مقالة منهجية

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

DOI:

10.3791/56583

⸱

ديسمبر 11, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الوقت--وفعالة من حيث التكلفة في المختبر بروتوكول تحقق آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، وحاجة طبية العالية التي لم تلب في إدارة السرطان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال العقدين الماضيين شهدت تحولاً من العقاقير السامة للخلايا للعلاج المستهدفة في الأورام السرطانية. على الرغم من أن العوامل العلاجية المستهدفة وأظهرت الفعالية السريرية أكثر إثارة للإعجاب، والآثار الضارة مصغر من العلاجات التقليدية، أصبحت المقاومة للعقاقير إلى القيد الرئيسي لفوائدها. تم تطوير عدة نماذج الإكلينيكية في المختبر/المجراة في المقاومة المكتسبة لوكلاء المستهدفة في الممارسة السريرية أساسا باستخدام استراتيجيتين: التلاعب ط) الوراثية للنمذجة الوراثية المقاومة المكتسبة، والثاني) في المختبر/ المجراة في اختيار النماذج مقاومة. في هذا العمل، فإننا نقترح إطارا موحدا، للتحقيق في الآليات الأساسية المسؤولة عن المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم لوصف إسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع. هذه المرة-وفعالة من حيث التكلفة نهج بسيط قابلاً للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى المستهدفة في هيستوتيبيس ورم مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متابعة الاكتشافات الهامة في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، قد وضعت عددا من جزيئات السرطان تجميعي رواية لاستهداف مسارات إشارات النمطان في طائفة واسعة من أنواع الأورام بشكل انتقائي. على وجه الخصوص، المركبات الكيميائية الاصطناعية هي فئتين من العوامل العلاجية المستهدفة مع خصائص فريدة من نوعها في علم الأورام، والمعروف مونوكلونل المؤتلف، حققت نجاحات السريرية والرعاية سرطان غيرت جذريا في العقود الأخيرة1،،من23.

ومع ذلك، وضعت غالبية مرضى السرطان استجابتها الأولية مثيرة للإعجاب للعلاج، وعلى الرغم من مقاومة الأدوية لجميع العوامل العلاجية المستهدفة، كل من الأجسام المضادة ومثبطات كيناز. نتيجة لذلك، المقاومة للعقاقير، العقبة الرئيسية للأدوية المضادة للسرطان الكلاسيكية4، لا يزال يشكل تحديا كبيرا للناشئة العلاجات المستهدفة5،6.

قد تكون مقاومة للعلاج المستهدفة الجوهرية (أيالابتدائية) أو مكتسبة (أي، الثانوية). يصف المقاومة المتأصلة حيثياته عدم الاستجابة للعلاج، بينما المقاومة الثانوي يحدث بعد فترة من استجابة للمخدرات العلاج7. بسبب تفشي أفواج صغيرة من الخلايا السرطانية داخل الجزء الأكبر الورم بدائية أو تقع في منافذ التشريحية خفي القاصي والعارضة تصل إلى 90% مقاومة لواحد أو أكثر يستهدف العوامل العلاجية. الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مقاومة للعلاج المستهدفة أساسا نتيجة لطفرات الجينات المستهدفة وتفعيل مسارات الإشارات الأخرى الموالية البقاء على قيد الحياة، التفاهم الذي لا يزال بعيداً عن كامل8زائدة عن الحاجة.

واقترحنا في هذا العمل، نهجاً الوقت--وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في المختبر آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم للأدوية إلى وصف لإسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع، أداة حاسمة المستخدمة للاختبار والتحقق من صحة فرضيات العمل. على وجه الخصوص، استخدمت نهجنا للتحقيق، في الإصابة بسرطان المعدة، آليات المقاومة تراستوزوماب (مثلاً، هيرسيبتين)، جسم [مونوكلونل] أنسنة استهداف المجال خارج الخلية ل بروتين HER29. تراستوزوماب + العلاج الكيميائي مقبول على نطاق واسع كعلاج الخط الأول القياسية لسرطان الثدي المنتشر إيجابية HER2. بفضل الدراسات السريرية الحديثة تبين أن مكافحة-HER2 العلاجات لها نشاط كبير في على حد سواء في المختبر و في فيفو سرطان المعدة إيجابية HER2 نماذج10،11، كانت العقاقير الجزيئية استهداف HER2 درس على نطاق واسع في التجارب السريرية، التي لا تزال جارية، في المرضى الذين يعانون من السرطان المعدي12،13،،من1415.

