مقالة منهجية

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

DOI:

10.3791/56605

⸱

ديسمبر 8, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتين إينتيجراسي (في) لفي النموذج الفيروس مزبد (فف) إنزيم نموذج لدراسة إليه التكامل للفيروسات الرجعية. مقارنة من الفيروسات القهقرية الأخرى، في فف القابلة للذوبان أكثر وأكثر قابلية للمعالجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه حساس لمثبطات في ذات الصلة سريرياً فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يدل على أن الآلية الحفازة في فف مماثلة إلى أن من "تلبيتها،" فيروس نقص المناعة البشرية-1 يحفز التساهمية ضم الحمض النووي التكميلية الفيروسية (كدنا) للهدف ودعا الحمض النووي في عملية نقل حبلا. ويدخل هذا رد فعل نقل حبلا نيكس إلى الهدف الحمض النووي. يمكن مرتبك تحليل إدماج نواتج التفاعل بوجود نوكليسيس أن المثل نك الحمض النووي. لقد ثبت نوكلاس جرثومي لتنقية يشترك مع المؤتلف في فف المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية (كولاي). هنا يصف لنا طريقة لعزل في فف من نوكلاس تلويث من الهيبارين التقارب اللوني. ويجري فرز الكسور بسهولة للتلوث نوكلياسي مع بلازميد سوبيركويليد و [اغروس] هلام التفريد. في بفف و nuclease تلويث عرض الانتماءات البديلة سيفاروسي الهيبارين مما يسمح إعداد خالية nuclease المؤتلف بفف في مناسبة لتحليل جزيء البيوكيميائية أو واحد الجزء الأكبر من التكامل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسات جزيء البيوكيميائية وواحد من تفاعلات البروتين مع الحمض النووي تتطلب البروتينات المؤتلف استثنائية نقية. تلوث نوكليسيس من البكتيريا يمكن أن تحجب نتائج هذه الاختبارات. تم العثور على نوكلاس تلويث في الأعمال التحضيرية للبروتينات المؤتلف الأكسجين الكاسح بروتوكاتيتشواتي-3 و 4-ديوكسيجيناسي (PCD) ونموذج مزبد الفيروس (فف) إينتيجراسي (في) المعزولة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)1 , 2 , 3.

فحوصات التكامل للفيروس تعتمد على تحويل الحمض النووي سوبيركويليد للمنتجات رصدت أو الخطي كتدبير في النشاط4. خلال العدوى الخلوية ينضم في طرفي كدنا الفيروسية الكروماتين المضيف5. ويطلق على كل نهاية الانضمام إلى رد فعل نقل حبلا. فحوصات المؤتلف في النشاط قد ينضم إلى اثنين الحمض النووي ليغومرات محاكاة كدنا الفيروسية وينتهي إلى هدف الحمض النووي في تكامل منسقة رد فعل4،5،6،،من78. وبدلاً من ذلك قد المؤتلف في الانضمام إلى واحدة فقط من نهاية الحمض النووي في موقع نصف ذات صلة غير فسيولوجيا تكامل رد فعل9،10. عندما سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي هو الهدف من التكامل، التكامل متضافرة منتجات خطيا الحمض النووي ومنتجات التكامل الموقع نصف الدوائر استرخاء. يتم تعريف هذه المنتجات رد فعل بقدرتهم النسبية على الحركة أثناء [اغروس] هلام التفريد1. إذا كان في المؤتلف تلويث نوكلاس، سيكون هناك دوائر استرخاء زائفة أو بلازميد ربما تطبق الخلط بين النتائج التجريبية. قد يكون المسمى ليغومرات الحمض النووي الفيروسي فلوريسسينتلي شكل قاطع تحديد المنتجات التكامل، بدلاً من المنتجات نوكلاس. ومع ذلك، في تفضل كثيرا سوبيركويليد الحمض النووي الأهداف؛ ويمكن أن تحرف أي خسارة في بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو الحمض النووي الخطي بتلويث نوكلاس النتائج وتفسير البيانات11. وبالتالي من الضروري إزالة nucleases البكتيرية من الفيروسات التراجعية في الأعمال التحضيرية.

