مقالة منهجية

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

DOI:

10.3791/56613

⸱

فبراير 2, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقن الوريد ذيل هيدرودينامية نواقل التكامل على أساس ينقول تمكن تعداء مستقرة من خلايا الكبد مورين المجراة في. نقدم هنا، بروتوكول عملي لنظم تعداء تمكن التعبير التأسيسي طويل الأجل للتحوير مفردة أو مجتمعة التعبير التأسيسي والدوكسيسيكلين إيندوسيبلي للتحوير أو مير-شرنا في الكبد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في نماذج أبحاث سرطان الكبد والتجدد، والالتهاب والتليف، نظم مرنة للتعبير الجيني في فيفو وإسكات مفيدة للغاية. حقن الوريد ذيل هيدرودينامية بني على أساس ينقول طريقة فعالة للتحوير الوراثي لخلايا الكبد في الفئران الكبار. وبالإضافة إلى التعبير التحوير التأسيسي، ويمكن استخدام هذا النظام لتطبيقات أكثر تقدما، مثل الجينات شرنا بوساطة تدق لأسفل، المترتبة على نظام كريسبر/Cas9 للحث على الطفرات الجينية، أو أنظمة إيندوسيبلي. هنا، يقدم مزيج التعبير كرير التأسيسي جنبا إلى جنب مع إيندوسيبلي التعبير التحوير أو مير-شرنا للاختيار كمثال لهذا الأسلوب. نحن تغطي إجراءات متعددة الخطوات بدءاً من إعداد الجمال النائم-يبني ينقول، إلى حقن وعلاج فئران، وإعداد أنسجة الكبد للتحليل قبل إيمونوستينينج. نظام عرض نهج موثوقة وفعالة لتحقيق معقدة التلاعب الجيني في خلايا الكبد. هي مفيدة على وجه الخصوص في تركيبة مع سلالات الماوس Cre/لوكسب-تعتمد ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نماذج في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض أمراض الكبد المزمنة في العالم أعباء صحية رئيسية1. نماذج حيوانية للبحث هي أدوات لا غنى عنها في دراسة أمراض الكبد، وساعدت على الإجابة على أسئلة معقدة في تجديد الكبد، والتهاب الكبد، وذلك فضلا عن سرطان الكبد2. أن عددا كبيرا من هذه النماذج الحيوانية تعتمد على التحوير الوراثي لخلايا الكبد. ومن ثم، هي أدوات فعالة التعامل مع التعبير الجيني في خلايا الكبد مفيدة3. أساليب محددة مثل تربية السلالات المهندسة وراثيا الماوس أو توليد النواقل الفيروسية للإصابة تتمثل هي الميناء تستغرق وقتاً طويلاً، أما الشواغل المتعلقة بالسلامة، أو تسفر عن التعبير التحوير الفقراء في خلايا الكبد في فيفو 4 , 5. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل (هتفي) أسلوب بديل تعداء في الجسم الحي من خلايا الكبد مما يسمح للاستجواب سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة من وظيفة الجينات في الكبد. هتفي، يحل ناقل يحمل تسلسل الحمض النووي المطلوب في مجلد من المقابلة إلى 10% وزن الجسم الحيوان حقن المحلول الملحي. الحل ثم حقن الوريد الذيل ضمن 5-10 ق6. تتجاوز الناتج القلب، تدفقات المياه المالحة من الأجوف فينا أقل شأنا في عروق الكبد، مما أدى إلى التوسع في الكبد وتعداء الهيدروديناميكي لخلايا الكبد7. لتحقيق التكامل الجينوم مستقرة، اقترن الأسلوب ناقلات القائم على ينقول، مثل نظام ينقول النوم الجمال. هذه النظم يتوسط جزئ من ناقلات الأمراض المستهدفة مع مواقع جزئ الجينوم تحفزها8،ترانسبوساسي النوم الجمال-9. لنماذج من تليف الكبد أو التسرطن، من المستصوب غالباً للجينات أوفيريكسبريس أو الصمت في بعض النقاط الزمنية لنموذج المرض. لهذا الغرض، وأدوات للتعبير الجيني إيندوسيبلي مثل Cre/لوكسب-النظام أو نظام التعبير الجيني التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في) قد تكون تستخدم10.