وأكدت هذه الدراسات ارتفاع عدد المرضى التي تواجه مقاومة تراستوزوماب16، على نحو مماثل لما يتم ملاحظته لمثبطات العلاجية المستهدفة الأخرى. على وجه الخصوص، كان معدل الاستجابة من تراستوزوماب 47 في المائة، ومتوسط بقاء الشاملة للمرضى على العلاج الكيميائي + تراستوزوماب أطول من المرضى على العلاج الكيميائي وحدها172.7 شهرا فقط. هذا يشير إلى أن المقاومة تراستوزوماب الابتدائي منتشر، لكن المقاومة تراستوزوماب الثانوي أمر لا مفر منه. لهذا السبب، هناك حاجة ملحة توضيح الآليات التي تسبب مقاومة العلاج المستهدفة HER2 في الإصابة بسرطان المعدة، وحتى أكثر صعوبة نظراً لعدم تجانس الوراثية داخل مداواة هذا نيوبلسا18.

وبالإضافة إلى ذلك، أثبتت آليات المقاومة إلى تراستوزوماب في سرطان المعدة صعبة أن يفسر، جزئيا بسبب صعوبة الحصول على نماذج موثوقة السريرية الممثل لهذا الشرط. أوشيما وآخرون عن أسلوب انتقاء في فيفو من خطوط الخلايا تراستوزوماب مقاومة سرطان المعدة، تتكون ثقافة المتكررة خبيث البريتوني الصغيرة المتبقية بعد العلاج مع تراستوزوماب19. ومع ذلك، ساهمت الحاجة من ضميمة وخبرات محددة في التعامل مع الحيوانات، وموافقة "لجنة الأخلاقيات الحيوان" يجعلها أسلوب استهلاكاً لوقت وتكلفة. النهج الذي يصف لنا في هذا العمل بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى في ورم مختلفة هيستوتيبيس20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: عدلت هذا البروتوكول لتحليل الآليات الكامنة وراء المقاومة المكتسبة إلى تراستوزوماب هير المصابات بسرطان المعدة خلية خطوط على وجه التحديد. وترد في الجدول للموادجميع الصكوك المختبرية اللازمة.

1-جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المستهدف

ملاحظة: هذا هو أكثر المسائل حساسية وصعوبة في توحيد خطوة في البروتوكول نظراً إلى أن خطوط الخلايا المختلفة قد يحمل حساسيات مختلفة للمانع العلاجية المستهدفة بشكل مستقل من تركزها الورم هيستوتيبي أو المخدرات المستخدمة.