في فف لها صلة مختلفة عن الهيبارين سيفاروسي مقارنة بال نوكلاس البكتيرية1. قد تكون مفصولة في فف ونوكلاس شطف تدرج خطي من الهيبارين سيفاروسي. عدم الكشف عن نوكلاس سهولة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 280 نانومتر ذروة أو الصوديوم التحليلية دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بدلاً من ذلك، يتم الكشف عن نوكلاس بمقايسة نشاط نوكلاس استخدام تحويل بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو المنتجات الخطية. يتم اختبار كل جزء بعد الهيبارين سيفاروسي اللوني لنشاط نوكلاس. في فف والملوث نوكلاس قد لا فرق في تقارب عن راتنج شاردة مونو-Q. هناك فرق صغيرة في تقارب عن الراتنج الموجبة مونو-S. ومع ذلك، لا يسمح القرار مونو-S نوكلاس البكتيرية وفي فف كفاءة فصل البروتينات. وفي نهاية المطاف، الهيبارين سيفاروسي انجذاب تطهير يقدم أفضل فصل نوكلاس البكتيرية من فف في وفي الاستفادة من حجم التحميل غير محدود.

اختبار لتلويث نوكلاس النشاط يمكن تكييفه مع غيرها من البروتينات. بروتين الفائدة من المحتمل أن يكون الخصائص تقارب البديلة مما في فف؛ ويجب تحديد الفرق في ربط خصائص البروتين الفائدة والملوث نوكلاس تجريبيا. قد تكون هذه المنهجية لتحديد التلوث nuclease تتكيف مع الراتنجات الأخرى بما في ذلك الموجبة مونو-S أو راتنجات تبادل شاردة مونو-Q. راتنجات التبادل الأيوني وتقارب قد توفر طريقة موثوقة لعزل بروتين المؤتلف من الفائدة من تلويث nucleases مع أي قيود على حجم البروتين خلال الفصل اللوني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الحث على بفف في التعبير في كولاي

