران شبكي واضحة وطابق شبكة معدنية، رائحة الإيثانول، وسطوع لوكس 100 والضوضاء البيضاء خلفية 65-dB.
      3. شرط الماوس بصدمة سيرا على الأقدام مع توقيت شبه عشوائي للصدمات الكهربائية 0.1-اماه 2 s x 3 مرات على مدى 5 دقائق.
      4. العودة الماوس إلى القفص المنزل بعد تكييف.
    2. تقييم الذاكرة
      1. قبل كل تقييم، بتنظيف الجهاز التجريبي بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      2. وفي اليوم التالي تكييف التالي، ضع الماوس في الجهاز نفسه كحالة الصدمة وقياس الوقت بالتجميد على مدى 5 دقائق.
      3. في وقت لاحق في نفس اليوم، ضع الماوس في جهاز رواية وقياس الوقت تجميد أثناء إجراء تقييم 5-دقيقة. تم استخدام جهاز ثلاثي مع الجدران البيضاء شبكي، والكلمة لوحة، لا رائحة، السطوع لوكس 30 والضوضاء البيضاء 70-dB هنا.
      4. مقارنة وقت التجميد بين نفس الشرط وشرط الرواية. سوف تجمد الفئران مع قدرة ذاكرة عادي أكثر في نفس الحالة مما في حالة الرواية. التجميد جمود المعرفة من الحيوان لأكثر من 2 ثانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقن متكررة من بتز الحث على زيادة في شدة الاستيلاء. ستة C57BL/6 الفئران تعامل مع بتز، والفئران 6 آخر تعامل مع المالحة كمجموعة مراقبة. الجرعة بتز 35 مغ/كغ، وكانت تدار من حقن 10. زادت درجة الاستيلاء تدريجيا مع حقن بتز، بينما كانت أثارت لا مضبوطات أو سلوكيات غير طبيعية قبل الحقن المالحة (الشكل 2). وأظهرت ANOVA متبوعاً باختبار بونفيروني فرق كبير بين المجموعة تعامل بتز وفريق المعالجة بالمياه المالحة.

المص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكول متاحة على نطاق واسع لإنشاء نموذج الحيوان الدوائي للصرع. بوساطة بتز إشعال الكيميائية لها تاريخ طويل وهو نموذج مقبولة عموما لدراسة باثولوجيا التشريح المرضى والخلوي للصرع41. نموذج إشعال الكيميائية من الصرع وقد استعرضت سابقا سوزداك ويانسن، 199542. التعريفي مصادرة الدوائية، لا سيما مع بتز، طريقة سهلة وبسيطة تستحضر مضبوطات الحادة. التغييرات في حقن جرعة ترتبط بشدة الاستيلاء. وبالتالي، تحديد الجرعة المناسبة عبر عدة محاكمات بتغيير الجرعة بتز ودراسة السلوك الناتج م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيده هذا العمل جزئيا أرقام المنح JSPS كاكينهي 24700349، 24659093، 25293239، JP18H02536، و 17 ك 07086، أرقام المنح يأمرون كاكينهي 25110737 و 23110525، JP18ek0109311 عدد المنح أوسطي، ومؤسسة البحوث الطبية سينشين واليابان مؤسسة أبحاث الصرع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PentylenetetrazoleSigma-AldrichP6500
كلوريد الصوديومMANAC7647-14-5
ماوسCLEA JapanC57Bl / 6NJcl ، بعد الولادة 8 أسابيع ،
حقنة ذكور (1 مل)TerumoSS-01T
(27 جم × 3/4 بوصة) (0.40 × 19 مم)وزن
MettlerPE2000هذا المنتج هو منتج متوقف. يعادل تقريبا FX-2000i مع FXi-12-JA من A& شركة د.
بارافورمالديهايدسيجما-ألدريتشP6148
هيدروكسيد الصوديومناكالاي تيسك31511-05
مضخة بريستاتيكيATTOSJ1211
السكروزناكالاي تيسك30404-45
ميكروتومياماتوREM-700هذا العنصر هو منتج متوقف. يعادل تقريبا REM-710
Microtome bladeFeatherS35
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
أنظمة الأجسام المضادة المضادة للسينابتوبورين102 002
متشابكمضادة للأجسام المضادة ل ZnT3197 002
مضاد للكورتينالمزدوج سانتاكروز sc-8066هذا العنصر هو منتج متوقف. لم نختبر منتجا مكافئا (SC-271390).
جهاز اختبار تمييز الخوف السياقيأوهارا
جهاز اختبار ثلاثي الغرفموروماتشي
إبرة مقياس Terumo NN-2719S أنظمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii(2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657(2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43(2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PTZ

مقالات ذات صلة