  1. الثقافة NCI-N87 الخلية خط في المتوسط ربمي تستكمل مع مصل العجل الجنين (10 في المائة) والجلوتامين (مم 2، 1%)، كأحادي الطبقة عند 37 درجة مئوية، والبذور على 25 سم2 قوارير الثقافة.
  2. إضافة إلى متوسط الثقافة في كل قارورة 10 ميكروغرام/مل من تراستوزوماب كجرعة البداية. تعرض الخلايا لجرعة البداية حتى أنهم استئناف النمو.
    ملاحظة: يجب أن تكون بداية جرعة مثبط العلاج المستهدفة أقل بعشرة إضعاف من تركيز الذروة في البلازما. هو تركيز البلازما الذروة أعلى مستوى لتركيز المخدرات اكتشفت في دم المريض عادة بعد عدة جرعات من العلاج القياسي. ويمكن استرجاع هذه القيمة من دراسات بشأن الدوائية.
  3. رصد نمو الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد تريبان الأزرق؛ عندما يتم استئناف نمو الخلايا (عادة بعد فترة من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع)، تعرض الخلايا إلى جرعة أعلى إذ تركز تراستوزوماب.
  4. تعرض الخلايا إلى جرعة تراستوزوماب (من 100 ميكروغرام/مل إلى 400 ميكروغرام/مل) تتزايد تدريجيا حتى تبقى الخلايا المتزايد (بعد حوالي 2 أسابيع) على الرغم من وجود تركيز عالية من المخدرات (على الأقل 2.5-4-fold أعلى من ذروة البلازما).
  5. القيام فحص كلونوجينيك لتقييم مستوى المقاومة للعلاج المستهدفة عند كل تغيير في تركيز مثبط العلاج المستهدف في الأجلين المتوسط والثقافة، وتعريف الفهرس50 IC المقاومة النسبية (RR IC50) على النحو التالي.
    1. بذور الخلايا 500 في 24 الثقافة المتعددة لوحات.
      ملاحظة: يجب إعداد الآبار 5 لكل مجموعة الشرط.
    2. يعرض الخلايا للعلاج بهدف زيادة المانع (تراستوزوماب) التركيزات من 100 ميكروغرام/مل ما يصل إلى 400 ميكروغرام/مل.
    3. احتضان الخلايا في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما.
    4. وبعد الحضانة، إصلاح ووصمة عار عينات كما يلي.
      1. إزالة الخلايا المتوسطة والشطف مع برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل. إزالة برنامج تلفزيوني x 1 وإضافة 2-3 مل من محلول التثبيت (حمض الخليك: الميثانول، 1:7، (المجلد/المجلد)). إزالة تثبيت الحل وإضافة الحل البنفسجي كريستال 0.5%. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2
      2. إزالة الحل البنفسجي كريستال بعناية عن طريق يسفط مع ماصة وتزج لوحات في مياه الحنفية شطف أي مخلفات الحل البنفسجي كريستال. أيردري في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 يوما.
    5. عد مستعمرات الخلايا أكثر من 50 باستخدام مجهر مقلوب (4 X التكبير).
      ملاحظة: تحتاج اثنين من المراقبين المستقلين لهذا.
    6. حساب RR IC50 كالنسبة بين القيمة50 IC للخلايا المستهدفة-العلاج-مقاومة سوبكلون والقيمة للخلايا الأصلية/ساذجة.

2. بروتوكول التحقق من صحة للمرشح الذي استهدف العلاج بالجينات المقاومة (R-جين)

ملاحظة: بعد أن وصف التعبير الجيني، التواقيع المقترنة بالمقاومة المكتسبة للعلاج المستهدف وأي الجينات المرشحة كما سيتم التحقيق في برنامج التشغيل للمقاومة من خلال: أ) RT-PCR، وب) الغربية لطخة تحليل.

  1. RT-PCR الوقت الحقيقي
    1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خطوط الخلايا باستخدام خليط ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم حمض جوانيدينيوم (انظر الجدول للمواد).
    2. إجراء النسخ العكسي (RT) ردود فعل استخدام كبسولة تفجير هيكسامير عشوائي وتعيين cycler الحرارية كما يلي: فتيلة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الرايت في 46 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والمنظمة RT عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. استخدام 400 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لفعل 20 ميليلتر. إعداد الخليط رد فعل للعينة على النحو التالي: 7 ميليلتر رناسي مجاناً ح2س، 2 ميليلتر جالحمض النووي (10 نانوغرام/ميليلتر)، 1 ميليلتر 20 x الفلورسنت المسمى مسبار محددة الهدف، و 10 ميليلتر 2 × مزيج يحتوي على المخزن المؤقت، دنتبس وبوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد).