  1. إضافة 1 ميكروليتر من بفف في التعبير بلازميد (10 نانوغرام/ميكروليتر) إلى 20 ميكروليتر من بليس BL21(DE3) كولاي (20 ميكروليتر قاسمة من الخلايا المتوفرة تجارياً قد > 2 × 106 ميكروغرام/زيمبابوي بلازميد) في أنبوب 1.5 مل. المزيج بلطف بالإصبع التنصت أو التحريك الأنبوب. احتضان الجليد في 5 دقائق.
    1. حرارة صدمة للضبط 30 ثانية في ˚C 42 المياه حمام وثم العودة فورا الجليد لمدة 2 دقيقة.
    2. إضافة 80 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة مرق سوبر الأمثل مع وسائل الإعلام القمع (شركة نفط الجنوب) كاتابوليتي. احتضانها ح 1 في 37 ˚C مع 225 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة) تهتز.
    3. لوحة 25 ميكروليتر من المخلوط على 100 ملم × 15 ملم طبق بتري يحتوي على 25 مل أجار (رطل) مرق لوريا (1 L رطل أجار: 10 جرام بكتو-تريبتوني، 10 جرام كلوريد الصوديوم، خلاصة الخميرة ز 5، 15 ز أجار) و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين (100 مغ/مل حل الأسهم).
    4. لوحة ميكروليتر 75 المتبقية من الخلايا المحولة على صفيحة متطابقة ثانية. احتضان اللوحات مع الأغطية لأسفل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. استرداد اللوحات من تحول كولاي. استخدام مستعمرة واحدة لتطعيم 3 مل رطل (L 1 رطل: استخراج 10 غم من بكتو-تريبتوني، 10 غم من كلوريد الصوديوم، 5 غ خميرة) وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين في أنبوب ثقافة البوليبروبيلين قاع جولة 14 مل. احتضانها ح ~ 8 في ˚C 37 مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    1. إضافة مل 3 من الثقافة إلى 50 مل تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والكلورامفينيكول 34 ميكروغرام/مل (حل الأسهم 34 ملغ/مل) في 250 مل قارورة Erlenmeyer رطل. احتضان ثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    2. نقل مل 53 من الثقافة إلى رطل و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في قارورة Erlenmeyer ل 4 1 لتر. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة.
    3. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) للثقافة بشكل دوري. وفي البداية، تحقق ثقافة OD600 كل ح. كما تصل الثقافة التطوير التنظيمي المطلوب600، تحقق من كل 15 دقيقة عدم كسا. تنمو الثقافة ل التطوير التنظيمي600 بين 0.9 و 1.0. نقل قارورة لحمام الثلج ودوامه لتخفيض درجة الحرارة للثقافة.
  3. نقل 1 مل الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل لتحليلها في وقت لاحق من يشوه الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل.
    1. بيليه الخلايا في الأنبوب 1.5 مل بالطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في [ميكروفوج] في غ س 14,000 في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 150 ميكروليتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل بيبيتينج. قد يكون برنامج تلفزيوني أما مع أو بدون كاكل2 ومجكل2.
    2. إضافة ميكروليتر 150 2 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت (150 مم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 1.2% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 30%، 15% β-ميركابتوثانول (βME)، بروموفينول 0.0018% الأزرق) ومزيج دقيق من بيبيت أو دوامة. يغلي لدقيقة 3 مخزن في-20 درجة مئوية.