هنا، نحن وصف بروتوكول في فيفو تعداء لخلايا الكبد مورين استخدام هتفي نظام قائم على أساس ينقول الجمال النائم . بالإضافة إلى وضع بروتوكول للتعبير مستقرة، والمكونة من التحوير تحت سيطرة أحد المروجين الخاصة بالكبد، يمكننا وصف نظام ناقل أكثر تقدما الذي يجمع بين تعتمد على تاموكسيفن التأسيسي لجنة المساواة العرقية recombinase (كرير) التعبير التعبير إيندوسيبلي للتحوير أو تكييفها microRNA شرنا (مير-شرنا)، دعا صوغ نظام تيت11. في هذا النظام متجه، يتم استنساخ المتسلسلات إيندوسيبلي أو مير-شرناس للتعبير تعتمد على التتراسكلين في ناقلات العمود الفقري مع وجود نظام استنساخ ريكومبيناشونال، يسمح لتوليد سريعة وسهلة ل ناقلات جديدة12. ويغطي هذا الدليل القائم على الفيديو إعداد متجهات مناسبة والحقن والعلاج من الفئران لتحقيق التعبير التحوير/مير-شرنا إيندوسيبلي، وأخيراً إعداد أنسجة الكبد للتحليل. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين المزيج من أي نظام الماوس Cre/لوكسب بوساطة مع التعبير أو تدق لأسفل أي الجينات في الاختيار، مما يجعل من نظام التطبيق على نطاق واسع في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت عليها السلطات المسؤولة (ريجيرونج فون أوبيرباييرن، ميونيخ، ألمانيا وجامعة ستانفورد، الرعاية المؤسسية على الحيوان واستخدام اللجنة، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). قائمة بجميع والبلازميدات للاستنساخ (الخطوة 1 إلى 4) يرد في الجدول التكميلي S1.

1-استنساخ التحوير للتعبير الجيني التأسيسي

  1. تصميم كبسولة تفجير للتحوير التضخيم13،14.
  2. إضافة مواقع التقييد باشي (تاتا) إلى 5 ' نهاية التمهيدي إلى الأمام. إضافة مواقع التقييد للإداريين (جكجكجكك) أو فسيي (جككجكك) إلى نهاية 5 ' عكس التمهيدي.
  3. تضخيم التحوير ببكر استخدام الظروف الأمثل ل التحوير المرغوب فيه14. تنقية باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي متاحة تجارياً.
    ملاحظة: الصلب الوقت يعتمد على كبسولة تفجير تصميم في الخطوة 1، 1.، استطالة الزمن يعتمد على طول مدة بناء. على سبيل المثال، لبناء 1,000 bp طول استخدام 60 ثانية وقت استطالة.
  4. هضم التحوير وناقل للجينات التأسيسي التعبير15 مع تقييد كل منهما نوكليسيس (راجع الخطوة 1، 2) ومخزن في إجمالي حجم 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. هضم بناء مع 5 وحدات باشي و 5 وحدات فسيي على سبيل المثال، إذا كان ذلك مناسباً (راجع الخطوة 1، 2).
  5. هلام تطهير ناقلات هضمها وإدراج استخدام مجموعة أدوات استخراج جل تجاري وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. القيام عملية ربط قياسية 100 نانوغرام ناقلات والحرس الوطني 100 – 1,000 لإدراج استخدام 400 T4 يو إلغاء تنشيط ليجاسى في 14 درجة مئوية حاء 16 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل. احتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات، وتنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة مينيبريب تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة والتحقق من التسلسل سانغر التسلسل17 (التمهيدي التسلسل: تجكتجاجتكتكجكك 3 '5').
  9. استخدام إيجابي المستعمرات ماكسي مقياس تضخيم بلازميد الحمض النووي وتنقية باستخدام مجموعة أدوات إعداد بلازميد خالية من الذيفان18 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  10. بناء جاهز للحقن، ثم تابع مع الخطوة 5.

2-استنساخ التحوير للتعبير الجيني إيندوسيبلي

  1. تصميم كبسولة تفجير للتحوير التضخيم13،14.
  2. إضافة مواقع التقييد لمبادرة (جاجكتك)، سبيي (أكتاجت)، أو كبني (جتاكك) إلى 5 ' نهاية التمهيدي إلى الأمام. إضافة مواقع التقييد نوتي (جكجككجك) أو إكسهوي (كتكجاج) إلى نهاية 5 ' عكس التمهيدي.
  3. تضخيم التحوير ببكر استخدام الظروف الأمثل ل التحوير المرغوب فيه14. تنقية باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي تجاري.
  4. هضم التحوير المنقي وميكروغرام 4 ناقل الإدخال (pEN_TTmcs-ناقل، انظر الجدول للمواد)19 بشكل منفصل مع nucleases القيد المناسب (راجع الخطوة 2، 2) ومخزن في إجمالي حجم 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. هلام تطهير ناقلات هضمها وإدراج استخدام مجموعة أدوات استخراج جل تجاري وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إجراء عملية ربط القياسية مع 100 نانوغرام ناقلات والحرس الوطني 100 – 1,000 لإدراج استخدام 400 T4 يو إلغاء تنشيط ليجاسى في 14 درجة مئوية حاء 16 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 15 ميكروغرام/مل الجنتاميسين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي، والتحقق من إدراج تسلسل17 استخدام التمهيدي إلى الأمام بسب: أجاجكتكجتتاجتجاككج 3 '5'.
    ملاحظة: يمكن إجراء PCR في المستعمرات واحدة دون تنقية مسبقة مع كبسولة تفجير بسب إلى الأمام وعكس بسب (أغا AAG CTG الكبد كبار المستشارين التقنيين جات المنسوجات والملابس TCG 3 '5'). ويمكن هذه الخطوة مفيدة لاختيار مسبق للمستعمرات الإيجابية.
  9. انتقل إلى الخطوة 4.

3-الاستنساخ من مير شرنا للجينات تدق إيندوسيبلي إلى أسفل

  1. تصميم النوكليوتيد شرنا مير وفقا بسليك الاستنساخ لأغراض البروتوكول19. يصلب وتنقية النوكليوتيد وتمييع 01:20 في ddH2o.
  2. ثم تعطيل ميكروغرام 3 ملخص لناقل الإدخال مع بفواي يو 5 عند 50 درجة مئوية ح 3، رد فعل على 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب هو التعبير المشارك من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، استخدم pEN_TTGmiRc19 متجه دخول، خلاف ذلك استخدام pEN_TTmiRc219.
  3. هلام تطهير ناقلات هضمها كما في الخطوة 2، 5. إجراء عملية ربط القياسية من 100 نانوغرام ناقلات 1 ميليلتر لتنقية وتضعف النوكليوتيد شرنا (الخطوة 3.1) استخدام 400 ش T4 إلغاء تنشيط ليجاسى في درجة حرارة الغرفة حاء 1 الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. تحويل البكتيريا المختصة استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16.
  5. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 15 ميكروغرام/مل الجنتاميسين. احتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
  6. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي، والتحقق من إدراج سانغر التسلسل17 (التمهيدي التسلسل: تاجتكجاكتاججاتاكاج 3 '5').
  7. انتقل إلى الخطوة 4.

4-ريكومبيناشونال الاستنساخ لتوليد جاهزة لحقن الحيوانات المستنسخة

  1. ميكس 150 نانوغرام من ناقلات الإدخال (من الخطوة 2 أو الخطوة 3) و 150 نانوغرام من المؤسسة العامة للاتصالات تيت-ناقلات20.
  2. إضافة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات إلى إجمالي حجم ميليلتر 8 (pH = 8).
  3. تحويل المزيج الإنزيم كلوناسي LR الثاني (انظر الجدول للمواد) الجليد، احتضانها للحد الأدنى 2 دوامة مرتين.
  4. إضافة 2 ميليلتر من كلوناسي LR إنزيم ميكس الثاني إلى رد الفعل واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 1.
  5. وقف رد الفعل بإضافة 1 ميليلتر من البروتيناز كالحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. تحويل Stbl3 استخدام الحرارة-الصدمة-بروتوكول قياسي16مزيج البكتيريا المختصة مع 2 ميليلتر من استنساخ ريكومبيناشونال.
  7. لوحة على أجار لوحات تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل. احتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
  8. اختيار واحدة من المستعمرات وتنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات إعداد بلازميد خالية من الذيفان18 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، وتأكيد سلامة ناقلات سانغر التسلسل17 (تسلسل التمهيدي 5 ' أججاكاجكاجاجاتككاجتتج 3 ').
  9. بناء جاهز للحقن، تابع مع الخطوة 5.

5-إعداد حل لحقن الوريد هيدرودينامية الذيل

ملاحظة: إعداد بنيات للتعبير الجيني التأسيسي وإيندوسيبلي موصوفة في الخطوة 1، 2، 3 و 4.

  1. تعد عقيمة المالحة 0.9% للحقن (هل عدم استخدام برنامج تلفزيوني). استخدام حجم المقابلة لحوالي 10% وزن الجسم الماوس. على سبيل المثال: لماوس وزنها 20 غراما، وإعداد 2 مل من محلول.
  2. إعداد ناقلات الحقن التي تم تنقيتها باستخدام أدوات تنقية بلازميد خالية من الذيفان18 (راجع الخطوة 1.8 أو 4.8، على التوالي).
  3. إضافة ميكروغرام 10 أو 15 ميكروغرام لبناء ناقلات خالية من الذيفان النوم الجمال (من الخطوة 1 استخدام 10 ميكروغرام، من الخطوة 4 استخدام 15 ميكروغرام، على التوالي) و 1 ميكروغرام خالية من الذيفان pc-HSB521 الواحد مل من المحلول الملحي المعقم.
  4. تخزين حل لما يصل إلى 4 س في 4 درجات مئوية. لا تجمده.

6-القيام بحقن الوريد هيدرودينامية الذيل

  1. استخدام ريستراينير لحقن الوريد الذيل (تجارية أو المعدة من أنبوب مخروطي 50 مل مع ثقوب للتنفس والذيل). ملء أسفل الأنبوبة مع المناديل الورقية.
  2. للحقن، استخدام الفئران لحوالي 8 – 10 أسابيع من العمر مع الأوزان 20-25 جرام.
  3. وزن الفئران قبل الحقن وإعداد حجم الحقن وفقا لوزن الجسم (المقابل لنسبة 10% وزن الجسم، راجع الخطوة 5، 1). إعداد عقيمة 3 مل-حقنه بإبرة ز 27 للحقن والتعبئة مع الحجم المطلوب.
  4. ضع الماوس في ريسترينير. ضبط الكمية من المناديل الورقية (راجع الخطوة رقم 6، 1) ترك الحد الأدنى فقط من الفضاء للحركة لكن مساحة كافية للتنفس.
  5. تأكد من أن الماوس هو التنفس بانتظام.
  6. الحارة الذيل استخدام مصباح الأشعة تحت حمراء ل 30-60 س. بعناية لمشاهدة علامات الانهاك.
  7. تنظيف الذيل مع مسحه الكحول.
  8. أدخل الإبرة تقريبا أفقياً في أحد شرايين الذيل الأفقي هما قريبة من قاعدة الذيل.
    ملاحظة: إذا وضع بنجاح، قد تدفق كمية صغيرة من الدم مرة أخرى في المخروط الإبرة. لا ينصح نضح بنشاط كما يمكن أن يؤدي أي حركة إضافية من الإبرة في التشرد و/أو إصابة الوريد.
  9. حقن الحجم الإجمالي في هذا السياق ذيل داخل s 8-10.
  10. من ريسترينير على الفور إزالة الماوس. ضغط حقن الجرح لمالا يقل عن 30 ثانية أو حتى أي نزيف ينحسر.
  11. ضع الماوس في قفص منفصل. وبمجرد الماوس تعافي من الإجراء (حوالي 30-60 دقيقة)، نقل الماوس مرة أخرى إلى قفصة الأصلي. تحقق من على الماوس بشكل منتظم ل 24 ساعة القادمة.
    ملاحظة: الملاحظ تخدير خفيف للماوس بشكل روتيني ليصل إلى 2 حاء بعد الحقن.
  12. قبل الشروع في مزيد من التجارب (أي، الخطوة 7)، انتظر 10 – 15 يوما لإزالة الألغام ناقلات غير متكامل.

7-تنظيم دورات تعريفية كرير Transfected مع تاموكسيفين

تنبيه: تاموكسيفين الضارة، قد تكون سرطانية أو الأضرار الخصوبة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

  1. خطة الحقن داخل تاموكسيفين على ثلاثة أيام متتالية.
  2. في اليوم الأول، حل 10 ملغ تاموكسيفين في 40 ميكروليتر الإيثانول. احتضان في 55 درجة مئوية للحد الأدنى 10 دوامة عدة مرات حتى التاموكسيفين قد حلت.
  3. إضافة 960 زيت الذرة ميليلتر. احتضان لمدة 5 دقائق في 55 درجة مئوية. دوامة عدة مرات للحصول على حل واضح.
  4. يعد الحل في حقنه الأنسولين 1 مل بإبرة ز 27.
  5. القفا الماوس بالاستيلاء على رقبة الماوس بعناية مع الإبهام والإصبع الثاني، تحديد الذيل بين قاعدة اليد والإصبع الرابع والخامس.
  6. حقن 0.1 مل (= 1 ملغ تاموكسيفين) الحل إينترابيريتونيلي في الربع السفلي الأيمن من البطن.
  7. تكرار الحقن في اليومين الثاني والثالث.

8-تنظيم دورات تعريفية للجينات تعتمد على التتراسكلين أو شرنا التعبير

تنبيه: قد تكون الدوكسي الضارة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

ملاحظة: اعتماداً على نوع ومدة التجربة، الدوكسيسيكلين يمكن توفيره في مياه الشرب (الخطوة 8، 1) أو تشاو (الخطوة 8.2)

  1. لإجراء التجارب على المدى القصير (< 10 أيام) إدارة الدوكسي عبر مياه الشرب باستخدام البروتوكول التالية.
    1. حل السكروز 5 غ في 100 مل ماء الصنبور. اﻷوتوكﻻف.
    2. حل 100 مغ من الدوكسيسيكلين-هيكلاتي في 5 مل محلول السكروز (الخطوة 8.1.1) في أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. استخدام حقنه 10 مل، تصفية العقيمة الحل عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. إضافة إلى محلول السكروز إعدادها في الخطوة 8.1.1.
    4. إمداد محلول السكروز الدوكسي كمياه الشرب للماوس. تحقق يوميا واستبدال عندما يصبح الحل غائم تشير إلى فرط البكتيرية (استبدال الحل واضح بعد ثلاثة أيام على أقصى تقدير).
  2. لإجراء التجارب على المدى الطويل (> 10 أيام) أو تجارب الحساسية للتغيرات الاستقلابية، استخدم الدوكسي التجارية-تشو (مثلاً، الدوكسيسيكلين هيكلاتي تشو 0.625 غ/كغ) لتجنب الجفاف و/أو التغيرات التي يسببها السكروز في كبد الحيوانات المعالجة.

9-إعداد الماوس الكبد للتحليل حسب إيمونوستينينج

تنبيه: بارافورمالدهيد قد تكون ضارة. يرجى الرجوع إلى صحيفة بيانات السلامة.

ملاحظة: تيميبوينت عند الفئران وسيتم تحليل يعتمد على التجربة. من المستحسن لتحليل أنسجة الكبد بعد لا يقل عن ثلاثة أيام معاملة الدوكسي ضمان تعريفية كافية للتعبير التحوير أو شرنا.

  1. إعداد 1 مل حقنه بإبرة ز 27 مع 1 مل محلول بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين).
  2. Euthanize الماوس بطريقة مناسبة وفقا لوضع بروتوكول حيوانية معتمدة.
    ملاحظة: قد تختلف عن المبادئ التوجيهية للأساليب المناسبة للقتل الرحيم المؤسسة.
  3. باستخدام مقص تشريح والملقط التشريحية، بعناية فتح تجويف البطن فتح البطن وسيط لفضح الكبد. تحريك الأمعاء بالحق في فضح الوريد البابي والاجوف فينا أدنى (IVC).
  4. أدخل إبرة المحاقن استعداد (راجع الخطوة 9، 1) في IVC وقطع الوريد البابي. حقن 1 مل من منهاج عمل بيجين ببطء في IVC نتخلل نسيج الكبد وإزالة خلايا الدم الحمراء الفلورسنت السيارات (مرغوب فيه إذا كان سيتم إجراء تلطيخ إيممونوفلوريسسينت).
  5. إزالة الكبد. شطف في الماء ونقل إلى 5 – 10 مل محلول منهاج العمل 4%.
  6. لمقاطع البارافين، إصلاح الأنسجة ل h. 36 – 48 الأنسجة جاهزة للجفاف وتضمينها البارافين.
  7. للمقاطع المجمدة، إصلاح الأنسجة في 4% منهاج عمل بيجين ح 1.
    1. كريوبروتيكشن، نقل إلى محلول السكروز 10%. احتضان 60 دقيقة.
    2. نقل إلى محلول السكروز 20%. احتضان 60 دقيقة.
    3. نقل إلى محلول السكروز 30%. احتضان 12 – 16 حاء Embed في تضمين مجمع للأجزاء المجمدة، وتجميد في-20 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فعالية تعداء بحقن الوريد هيدرودينامية الذيل: النسبة المئوية لخلايا الكبد مورين التي هي ترانسفيكتيد هيدروديناميكالي بحقنه واحدة هو متغير ويعتمد على معلمات متعددة مثل حجم الحقن، حقن الوقت، كمية من حقن الحمض النووي، وحجم بناء حقن6، ،من 2223. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة تعداء أقل بصفة عامة في الحيوانات الكبيرة، حيث أكبر قطر الأوعية الدموية، فضلا عن منطقة جيبية أكبر يؤدي إلى انخفاض في الض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعداء لخلايا الكبد مع حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبح أسلوب المنشأة منذ إطلاقها منذ أكثر من 15 عاماً6. حجم حقن يتجاوز الناتج القلب ويتدفق من الأجوف فينا أقل شأنا في الجيوب من الكبد7، مما يؤدي إلى تعداء حوالي 10-20%، وفي بعض الحالات تصل إلى 40 في المائة من خلايا الكبد،من2526. تنبئ تعداء الناجحة هي حجم حقن كل الوقت حقن22،23. ومن ثم، كفاءة تعداء منخفضة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل Deutsche كريبشيلفي، ألمانيا (رقم المنحة 111289 لرق)، ولوسيل باكارد لصحة الأطفال (إرنست واميليا جالو وهبت ما بعد الدكتوراه زمالة-كتسا المنحة رقم UL1 RR025744 لرق). ونشكر الدكتور مارك أ كاي لناقلات الأمراض بنيات ودعم المشورة التجريبية والدكتور جوليان حكيم للفئران والتجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>مادة عامة< / قوي>
GeneRuler 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويثيرمو فيشر#SM1331الحمض النووي للرحلان الكهربائي
Tissue-Tek O.C.T.ساكورا4583تضمين أقسام التبريد
Biozym LE AgaroseBiozym840004
بروميد الإيثيديومسيجما-ألدريتشE7637-1G
D (+) -SaccharoseCarlRoth 4621.1لتحلية محلول الدوكسيسيلين
ملح الصوديوم AmpicillinAppliChemA0839،0010لاختيار
LB Agar (Luria / Miller)Carl RothX969.1
LB Broth (Luria / Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. متوسطفيشر15544034
جنتاميسين كبريتاتAppliChemA1492،0001لاختيار المستنسخة المقاومة للجنتاميسين
Roti-Histofix 4٪Fa. RothP087.6محلول paraformaldehyde
يحتوي T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen / ThermoFisher11791-020على مزيج إنزيم LR-clonase II والخلايا المختصة
Thermo Fisher11782-018
Stbl3 المختصة كيميائيا الإشريكية القولونيةالحرارية فيشرC737303
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction Enzymes
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
kits
QIAquick Gel ExtractionQiagen28704لاستخراج الحمض النووي من هلام
NucleoSpin Gel و PCR Clean UpMacherey & ناجل740609.10
NucleoBond PC20Macherey & أمبير Nagel740571استخراج البلازميد (Mini prep)
NucleoBond PC500Macherey & amp Nagel740574استخراج البلازميد (Maxi prep)
Phusion عالي الدقة DNA PolymeraseThermo FisherF530S
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments
مواد لتجارب الفئران< / قوي>
حقنة إنجيكت F 1 ملبراون9166017Vللحقن داخل الصفاق
أومنيفيكس لوير 3 ملبراون4616025 فولتللحقن الوريدي
قنية ستريكان 24 جيبراون4657675
ستيريكان كانولا 27 جيبراون4657705
تاموكسيفينسيجما ألدريتشT5648-1Gلتنشيط CreER
زيت الذرةSigma-AldrichC8267-500MLحامل لحقن التاموكسيفين
Doxycycline hyclateAppliChemA2951،0025تنشيط التعبير المعتمد على التتراسيكلين
Injekt 10 مل حقنةبراون4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831،826،001لترشيح الدوكسيسيكلين
كلوريد الصوديوم 0،9٪براون3200905الناقل للحقن في الوريد
Falcon Conical Tube 50mlCorning Life Science352095
مصباح الأشعة تحت الحمراءN / AN / Aلتسخين ذيل الفأر
IVISPerkin Elmer124262في الجسم الحي نظام
التصوير Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments
Plasmids لاستنساخ ناقلات الينقولات الجميلة النائمة ل HTVI.
pTCn / aVector للتعبير الجيني التأسيسي ، المرجع 15
pEN_TTmcsAddgene # 25755متجه الدخول للتعبير الجيني المحفز ، المرجع 19
pEN_TTGmiRc2Addgene # 25753متجه الإدخال لتعبير miR-shRNA المحفز مع التعبير المشترك ل GFP ، المرجع 19
pEN_TTmiRc2Addgene # 25752متجه الإدخال لتعبير miR-shRNA المحفز بدون تعبير مشترك عن GFP ، المرجع 19
pTC ApoE-TetAddgene # 85578متجه التعبير للجين المحفز أو تعبير miR-shRNA مع ApoE.HCR.hAAT promotor ، المرجع 11
pTC-CMV-TetAddgene # 85577ناقل التعبير للجين المحفز أو تعبير miR-shRNA مع محرك CMV ، المرجع 11
سلم المستنسخة المقاومة ل Amp الحرارة Kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236(2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029(2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50(2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894(2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936(2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79(2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023(2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sleeping Beauty CreER

مقالات ذات صلة