    4. إضافة 20 ميليلتر من خليط رد فعل لكل لوح جيدا وتشغيل البرنامج التالي: عقد المرحلة عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (المرحلة 1)؛ ثم 40 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية وعند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  2. لطخة غربية
    1. استرداد تعليق الخلية بإضافة 2 مل من محلول التربسين/يدتا 0.05% والسماح 2-3 دقيقة التربسين للعمل.
    2. إضافة 2 مجلدات متوسطة الحجم تحتوي على 10% الجنين البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين) والطرد المركزي في 1,200 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل طافية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    3. الطرد المركزي في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية مع المخزن المؤقت لتحلل واحتضان في الروك عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. كمية تحلل المخزن المؤقت يعتمد على عدد الخلايا(مثلاً 100 ميليلتر للخلايا6 1 x 10)؛ تأكد من إعداد المخزن المؤقت لتحلل جديدة في كل مرة. 1 مل من تحلل إعداد المخزن المؤقت (إجازة في الجليد): استخدام ميليلتر 975 م-كل المخزن المؤقت ليستي الثدييات ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز 15 ميليلتر 10 ميليلتر 100 ميكرومتر مثبطات بمسف.
    4. استرداد البروتين طافية بالطرد المركزي ليساتي الخلية في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. تحديد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة بروتين اتفاق التعاون الأساسي.
    6. إضافة 4 × لايمملي عينة المخزن المؤقت لعينات البروتين (على الأقل 20-30 ميكروغرام من البروتين) والحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    7. استخدام المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة 4-20% وتحميل 20-30 ميكروغرام من البروتين لايملي الحل و 5-10 ميليلتر من البروتين القياسية كل عينة.
    8. ملء الطوق لطخة غربية مع المخزن المؤقت 1 x/SDS تريس/جليسيني وتشغيل جل في 110 V لمدة 30-60 دقيقة (عندما يتوقف الوقت تحقق من أن الصبغة قد وصلت إلى نهاية الهلام، إلا تشغيل لبضع دقائق إضافية)
    9. اليكتروبلوت لنقل البروتينات إلى غشاء PVDF (انظر الجدول للمواد) باستخدام نظام شبه جاف.
    10. كتلة الغشاء مغطس في الحل المناسبة من البروتين (اللبن/جيش صرب البوسنة 5 ٪) على شاكر في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    11. جعل حلاً 1: 400 مع جسم الأساسي مكافحة IQGAP1 في حل حليب 5 في المائة (انظر الجدول للمواد).
    12. وضع الغشاء في حل جسم الأولية على شاكر في غرفة باردة بين عشية وضحاها.
    13. في اليوم التالي، تجاهل حل جسم ونقع في الحل 1 x T-تبس (1 × تي-تبس: x 1 أضاف "تريس المالحة المخزن المؤقت" قبل Tween20 0.1%) على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
    14. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
    15. جعل حلاً جسم ماوس ثانوي المضيفين بإضافة جسم الغربية القياسية لطخة الكشف (انظر الجدول للمواد) ومكان الغشاء على شاكر؛ تترك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    16. تجاهل حل جسم ونقع في تي-تبس 1 x الحل على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
    17. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
    18. نقع غشاء لمدة 5 دقائق في حل تشيميلومينيسسينت، وصورة الغشاء في تصوير تشيميلومينيسسينسي.