  4. إضافة إلى ثقافة البكتيرية: تركيز نهائي ل 0.25 مم الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج، حل الأسهم 0.25 متر) و 50 ميكرومتر زنكل2 (حل الأسهم 50 مم). إيبتج الحث على التعبير عن الجين فف من المروج T7 وزنكل2 يتم إضافتها كملحق للطي الصحيحة لمجال إصبع الزنك الأمينية الطرفية في تلبيتها، فف إينكوباتي ثقافة عند 25 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة ل 4 h. فورا نقل قارورة لحمام الثلج. حفظ 1 مل ثقافة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل أثر البروتوكول نفسه كما هو مذكور أعلاه في 1-3.
  5. نقل ثقافة البكتيرية لزجاجات حجم مناسب للطرد المركزي. على سبيل المثال، يمكن نقل ثقافة 1 لتر إلى أربعة زجاجات البولي بروبلين مخروطية الشكل السفلي عقيمة المتاح 250 مل. تدور الزجاجات في الطرد مركزي منضدية مبردة في 3000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. تجاهل سوبيرناتانتس بصب.
    1. ريسوسبيند كل من الكريات من ثقافة بكتيرية 1 لتر في إجمالي حجم 25 مل (6.25 مل للزجاجة الواحدة) برنامج تلفزيوني الباردة (مع أو بدون كاكل2 ومجكل2) قبل بيبيتينج. الجمع ونقل تعليق البكتيرية إلى أنبوب مخروطي 50 مل واحد. تدور في أجهزة الطرد مركزي مبردة في 3,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بصب أو بيبيتينج.
  6. ريسوسبيند بيليه البكتيرية في المخزن المؤقت لاستثارة 10 مل (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ومثبطات البروتياز فينيلميثيلسولفانوكسيدي (بمسف) ميكرومترات 500) قبل بيبيتينج. تجميد الأداة بيليه عن طريق وضع الأنبوب في قارورة ديوار مع النيتروجين السائل تكفي لغمر أنبوب 50 مل. بعناية إزالة الأنبوب من النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين الكريات البكتيرية لعدة أشهر في-80 درجة مئوية. ولقد رأينا أي فقدان للبروتين النشط بعد تخزين-80 درجة مئوية لمدة عامين.
  7. تحليل العينات قبل التعريفي والتوجيهي بعد انتهاء من 8.3 سم، 7.3 سم ارتفاع، 0.75 مم سميكة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الهلام مع بولياكريلاميدي 6% 1.5 مل التراص طبقة (125 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 6% الاكريلاميد، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% الأمونيوم فوق كبريتات، 0.001% تيميد) و 3.5 مل 10% بولياكريلاميدي حل طبقة (375 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8، 8، 10% الاكريلاميد، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% الأمونيوم فوق كبريتات، 0.001 في المائة تيميد)12.
    1. بعد صب جل التراص، إدراج 10 مشط جيدا. عندما قد بلمرة الهلام، تجميع الجهاز الصفحة، وإضافة كافية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت قيد التشغيل (25 مم تريس، 192 مم جليكاين، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%).
    2. تحميل 10 ميكروليتر من كل عينة وميكروليتر 4 مستويات البروتين بريستاينيد. تشغيل عند 16.5 V/سم حتى يصل إلى الجبهة صبغ الجزء السفلي من الجل، حوالي 60 دقيقة.
    3. تفكيك لوحات جل ونقل الجل إلى حوض بلاستيك. إضافة "أخذ الأزرق الرائعة" تلطيخ الحل (0.1% R-250 الأزرق الرائعة أخذ، الميثانول 40%، حمض الخليك 10 ٪) لتغطية جل سخاء ووصمة عار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة الحل المصبوغة بصب واستبدال مع ديستين الحل (40% ميثانول وحمض الخليك 10%) حتى تكون الأشرطة العيان. إزالة الحل ديستينينج بصب واستبدالها بالمياه. ينبغي أن تحدد في فف بسهولة في العينة بعد التعريفي. وقد في فف مع علامة هيكساهيستيديني وزن الجزيئي 47374 دا.
    5. إذا لم يكن مرئياً في فف، كرر التعريفي بدءاً من مستعمرة مختلفة من واحدة من لوحات التحويل.

2-النيكل التقارب اللوني

  1. ذوبان الجليد واحد بيليه البكتيرية على الجليد.
    ملاحظة: هذا سوف يستغرق قدرا كبيرا من الوقت (حوالي 2-3 ح). عندما قد إذابة بيليه إلى ملاط خلية، إضافة ميكرومترات 500 إضافية بمسف (حل الأسهم 100 ملم).
  2. إبقاء أنبوب 50 مل من البكتيريا الملاط على الجليد. Sonicate البكتيريا في السعة 30% 30 s (1 s في 1 s إيقاف) كل بيليه المستمدة من الثقافة 1 لتر باستخدام سونيكاتور مع قرن بيو قطرها 0.5 بوصة قطرها 0.125 بوصة مدبب ميكروتيب، وتواتر 20 كيلوهرتز، والحد الأقصى من الطاقة من 400 جورج
  3. نقل العينة الخلية إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي باردة. استخدام البولي زجاجة التجميعات (25 مم وارتفاع 89 مم) متوافقة مع دوار زاوية ثابتة "نوع 60 منظمة الشفافية الدولية". قد يتم استخدام أنابيب بديلة والدوارات إذا تحقق نفس القوة الجاذبية. ز خ 120,000 تدور لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. ينبغي أن يكون هناك بيليه واضحة. قد تكون المادة طافية لون أصفر.
  4. نقل المادة طافية بصب أو بيبيتينج إلى أنبوب مخروطي باردة 50 مل. علما بأن حجم؛ ينبغي أن يكون هذا الحجم تقريبا حجم استثارة المخزن المؤقت المستخدمة من قبل الأداة الإضافية التجميد. إذا كانت المادة طافية لزج، قد تكون ملوثة بالحمض النووي البكتيرية التي يمكن أن تسد العمود اللوني. وفي هذه الحالة، كرر تنبيذ فائق بيليه الحمض النووي البكتيري.
  5. إعداد 500 مل المخزن المؤقت (50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 500 ميكرومتر بمسف) و 500 مل "ب المخزن المؤقت" (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 500 ميكرومتر بمسف، ايميدازول 200 ملم).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، والحفاظ على النظام اللوني السائل (فبلك) البروتين سريعة وكافة المخازن المؤقتة والعينة في 4 درجات مئوية في غرفة باردة.
    1. المخازن المؤقتة لتصفية العقيمة A و B مع وحدات تصفية المتاح ميكرومترات 0.2. استناداً إلى نظام فبلك، تغسل بمضخة ومضخة ب مع المخزن المؤقت A و B المخزن المؤقت، على التوالي. تدفق 90% بالمخزن المؤقت و 10% "ب المخزن المؤقت" عن طريق النظام حتى استقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. يتوقف معدل التدفق الأقصى في الصك؛ استخدم معدل تدفق من 5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 1.0 الآلام والكروب الذهنية.
  6. إعداد 110 مم طويلة، 5 ملم قطر فبلك عمود مع الراتنج 1.5 مل مشحونة بالنيكل (ملزمة كحد أقصى قدرة 50 ملغ/مل، الحد الأقصى من الضغوط 1 الآلام والكروب الذهنية). وقد أعدت قبل تنقية اليوم العمود والمخزنة في 4 ˚C.
  7. قم بتوصيل العمود الأداة فبلك. حجته العمود مع 20 مل من 90% بالمخزن المؤقت و 10% المخزن المؤقت ب (20 مم ايميدازول) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 0.5 الآلام والكروب الذهنية. ينبغي أن يكون الصك جمع بيانات الوقت الحقيقي من الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (280). وينبغي تحقيق الاستقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم قد استقرت هذه القراءات، تواصل تدفق المخازن المؤقتة من خلال العمود حتى أنها مستقرة.
  8. تحميل العينة البروتين (~ 10 مل كل بيليه) إلى العمود بمعدل تدفق 0.15 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 0.5 الآلام والكروب الذهنية. لا يزال الضغط الأعمدة ومعدل تدفق نفسه طوال التنقية. جمع من خلال التدفق في أنبوب 50 مل.
    1. أغسل العمود مع 20 مل 90% بالمخزن المؤقت و 10% تجمع المخزن المؤقت ب الغسيل في أنبوب 50 مل. الوت البروتينات مع تدرج خطي 20 مل من 10% إلى 100% المخزن المؤقت ب (20 ملم إلى 200 ملم ايميدازول).
    2. وأخيراً، أغسل العمود مع 5 مل 100% المخزن المؤقت ب (200 ملم ايميدازول). جمع الغسيل التدرج ونهائي في مل 0.27 الكسور.
  9. الجمع بين 15 ميكروليتر 2 x الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت مع 15 ميكروليتر من التدفق من خلال المياه والصرف الصحي، وذروة الكسور280 ألف. يغلي عينات لمدة 3 دقائق.
    1. إعداد اثنين 10 ٪ الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كما هو موضح مسبقاً في الخطوة 1.6 إلا مع 15 كومز جيدا. تحميل 10 ميكروليتر من كل عينة للمواد الهلامية وميكروليتر 4 مستويات البروتين بريستينيد. تشغيل، وصمة عار، وتحليل المواد الهلامية كما هو موضح في الخطوة 1، 6.
    2. الجمع بين الكسور التي يبدو أنها تحتوي على قرابة نقية في فف استناداً إلى الفحص البصري. قياس الحجم قبل بيبيتينج، عادة من 8-10 مل.
    3. باستخدام جهاز المطياف الضوئي، قياس أ280 من الكسور مجتمعة وحساب المبلغ الإجمالي للبروتين في فف؛ لدينا عائد نموذجي ~ 10 ملغ للأم الثقافة المستحث. معامل الانقراض في فف مع علامة هيكساهيستيديني هو سم 59360-1 م-1.
  10. لإزالة علامة هيكساهيستيديني، الملحق "في فف" مع ديثيوثريتول 10 ملم (DTT، حل الأسهم 1 متر) و 0.1 ملم يدتا، pH 8.0 (0.5 م حل الأسهم). إضافة 15 ميكروغرام للبشرية رهينوفيروس (HRV) ج 3 حوزتي كل مغ فف تلبيتها، إينكوباتي في 4 ˚C بين عشية وضحاها. يقلل من الوزن الجزيئي "في فف" من 47374 دا على دا 44394 الانقسام ومن الممكن التحقق من تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%.