3-استعادة حساسية المانع المستهدفة-العلاج بمرشح R-جين تدق إلى أسفل

  1. إعداد الخلية
    1. إعداد تعليق خلية واحدة من تريبسينيزيشن. أداء تعداء في اليوم الذي يتم مطلي بالخلايا.
      1. أغسل NCI-N87 الخلايا مع برنامج تلفزيوني، واحتضان في 37 درجة مئوية مع حل التربسين/يدتا 0.05% 5-10 دقيقة 2 إضافة حجم ربمي المتوسطة تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين).
      2. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير استخدام التلوين تريبان الأزرق. بذور 2.5 × 105 خلايا (التقاء 60 ٪) على قارورة2 سم T25 لكل شرط.
        ملاحظة: يتحدد العدد المناسب من الخلايا لبذر الوقت مضاعفة خط الخلية ومدة التجربة. ويهدف إلى تحقيق الجينات المستهدفة أسفل تدق لمدة التجربة بأكملها. تسعة T25 سم2 قوارير تعتبر مثالية لظروف تعداء والتحليل كلونوجينيك (3 قوارير لعناصر التحكم، 3 قوارير لعناصر سلبية تعداء، 3 قوارير للجينات المستهدفة تعداء).
  2. عكس تعداء
    1. إعداد الجينات المستهدفة والسلبية تحكم تعداء ميكس لكل قارورة2 سم T25 كما يلي.
      1. تمييع ميليلتر 12.5 كل استهداف الجين siRNA النوكليوتيد أو "المراقبة السلبية" siRNA النوكليوتيد في المتوسط تعداء الأساسية الحد الأدنى (نسبة 01:55؛ انظر الجدول للمواد).
      2. إضافة كاشف تعداء الحويصلية الأيوني (نسبة 1:1 مع استهداف الجين النوكليوتيد siRNA؛ انظر الجدول للمواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: الحجم الإجمالي لهذا المزيج تعداء هو 700 ميليلتر.
      3. إضافة 700 ميليلتر من مزيج تعداء لكل قارورة2 سم T25. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
    2. تحقق من الجينات تدق لأسفل RT-PCR وتحليل لطخة غربية. إعادة التحقق من أثر المفترضة R-جين تدق لأسفل على استعادة حساسية لوكيل العلاجية المستهدفة من خلال تجارب تشكيل مستعمرة (كرر الخطوة 1، 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يبين الإطار الداخلي التجريبية. ثلاثة سرطان المعدة خلية خطوط التعبير عن مستوى عال من HER2 وحساسة إلى تراستوزوماب (IC50 < مستوى البلازما الذروة من المخدرات، الشكل 2 ألف، الرسم البياني الأيسر) كانت تزرع في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على عامل العلاجية المستهدفة. 10 إضعاف أقل جرعة من تركيز البلازما الذروة تراستوزوماب (10 ميكروغرام/مل) تم تعيين كجرعة بداية، وزادت إلى 400 ميكروغرام/مل تدريجيا على مدى فترة من 8-12 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما شخصية واستهدفت العلاجات أثارت الحماس المتزايد، تواجه هذه العلاجات ما يسمى 'الذكية' العقبة الرئيسية نفسها كالمخدرات العلاج الكيميائي التقليدي، أي، واكتساب المقاومة للأدوية سريعة ولا يمكن التنبؤ بها. لتحسين نتائج العلاج المستهدفة، يجب أن تحل مشاكل مقاومة العقاقير من خلال فهم أفضل للآليات التي تسبب لهم. هنا، وقد عرضنا منهجية متاحة على نطاق واسع في المختبر للتحقيق في آليات المقاومة المكتسبة على أدوية العلاج المستهدف في نماذج خط خلية سرطان.

جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المسته...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر الدكتور فيرونيكا زانوني لتحرير المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف TrizolInvitrogen15596026TRIzol Reagent هو كاشف لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة أو عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين في نفس الوقت من مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KITBio-Rad1708891مجموعة توليف cDNA iScript هي مجموعة توليف cDNA للحبلا الأول حساسة وسهلة الاستخدام لتحليل التعبير الجيني باستخدام qPCR في الوقت الفعلي.
مقايسة التعبير الجيني TaqManتتكون فحوصات Life Technologies4331182Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays من زوج من بادئات PCR غير المسماة ومسبار TaqMan مع ملصق صبغة Applied Biosystems FAM أو VIC على الطرف 5 ورابط الأخدود الصغير (MGB) والتبريد غير الفلوري (NFQ) في الطرف 3.
كاشف استخراج بروتين الثدييات M-PERThermo Scientific78501تصميم كاشف استخراج بروتين الثدييات Thermo Scientific M-PER لتوفير استخلاص البروتين الكلي القابل للذوبان عالي الكفاءة من خلايا الثدييات المستزرعة.
كوكتيل هلت البروتياز والفوسفاتيز (100X)Thermo Scientific78440Thermo Scientific Halt ومثبط الفوسفاتيز (100X) راحة محلول واحد مع حماية كاملة لعينة البروتين لمحللات الخلايا والأنسجة.
مجموعة فحص البروتين بيرس BCAالحرارية العلمية23225مجموعة فحص البروتين Thermo Scientific Pierce BCA عبارة عن كاشف فحص مكون من عنصرين وعالي الدقة ومتوافق مع المنظفات لقياس إجمالي تركيز البروتين (A562nm) مقارنة بمعيار البروتين.
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747استخدم 4x Laemmli Sample Buffer لإعداد عينات ل SDS PAGE. لتقليل العينات ، أضف عامل اختزال مثل 2-mercaptoethanol إلى المخزن المؤقت قبل الخلط مع العينة.
4 & ndash ؛ 20٪ Mini-PROTEAN TGX جل البروتين مسبقة الصبBio-Rad456-1094المواد الهلامية طويلة العمر TGX (Tris-Glycine eXtended) لها تركيبة جديدة ويمكن استخدامها لكل من فصل البروتين القياسي لتغيير الطبيعة بالإضافة إلى الرحلان الكهربائي الأصلي.
تتوفر معايير النشاف البريسيشن بلس بروتين WesternCBio-Rad1610376Precision Plus Protein Prestained بتنسيقات Dual Color و All Blue و Kaleidoscope و Dual Xtra. الأربعة لديهم نفس أنماط هجرة الهلام ، مع 3 نطاقات مرجعية عالية الكثافة (25 و 50 و 75 كيلو دالتون).
10x Tris / Glycine / SDSBio-Rad161073210x Tris / glycine / SDS عبارة عن مخزن مؤقت للتشغيل مخلوط مسبقا لفصل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE.
حزم نقل ترانس بلوت توربو ميني PVDF حزمنقل Bio-Rad1704156Trans-Blot Turbo Mini PVDF لنقل سريع وفعال للبروتينات من المواد الهلامية الصغيرة باستخدام نظام نقل Trans-Blot Turbo. تحتوي كل عبوة نقل جاهزة للاستخدام محكمة الغلق وجاهزة للاستخدام على مكدسين لخزان الأيونات المشبع بالمخزن المؤقت وغشاء PVDF مبلل مسبقا.
بروتين دقيق StrepTactin-HRP مترافقBio-Rad1610381StrepTactin-Horseradidish Peroxidase (HRP) للكشف الكيميائي أو اللوني لمعايير البروتين غير الملوثة بدقة بالإضافة إلى البروتين أو معايير البروتين الغربي للبروتين على البقع الغربية.
حل Immun-Star WesternCBio-Rad5572Immun-Star WesternC ، وهي طريقة للكشف عن البروتين ، يكتشف كميات البروتين في منتصف الفيمتوغرام.
السلبي العالميInvitrogen12935300التحكم السلبي siRNA ليس له تشابه كبير في التسلسل مع تسلسل الفئران أو الفئران أو الجينات البشرية. تم اختبار التحكم أيضا في الشاشات القائمة على الخلايا وثبت أنه ليس له تأثير كبير على تكاثر الخلايا أو قابليتها للحياة أو مورفولوجيا.
opti-MEM Glutamax MediumThermo Fisher Scientific51985026Opti-MEM Medium هو متوسط أساسي محسن (MEM) يسمح بتقليل مكملات مصل الأبقار الجنيني بنسبة 50٪ على الأقل دون تغيير في معدل النمو أو التشكل.
كاتم الصوت Select مصمم مسبقا ومصمم يعد تداخل الحمض4390824هو أفضل طريقة لإسقاط التعبير الجيني بشكل فعال لدراسة وظيفة البروتين في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.
كاشف الإرسال Lipofectamine RNAiMAX كاشف الإرسالInvitrogen13778075Lipofectamine RNAiMAX يوفر حل متقدم وفعال لتوصيل siRNA. لا يوجد كاشف تعداء خاص بالحمض النووي الريبي يوفر مثل هذا التوصيل السهل والفعال للحمض النووي الريبي في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا بما في ذلك أنواع الخلايا الشائعة والخلايا الجذعية والخلايا الأولية ، بالإضافة إلى أنواع الخلايا التي يصعب نقلها تقليديا.
تركيز عمل الفأر المضاد IQGAP1Invitrigen33-8900: 1: 400 في محلول الحليب 5٪
الماعز المضاد للفأر IgG-HRP: sc-2005سانتا كروزsc-2005تركيز العمل: 1: 10000 في محلول حليب 5٪
PMSFSigma AldrichP 7626هذا مثبط للبروتياز سيرين وأستيل كولينستراز
Thermocycler ل RT-PCRMJ RESEARCHMJ Research PTC-200 Thermal Cyclerيسمح بتجانس درجة الحرارة وسرعة تصاعد تصل إلى 3 درجات ؛ ج / ثانية. يمكن تنفيذ البروتوكول أيضا مع أجهزة التدوير الحراري الأخرى
RT-PCR في الوقت الحقيقينظام الأنظمة الحيوية التطبيقية7500 RT-PCRهذه منصة من خمسة ألوان تستخدم كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القائمة على التألق لتوفير قياس نسبي باستخدام نوع الفحص CT< / sub> المقارن. يمكن تنفيذ البروتوكول أيضا مع الدراجات الحرارية الأخرى
مقاييس الطيف الضوئي ذات الحجم الصغيرThermo ScientificNanodropيوفر قياسا دقيقا وسريعا للنووية الحمضية باستخدام حجم صغير من
نظام النشافBio-RadTrans-Blot Turboالذي يقوم بنقل الجاف في بضع دقائق نظام
الحصول على الصور وتوثيق الهلامصورة Bio-RadChemidoc النظامإنه سهل الاستخدام للكشف عن الإضاءة الكيميائية
تم يوفر كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز التحكم النووي الريبي الحمض النووي الريبي (RNAi) الذي تم التحقق من صحته أداة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477(2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HER2 IC50 IQGAP1

مقالات ذات صلة