3-الهيبارين التقارب اللوني

  1. تحضير 250 مل "ج المخزن المؤقت" (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم DTT، 0.1 مم يدتا، 500 ميكرومتر بمسف) و 250 مل العازلة د (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم DTT، 0.1 مم يدتا، 500 ميكرومتر بمسف، 1 م كلوريد الصوديوم).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، نظام فبلك، ومخازن وعينه يتم الاحتفاظ في غرفة باردة في 4 ˚C.
    1. تصفية العقيمة "ج المخازن المؤقتة" ود مع وحدات تصفية المتاح ميكرومترات 0.2. استناداً إلى نظام فبلك، تغسل A مضخة ومضخة ب مع المخزن المؤقت جيم ودال في المخزن المؤقت، على التوالي. تدفق 80% ج المخزن المؤقت و 20% د المخزن المؤقت عن طريق النظام حتى الموصلية واستقرار قراءات الأشعة فوق البنفسجية. يتوقف معدل التدفق الأقصى في الصك؛ نحن تستخدم بشكل روتيني بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة بحد أقصى ضغط 1.0 الآلام والكروب الذهنية.
  2. إعداد 80 مم طويلة، 5 ملم قطر فبلك عمود مع 1 مل من الهيبارين سيفاروسي الراتنج (الحد الأقصى الراتنج الثالث antithrombin كل مل القدرة الملزمة 2.0 ملغ للأبقار؛ والحد الأقصى من الضغوط 1.4 الآلام والكروب الذهنية). قد يكون إعداد اليوم قبل تنقية العمود والمخزنة في 4 درجات مئوية. قم بتوصيل العمود الأداة فبلك.
    1. حجته العمود مع 20 مل من 80% ج المخزن المؤقت و 20% د المخزن المؤقت (200 ملم كلوريد الصوديوم) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع حد أقصى ضغط 1 الآلام والكروب الذهنية. ينبغي أن يكون الصك جمع بيانات الوقت الحقيقي من الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (280). وينبغي تحقيق الاستقرار الموصلية وقراءات الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم قد استقرت هذه القراءات، تواصل تدفق المخازن المؤقتة من خلال العمود حتى أنها مستقرة.
  3. خفض تركيز كلوريد الصوديوم من العينة "في فف" إلى 200 ملم بإضافة 1.5 حجم "المخزن المؤقت جيم" على سبيل المثال، بإضافة 15 مل ج "المخزن المؤقت" إلى 10 مل بفف تلبيتها، عادة ما يكون لدينا الحجم الإجمالي ~ 25 مل.
  4. تحميل العينة في فف المخفف للعمود سيفاروسي الهيبارين معدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع الحد الأقصى من الضغوط تحد من الآلام والكروب الذهنية 1.0. لا يزال الضغط الأعمدة ومعدل تدفق نفسه طوال التنقية. جمع من خلال التدفق في أنبوب 50 مل مخروطية.
    1. أغسل العمود مع 20 مل من 80% C العازلة و 20% د المخزن المؤقت (200 ملم كلوريد الصوديوم)، جمع الغسيل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الوت العمود مع تدرج خطي 30 مل من 20% إلى 100% د المخزن المؤقت (200 ملم إلى 1 م كلوريد الصوديوم).
    2. أغسل العمود مع 5 مل من 100% D. المخزن المؤقت جمع الغسيل التدرج ونهائي في مل 0.37 الكسور.
  5. تحليل تحميل، والتدفق من خلال، والمياه والصرف الصحي، والكسور بنسبة 8% الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة كما هو موضح في 2-9. في فف عقب انشقاق العلامة هيكساهيستيديني وزن الجزيئي دا 44394 ومعامل الانقراض يظل سم 59360-1 م-1 دون علامة هيكساهيستيديني. تخزين جميع الكسور في 4 ˚C حتى الانتهاء من المقايسة نوكلاس.

4-نوكلاس الإنزيم

  1. تحديد الكسور سيفاروسي الهيبارين التي يبدو أنها تحتوي على النقي تقريبا فف تلبيتها، الجمع بين 3 ميكروليتر من الكسر الهيبارين و 50 نانوغرام 3 كيلو بايت الحمض النووي بلازميد سوبيركويليد في رد فعل المخزن المؤقت (10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 110 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم MgSO4، 4 ميكرومترات زنكل2 ، 10 مم DTT) مع وحدة تخزين نهائي من 15 ميكروليتر. احتضان في ˚C 37 ل 90 دقيقة تضمين عنصر تحكم سلبية مع لا تلبيتها، فف
    1. وقف رد الفعل مع البروتيناز 1 ملغ/مل ك (حل الأسهم 20 ملغ/مل) والحزب الديمقراطي الصربي 0.5% (10 ٪ حل الأسهم). احتضان في 37 درجة مئوية لعينات حاء – 1 قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
  2. تحضير هلام 125 مل 1% من وزن الواحدة [اغروس] حجم (w/v) في 1 x TAE المخزن المؤقت (40 مم تريس-خلات، يدتا 1 مم) مع 0.1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد (10 ملغ/مل حل الأسهم)13. تذوب الحل [اغروس] وصب إلى علبة صب جل 15 سم × 10 سم. إدراج 15 مشط جيدا مع 5 مم على نطاق واسع، 0.75 مم سميكة الآبار. الآبار رقيقة تسفر عن قرار الفرقة أفضل مقارنة بالآبار 1.5 مم سميكة. السماح الهلام يصلب في درجة حرارة الغرفة.
    1. تزج الهلام في 1 x TAE مع 0.1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. إضافة 3.5 ميكروليتر من 6 × تحميل صبغ (والغليسيرول 50%، وصبغ "برتقالي ز" 0.15 في المائة) إلى ردود فعل الإنزيم نوكلاس. تحميل وحدة التخزين بأكملها إلى الهلام. تشغيل الهلام في الجهد المستمر، 10 فولت كل سم (100 V) في درجة حرارة الغرفة لح 1 أو حتى الجبهة صبغ "برتقالي ز" يصل إلى نهاية الهلام.
  3. فورا صورة [اغروس] هلام مع ماسح ضوئي فلورسنت للكشف عن اثيديوم بروميد. ينبغي تشغيل خطي الحمض النووي وفيا لحجم في 3 كيلو بايت والحمض النووي سوبيركويليد يجب تشغيل أسرع (~ 2 كيلو بايت) ودائرة استرخاء الحمض النووي يجب تشغيل أبطأ (~3.5 كيلو بايت).
    1. استخدام برنامج تحليل الصور، حساب حجم بكسل بلازميد دائرة سوبيركويليد والخطية، واسترخاء في كل حارة. استدعاء مجموع بكسل قيمة وحدات التخزين لهذه الأشكال الثلاثة من الحمض النووي الحمض النووي "المجموع" واستخدامها لحساب النسبة المئوية للدوائر الخطية واسترخاء. على سبيل المثال، هو حجم بكسل دوائر استرخاء مقسوماً على إجمالي قيمة بكسل الحمض النووي في هذا الممر، وضرب هذا الرقم 100 لتحديد نسبة مئوية. الكسور التي تحتوي على نوكلاس تلويث عرض نسبة مئوية أعلى من الدوائر الخطية ومريحة مقارنة بمراقبة سلبية.
  4. الجمع بين الهيبارين سيفاروسي الكسور التي لا تعرض بتلويث نوكلاس النشاط. دياليزي في 10 ملم 6-8 كاتشين الوزن الجزيئي استقطاع (موكو) الغسيل الكلوي الأنابيب عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها ضد 1 لتر من 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 50 ميكرومتر زنكل2، 10 مم DTT، والغليسيرول 20%.
  5. استرداد العينة في بفف nuclease خالية من أنابيب الغسيل الكلوي. قياس أ280 وحساب تركيز البروتين النهائي. تجميد قاسمة والمفاجئة في نيتروجين سائل. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤتلف فف في كثير من الأحيان ملوثة نوكلاس بكتيرية1. فحوصات التكامل البيوكيميائية تعتمد على كوانتيتيشن لتحويل سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي للدوائر استرخاء ومنتجات الخطي. يمكن أن يؤدي وجود نوكلاس تلويث إلى كوانتيتيشن زائفة لهذه الاختبارات. التعبير في فف مع علامة هيكساهيستيديني التي يسببها في كولاي (الشكل 1) وتنقيتها أولاً بالنيكل التقارب اللوني (الشكل 2). يتم تجميع الكسور مع نقية تقريبا فف في وهو المشقوق العلامة هيكساهيستيديني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤتلف البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي، مثل إصلاح الحمض النووي البروتينات، الزبالين الأكسجين لتطبيقات الميكروسكوب جزيء واحد، أو إينتيجراسيس للفيروسات الرجعية، ينبغي أن تكون خالية من تلوث جرثومي نوكليسيس2،3. قد يسبب ارتباكا هذه الملوثات تفسير النتائج خلال فحوصات جزيء البيوكيميائية أو واحد الأكبر.

وقد وجدنا أن نوكلياسي بكتيرية وكثيراً ما شارك ينقي بتلبيتها، بفف ومع ذلك، يعرض في بفف تقارب سيفاروسي الهيبارين بسهولة يمكن تمييزها من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BL21 / DE3 رشيد E. قولونيةEMD Millipore70956-4
مرق رطلEMD العلوم البيولوجية1.10285.0500
أمبيسلينأمريسكو0339
كلورامفينيكول  Amresco0230
PBSSigma-AldrichD8537
IPTG Denville ScientificCI8280
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
كلوريد الصوديومP212121RP-S23020
PMSF أمريسكو0754
إيميدازول سيجما ألدريتشI0250
DTT & nbsp ؛P212121SV-DTT
UltraPure EDTAInvitrogen / Gibco15575
MgSO4< / sub>Amresco0662
Agarose دينفيل ScientificCA3510
بروميد الإيثيديومثيرمو فيشر العلميBP1302
الجلسرينفيشر العلميG37-20
Ni-NTA SuperflowQiagen30430
الهيبارين Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0998-01
HRV14 3C البروتياز EMD للكيماويات71493-3

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409(2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة