مقالة منهجية

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

15.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56615

⸱

ديسمبر 8, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن نقدم بروتوكول لثقافة 3D من الفئران الخلايا إطلاق المستمدة من الدماغ، بما في ذلك أستروسيتيس، ميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. نظهر ثقافة الخلية الأولية وحمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) هيدروجيل التوليف وتغليف هامافوتو--البلمرة وخلية وعينه تجهيز للتصوير المجهري الإلكترون [كنفوكل] والمسح.

الملخص

في الجهاز العصبي المركزي وعديدة الإصابات الحادة واضطرابات الأعصاب، كذلك مزروع الأجهزة أو المواد الحيوية هندسيا لتعزيز وظيفة تؤدي إلى نفس النتيجة: التهاب الزائدة يؤدي إلى الدباق، سيتوتوكسيسيتي، و/أو تشكيل ندبة الدبقية جماعياً إلى تفاقم الإصابة أو منع الاسترداد صحية. بقصد إنشاء نظام نموذجي ندبة الدبقية تشكيل ودراسة العمليات التحريضية، ونحن قد ولدت سقالة خلية 3D قادرة على السكن الأساسي استزراع الخلايا الدبقية: microglia التي تنظم استجابة جسم غريب، والشروع الحدث التحريضية و astrocytes التي تستجيب لتشكيل ندبة ليفية أوليجوديندروسيتيس التي تكون عادة عرضه للإصابة التحريضية. هذا العمل يوفر طريقة مفصلة خطوة بخطوة لتصنيع، والثقافة، وتوصيف مجهرية من السقالة على أساس حمض الهيالورونيك 3D المائية مع الفئران مغلفة الخلايا الدبقية المستمدة من الدماغ. علاوة على ذلك، أظهرت البروتوكولات لتوصيف تغليف الخلية والسقالة المائية [كنفوكل] الفلورة والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني، فضلا عن القدرة على تعديل السقالة مع ركائز النشطة بيولوجيا، مع إدراج خليط تجاري الصفيحة القاعدية لدمج الخلية المحسنة.

المقدمة

التهاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ فترة طويلة تعتبر من السمات مميزة لالحاده (مثلاً، والسكتة الدماغية، والدماغ وإصابات النخاع الشوكي) والمزمنة (مثل الزهايمر، باركنسون 's، والأمراض هنتنغتون) إصابة الجهاز العصبي المركزي، ولكن يتزايد الاعتراف كمساهم سببية للأعصاب والاضطرابات العصبية. استمرار أو التهاب غير ملائمة يمكن أن تسبب الإصابة العصبية وديمييلينيشن (مثل التصلب المتعدد)، وتؤثر سلبا على نمو الدماغ (مثلالفصام والتوحد) والدول المزاج (مثلاً، والاكتئاب والقلق ، الهوس الاكتئابي). علاوة على ذلك، رواية استراتيجيات علاجية باستخدام الأجهزة القابلة للغرس (مثلاً.،2،،الدماغ-الكمبيوتر-واجهات13، الدماغ العميق تحفيز4،5، إينتراسبينال ميكروستيموليشن6،،من78،،من910) توليد استجابة التهابات يمكن التنبؤ بها في مجال التفاعل بين الجهاز والجهاز العصبي المركزي مما أدى إلى استجابة الأنسجة الواقية التي يمكن أن تسبب خسارة عدم فعالية أو الجهاز على مدى عمر زرع11. التهاب في الجهاز العصبي المركزي هو عادة بدأتها microglia، التي تعمل كخلايا محصنة ضد المقيمين من الجهاز العصبي المركزي مسؤولاً عن مراقبة الأنسجة واستجابة جسم غريب (استعرضت12). اعتماداً على شدة إهانة، إشارة microglia وتجنيد إضافية الخلية أنواع إلى موقع إصابة. على وجه التحديد، microglia تنشيط أستروسيتيس، التي بدورها تعمل كخلايا الالتهابات الثانوية وشكل حاجزاً واقيا كثيفة تحتوي13،موقع إصابة14. يمكن أيضا بدء Microglia تتالي نشاط في خلايا النظام المناعي الطرفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى انهيار BBB السماح بتسلل المناعية (إعادة النظر في مرجع15).

في حالة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي، قد تلف الأنسجة الناتجة عن الإدراج الجهاز، فضلا عن استمرار وجود الجهاز الخارجية البدء في عملية تسمى تندب الدبقية. في هذه العملية، وتهاجر إلى microglia وتتكاثر في موقع الإصابة. أنها أيضا بدء الإفراج عن العوامل المثيرة لتحييد التهديدات المحتملة وتجنيد الخلايا الدبقية إضافية. وفي وقت لاحق، astrocytes المنشط تصبح الضخامي والبدء في تغليف الجهاز مزروع شكل جدار ليفي مستمر16. يشير إلى التهاب يخدم أيضا لتشجيع انسحاب عمليات العصبية من المناطق المحيطة بعملية الزرع والمجندين في نهاية المطاف الليفية لتعزيز ندبة الدبقية النامية17. أوليجوديندروسيتيس، المسؤولة عن اﻷغماد العصبية في المايلين لتعزيز الموصلية، لا ينجون من هذه العملية ويتم تقسيم الخلايا البعيدة من الزرع ب ندبة18. تندب الدبقية إلى حد كبير يقلل من الدالة وعمر الأجهزة مزروع، خاصة بالنسبة لتسجيل كهربائي، ويخدم في نهاية المطاف إلى الحد من الأداء الوظيفي لواجهات العصبية19.

استغلوا عدة نهج لزيادة توافق مع الحياة والنشاط واجهة الأجهزة مزروع في الجهاز العصبي المركزي20،21،،من2223. استعراض مستفيض يتوفر على تصميم متوافق حيويا لهذه الواجهات العصبية24. وتشمل الاستراتيجيات الأكثر بروزا المحيطة بالقطب مع الطلاء متوافق مثل بولييلثيلينيجليكول (شماعة)، أحماض اللبنيك-co-الجليكوليك (بلجا)25، أو تعزيز مسرى مع البوليمرات الموصلة مثل بولي (الإيثيلين ديوكسيثيوفيني) (بيدوت)، وبوليبيرولي (بي)26،27،،من2829،،من3031. كما استخدمت الطلاء النشطة بيولوجيا توفير إشارات لنمو الأنسجة العصبية باستخدام يغاندس المستمدة من مصفوفات خارج الخلية، بما في ذلك كولاجينس، فيبرونيكتينس، والأحماض هيالورونيك32،33،34 ،35،،من3637. تم استكشاف بيواكتيفيتي هذه الطلاءات كذلك مع نظم الإفراج عن عامل النمو لمحاكاة الخلية الطبيعية إفرازات30،38،39،،من4041 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50-في نفس الوقت، اختارت بعض المجموعات البحثية لإعادة الهندسة الكهربائي، والمرونة، وتكوين لتقليل عدم تطابق الميكانيكية بين الأجهزة والأنسجة51،52،53 ،،من5455،،من5657. بالإجمال، هذه الاستراتيجيات قد تؤدي إلى العديد من التحسينات الواعدة في الجيل التالي من الأجهزة السطح البيني العصبية، لكن التوافق طويلة الأجل قضية مستمرة، وقد أعاقت التقدم بنماذج معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً في فيفو .

يمكن أن تحد من الإنتاجية التجريبية النهج المستندة إلى نموذج الحيوان وزيادة تكاليف اختبار توافق مع الحياة القطب. في المختبر نهج استخدام زراعة الخلايا التقليدية تقنيات تقديم بديل أكثر فعالية من حيث تكلفة، لكنهم فشلوا في تلخيص الكثير من تعقيد التفاعل بين الأجهزة والأنسجة58. على وجه الخصوص، اختبار سطح الطلاء باستخدام حدود الثقافة الخلية 2D النمذجة للهندسة الكهربائي وتأثير عدم تطابق الميكانيكية وميكروموشن ويعتقد أن يسهم في توليد استجابة مضيف تسهم في فشل الجهاز59 , 60.

للتغلب على المشاكل المرتبطة بثقافة الخلية 2D، وضعت الثقافات المائية للخلايا العصبية لمجموعة واسعة من التطبيقات،61من الدراسات الدوائية، لتوجيه الخلايا العصبية التمايز62، لفهم الأمراض 63،مسارات64، أو الطبقات في ثقافة المشارك مع أنواع أخرى من الخلية إلى نموذج الهجرة الخلية، نيوروبروتيكشن، أو إلى نموذج الأنسجة ميكرونفيرونمينتس61. الهلاميات المائية تشكل سهولة في أحجام مختلفة وهندستها يمكن إدراج أنواع عديدة من الثقافات الخلية الأولية أو مخلدة، وهي الغاية قابلة للتحليل باستخدام تقنيات شائعة الاستخدام مثل الأسفار [كنفوكل] مجهرية. لإنشاء نموذج لعملية تندب الدبقية، لدينا مؤخرا نمواً ووصفت نظام هيدروجيل 3D على أساس حمض الهيالورونيك لاختبار الفائق لاستجابة الدبقية لأقطاب مزروع (الشكل 1)65. وهذا النظام له العديد من المزايا المتميزة: 1) يتم تغليف الخلايا الدبقية الأولية (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) في مصفوفة ثلاثية الأبعاد تتكون من بوليمرات حمض الهيالورونيك، وعنصر مصفوفة خارج الخلية ذاتية؛ 2) تصلب مصفوفة يمكن 'ضبطها' لإعادة إنشاء الخواص الميكانيكية للدماغ أو أنسجة النخاع الشوكي؛ و 3) يمكن تغليف الخلايا في المصفوفة في نهج أعلى مقاعد البدلاء سريع باستخدام فوتوبوليميريزيشن مع الضوء الأخضر، الحد من السمية أثناء التغليف. هذا النظام يتيح للملامح الرئيسية في فيفو توافق مع الحياة: أجهزة تندس في المائية بطريقة مماثلة للأنسجة، ويتم رصد الاستجابة الخلوية للأجهزة مزروع لمجموعة واسعة من المعلمات65. وتشمل هذه الميكانيكية يوجد عدم تطابق بين الأجهزة والدهانات المائية من مختلف الهياكل والبقول التحفيز الكهربائي. ويشمل هذا النظام أيضا oligodendrocyte والسلائف المتصلة بها، والتي غالباً ما تكون الحاضرة والمعينين في ندوب الدبقية. بهم الضرر والموت البلعمه من microglia عاليا يدل على الإصابة التحريضية ونموذج تخفيض تندب أو الاسترداد، لديهم القدرة على إثبات re-مييلينيشن من الخلايا العصبية66.

وهنا يصف لنا أسلوباً للتوليف وتشكيل هجين حمض الهيالورونيك الهلاميات المائية جنبا إلى جنب مع تركيبات الغشاء متاحة تجارياً لتحسين إدماج خلية. علاوة على ذلك، سوف نظهر إدراج الخلايا الدبقية مثقف الابتدائي (ميكروجليا وأستروسيتيس و oligodendrocytes) وتحليل لنمو ثقافة استخدام إيمونوسيتوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأقر البروتوكول لاستخراج أنسجة الدماغ من الجراء الفئران "سبراغ داولي" يوم 1، euthanized بقطع الرأس، العناية بالحيوان واستخدام اللجنة في جامعة ألبرتا.

1-Microglia والعزلة أستروسيتي67،68

ملاحظة: جميع وسائل الإعلام لعزل وزراعة الخلايا هو يسخن إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. وقد هانك لحل متوازن الملح (حبس) 1% البنسلين-ستربتوميسين (PS). تعديل جميع دولبيكو النسور مع F12 في لحم الخنزير وتستكمل مزيج المغذيات (DMEM/F12) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين-ستربتوميسين (PS). وتفتقر إلى خلائط فقط مع التربسين FBS. جميع المواد في هذا البروتوكول العقيمة (تصفية، الكحول، التي تم شراؤها، ويعقم) ويتم تنفيذ كل خطوة بعد خطوة رقم 1.8 في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع تقنية العقيم.

  1. كل الدماغ، قبل الحرارة 15 مل من حبس و 12.5 مل DMEM/F12 إلى 37 درجة مئوية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل، وحوالي 2 مل من التربسين 0.25% مع حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. الحرارة 25 مل إضافية من DMEM/F12. التربسين الحارة السابقة حوالي 10 دقيقة استخدامها لمنع فقدان النشاط الأنزيمي.
  2. صب ما يكفي حبس الحارة في 6 العقيمة، وأطباق الثقافة 10 سم لتغطية السطح. تحضير طبق 10 سم واحد لكل العقول اثنين زائد صحن إضافي 6 سم.
  3. ضع العقول تصل إلى 2 في كل طبق2 10 سم (الشكل 2A).
  4. تحت مجهر تشريح، استخدم الملقط منحنية ومستقيمة لفصل كورتيسيس على طول خط الوسط، والمخيخ مع جذع الدماغ. وهذا غلة ثلاثة أقسام من الأنسجة في الدماغ (الشكل 2).
  5. قشر طبقة رقيقة، شبه شفافة، (السحايا) من الأنسجة التي تحتوي على الأوعية الدموية من كل قسم الأنسجة والمرتجع، نقل الأنسجة المتبقية في صحن ثقافة منفصلة. فهم طبقات رقيقة كشفها بواسطة التخفيضات الأنسجة، مع الملقط، وسحب بعناية حتى أجزاء رئيسية هي 'تتدلى' أنسجة المخ. وأخيراً قم بإزالة هذا الجزء التي تشيد بلطف. انظر الشكل 2--2E لصور الممثل من قبل وأثناء وبعد هذه الخطوة.
  6. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إزالة حبس المتبقية من طبق الثقافة، الاحتفاظ بعناية في الأنسجة. مسرات الأنسجة مع مشرط ونقل الأنسجة إلى أنبوب المعالجون مسبقاً 15 مل مع التربسين.
  7. احتضان هذا الأنبوب لمدة 25 دقيقة في حمام 37 درجة مئوية لهضم الأنسجة انزيماتيكالي.
  8. الطرد المركزي الأنبوب إلى أسفل في ز 500 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية.
  9. استخدام ماصة 10 مل مصلية، إضافة 10 مل من دميم الحارة/F12 لإلغاء تنشيط التربسين وتريتوراتي الحل 5 مرات تفكك النسيج.
  10. الطرد المركزي الأنبوب إلى أسفل في ز 500 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية.
  11. استخدام ماصة 10 مل مصلية، إعادة تعليق بيليه إلى 10 مل من DMEM/F12 الحارة ونقل الحل إلى 50 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي.
  12. باستخدام حقنه 10 مل مع إبرة قياس 18، تريتوراتي الحل 3 مرات.
  13. توزيع هذا الحل في زيادات بمقدار 12.5 مل من الحارة DMEM/F12 كل الدماغ.
  14. ماصة زيادات 1 مل الحل يسحق في 12 لوحة جيدا (1 في الدماغ).
  15. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2في حاضنة ثقافة خلية هوميديفيد. استبدال وسائط الإعلام بعد ثلاثة أيام، وتحديث وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام لاحقة. وبعد أسبوعين، يمكن جمع الخلايا للتجارب.

2-ماكرومير التوليف69

  1. تزن 375 ملغ ملح حمض الهيالورونيك (ها) في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وإضافة 37.5 مل ماء المقطر.
  2. مسح الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة و sonicate الخليط حتى تظهر متجانسة ويفقد اللزوجة مثل جل به. قد تستغرق هذه العملية ح 6.
  3. حل نقل كوب 100 مل مع المغناطيسية يقلب بار (38 مم)، ويقلب بشدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. عناية تيتراتي 5.0 M هيدروكسيد الصوديوم في خلط هكتار والتدبير مع ورقة pH حتى تستقر درجة الحموضة بين 8 و 12.
  5. جمع 3 مل الخل ميثاكريليك الطازجة (ماجستير، 94%)، غطت النيتروجين أثناء التخزين.
    ملاحظة: ما يتعرض إلى الغلاف الجوي لفترات طويلة (أيام)، سوف تفقد مفاعليه.
    تنبيه: ينبغي استخدام جميع ما في غطاء دخان.
  6. إضافة 200 ميليلتر من MA في حل ها خلط. أن رد الفعل يخفض الرقم الهيدروجيني للحل أدناه 8.
  7. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6 حتى 3 مل ما قد أضيفت إلى الحل. قد تستغرق هذه العملية ما يصل إلى 1-2 س.
  8. السماح بأن رد الفعل على تواصل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، دون خلط.
  9. نقل الحل إلى 400 مل إيثانول البارد (EtOH) في كوب 500 مل والسماح لهطول الأمطار ح 24-72 في 4 درجات مئوية. 56
  10. عناية صب الجزء الأكبر من الحل في كوب منفصلة للتخلص منها، وجمع متسرعا في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. وقد توزع هذا في أنابيب 2-4، إذا لزم الأمر.
  11. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 200 غ س في أجهزة الطرد مركزي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة طافية.
  12. أعلى الأنبوب مع EtOH الباردة ومزيج الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة، وكرر الخطوة 2، 10-2.11.
  13. إضافة 25 مل مياه المعقمة، ومزيج الحل مع فورتيكسير لمدة 1 دقيقة، sonicate (> 20 كيلو هرتز) ح 1، واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  14. ضع الحل في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى تجمد أو تجميد فلاش في نيتروجين سائل.
    تنبيه: عند استخدام النتروجين السائل، استخدام قفازات واقية ودرع وجه، وساحة.
  15. تجميد الجافة الأنبوب (أقل من 0.1 من [مبر] و-30 درجة مئوية) ح 24-48 حتى يتم إنتاج مسحوق مثل الثلج.
  16. في هذه المرحلة، اختبار العينة للنقاء عن طريق الرنين المغناطيسي النووي 1ح، حيث يمكن تأكيد مقدار البروتونات ميثاكريلات (قمم في جزء في المليون 6.1 و 5.6)، بالنسبة للبروتونات الميثيل (1.9 جزء في المليون)، في العمود الفقري هكتار. مقبول بنسبة 95% ميثاكريلات الميثيل البروتونات إلى الحد أدنى. 69

3-هلام تشكيل وتغليف 3D65

  1. ساترة وإعداد العفن
    1. جعل حل مياه 50 مل المقطر 2% 3--(تريميثوكسيسيليل) ميثاكريلات روبيل في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    2. ضع كوفيرسليبس الزجاج 18 ملم في الحل والصخور ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ما يصل إلى 50 كوفيرسليبس يمكن إضافتها في وقت واحد.
    3. أشطف كوفيرسليبس بالتسلسل غمس كل في 3 قنينة ماء منزوع 100 مل.
    4. الجاف كوفيرسليبس في فراغ عند 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع مجففة والفرن.
    5. تزج بسرعة كوفيرسليبس الفردية في 70% EtOH مع الملقط.
    6. دون التجفيف، وإسقاط كل ساترة في بئر 12 لوحة جيدا.
    7. أغسل ونضح كل بئر بالمياه المعقمة (1 مل كل بئر).
    8. أضف 1 مل من العقيمة 2 ميكروغرام/mL بولي-L-يسين (PLL) لكل بئر واحتضانها > ح 2.
    9. نضح PLL الحل والسماح كوفيرسليبس للهواء الجاف.
    10. تزج قوالب siloxane (PDMS) بوليديميثيل (انظر الشكل 1) في 70% EtOH، ومكان واحد عند مركز كل ساترة، والسماح للهواء الجاف وإنشاء ختم بين العفن والزجاج.
      1. إعداد قوالب PDMS بالصب PDMS مواده الكواشف بنسبة 10:1 في طبق البوليستيرين مغلوطاً. يتم تحديد كمية PDMS أعدت تسفر عن ورقة سميكة حوالي 1 مم. لنموذج الآبار في PDMS، قص الأوراق لكمه دائرة مع قطر داخلي من 10.
  2. إعداد الخلية
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول مع تقنية عقيمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. يتم ضبط الحل (PBS) المالحة الفوسفات مخزنة على درجة الحموضة 7.4 لكل الخطوات.
    1. تحديث 24 ساعة قبل التغليف خلية في حماة، متوسطة لمدة 2 أسبوع الثقافات الأولية (من الخطوة 1، 15) في لوحات 12 جيدا. أضف 1 مل من DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS) متوسطة كل بئر.
    2. لكل لوحة 12-جيدا من الخلايا وإعداد 12.5 مل من تمييع التربسين (0.25% التربسين-يدتا مخففة 30% مع وسائط الإعلام DMEM/F12)، و 25 مل DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS) والحارة في عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    3. جمع المتوسطة مكيفة من لوحات ماصة 10 مل مصلية (> 0.5 مل في البئر) باستخدام دقة نضح السائل المتبقية واستبدال مع 1 مل الواحد من تمييع التربسين (0.075% التربسين-يدتا) لمدة 20-30 دقيقة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) جيدا حتى طبقة الخلايا المتلاقية يفصل من اللوحة.
    4. استرداد مواد الخلية مع وقف التنفيذ مع ماصة 1 مل (يظهر كقطعة عائمة واحدة) وجمع في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. مخفف مع حجم مكافئ من DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS)، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع تجاهل المادة طافية.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل الحارة DMEM/F12 (10% FBS و 1% PS)، تريتوراتي الخلايا 5 مرات مع ماصة 10 مل، والطرد المركزي في 200 غ س ل 2 دقيقة.
    6. صب المادة طافية، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل الحارة DMEM/F12، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    7. باستخدام حقنه 10 مل بإبرة قياس 18، تريتوراتي الحل خلية 3 مرات، وتصفية التعليق من خلال غربال خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي أجهزة الطرد مركزي جديدة.
    8. جمع 10 ميليلتر من تعليق خلية، وتمييع 1: 100 في الحارة DMEM/F12، وحساب عدد الخلايا مع عداد الآلي خلية
    9. احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى خطوة تغليف.
  3. تغليف خلية
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول مع تقنية عقيمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    1. لكل لوحة 12-جيدا من 3D الحارة الهلاميات المائية 12.5 مل من DMEM/F12 و 12.5 مل من وسائط الإعلام DMEM/F12 المكيفة التي تم جمعها أثناء إعداد الخلية.
    2. وزن الكمية حمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) المطلوبة لحل نهائي تركيز 0.5% wt/المجلد حماة هذا في برنامج تلفزيوني تم تصفيتها العقيمة بتركيز (wt/المجلد 2%)؛ ويستخدم بتركيز أعلى 4 مرات من تركيز النهائي لاستيعاب إضافة الخلايا وغيرها الكواشف. واحد يتطلب 12 لوحة جيدا من الهلاميات المائية ~ 350 ميليلتر برنامج تلفزيوني مع 7 مغ حماة.
    3. Sonicate (> 20 كيلو هرتز) الحلول حتى يذوب حماة تماما لمدة 60 دقيقة.
    4. إعداد الحلول الفردية 10% من ثلاثي إيثانول أمين (الشاي) و 1-الفينيل-2-بيروليدينوني (النيفيرابين)، وحل 1 مم من ثم Y (EY) في مختبرين 1 مل من pH PBS العقيمة 7.4.
    5. للوحة واحدة 12 أيضا، جعل خليط نهائي 1.4 مل من 1 × 107 الخلايا، 0.5% wt/المجلد حماة (350 ميليلتر من 2% wt/المجلد)، 0.1% الشاي (14 ميليلتر من 10 ٪)، 0.1% النيفيرابين (14 ميليلتر من 10 ٪)، و 0.01 ملم EY (14 ميليلتر من 1 مم) ، ونسبة 20% الصفيحة القاعدية خليط (280 ميليلتر للأوراق المالية). حجم المتبقية من برنامج تلفزيوني.
    6. بلطف مزيج الحل و "الماصة؛" 100 ميليلتر إلى كل العفن PDMS مع تلميح 1 مل.
    7. تعرض عينات لضوء LED عالية كثافة خضراء (~ 520 نانومتر، 60 ميغاواط، في مغلقة 20 سم × 20 سم × 20 سم مربع) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 1 مل كل بئر الحارة مكيفة DMEM/F12 إلى لوحة جيدا 12.
    9. فهم كل ساترة بين الإبهام والسبابة، ببطء تقشر العفن PDMS مع منحنى ملاقط مع الحرص على عدم تشريد الهلام، ووضعه في بئر مع المتوسطة مكيفة.
    10. إضافة 1 مل إضافية الحارة DMEM/F12 لكل بئر.
    11. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة أسبوعين، تحديث خلية وسائل الإعلام كل أسبوع حسب 1 مل بيبيتينج لوسائل الإعلام من كل الآبار واستبدال مع 1 مل DMEM/F12.

4-الفحص المجهري

  1. إيمونوسيتوتشيميستري
    ملاحظة: استخدمت مجهر مقلوب [كنفوكل] صورة هذه العينات واستخدمت إيماجيج للعملية وعرض الصور. وسوف يكون المسمى Microglia، أستروسيتيس، oligodendrocytes، ونوى، بعد 3 أسابيع في حماة الثقافة.
    1. يسخن 10% مخزنة في برنامج تلفزيوني الفورمالين (pH 7.0) في حمام 37 درجة مئوية.
      تنبيه: على الرغم من أن يمكن استخدام الفورمالين خارج غطاء دخان، هذه المواد المتفاعلة مع الأنسجة، وينبغي أن يكون التعامل مع الرعاية والقفازات دائماً. وينبغي أن يتصرف بشكل منفصل.
    2. عناية نضح وسائل الإعلام من لوحات وماصة 1 مل فورمالين 10% لكل بئر.
    3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2 لمدة 20 دقيقة.
    4. نضح السائل من كل لوحة، "الماصة؛" 2 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) في كل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
    5. كرر الخطوة 4.1.4 مرتين.
    6. نضح السائل من اللوحات وإضافة 1 مل كل من برنامج تلفزيوني جيدا مع 10% مصل الحصان العادي (NHS) و 0.5% triton X-100 روك برفق في السرعة الحد الأدنى) ح 1.
    7. كرر الخطوة 4.1.4 ثلاث مرات.
    8. نضح السائل وإضافة 1 مل كل بئر في خليط التالية في برنامج تلفزيوني: أرنب المتأين الكالسيوم-ربط محول جزيء (Iba1) 1:1، 000، الدجاج بروتين فيبريلاري الدبقية (توصيني) 1:5، 000، الماوس 2 '، 3'-دوري-نوسيلوتيدي 3-فوفوديستيراسي (كنباسي) 1:1، 000، 1% دائرة الصحة الوطنية ، والخلية 0.1% تثقيب الفاعل. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، هزاز اللوحة بلطف قدر الإمكان.
    9. كرر الخطوة 4.1.4 ثلاث مرات مع إينكوباتيونس ح 1 بين بين.
    10. نضح السائل وإضافة 1 مل الواحد من المخلوط التالي جيدا في برنامج تلفزيوني: 647 نانومتر متحمس حمار جسم الأرنب المضادة 1: 200، 546 نانومتر متحمس الماعز الأجسام المضادة الدجاج 1: 200، 488 نانومتر متحمس حمار الماوس المضادة الأجسام المضادة 1: 200، 1% دائرة الصحة الوطنية، والأزرق 1:1,000 النووية وصمة عار. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1، تعصف بلطف اللوحة.
    11. كرر الخطوة 4 ثلاث مرات مع إينكوبيشنز ح 1 بين بين.
    12. للاحتفاظ الهلاميات المائية، نضح المخزن المؤقت، وتزج لهم في 0.5 مل من الخلية تصاعد المتوسطة لدقيقة 1 ماصة بالمتوسط تصاعد بلطف ضع ساترة على رأس الجل، خلق طبقة بين الزجاج. إضافة كمية صغيرة من تصاعد المتوسطة إلى جانب الكشف عن كوفيرسليبس لمنع تجفيف المائية.
      ملاحظة: لأغراض استكشاف الأخطاء وإصلاحها، يمكن تصويرها المواد الهلامية في خطوة 4.1.11. لمشاهدة العلامات المناسبة قبل إجراء مزيد من المعالجة.
  2. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)
    ملاحظة: استخدمت المسح الإلكتروني المجهري لتصور المائية، صورة هذه العينات.
    1. قبل تسخين خليط مثبت من بارافورمالدهيد 2.5 ٪ glutaraldehyde و 2 في المائة في برنامج تلفزيوني (0.1 M) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      تنبيه: هذه الكواشف هي شديدة التفاعل مع الأنسجة، وينبغي التعامل معها بعناية والقفازات. وينبغي التعامل معها في غطاء دخان قدر الإمكان والتخلص منها بشكل منفصل.
    2. نضح المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية وإضافة 1 مل خليط مثبت مسبقاً ساخنة.
    3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2 لمدة 20 دقيقة.
    4. وضع اللوحات في 4 درجات مئوية (ثلاجة/برودة) بين عشية وضحاها.
    5. نضح الحل مثبت من الآبار وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    6. نضح السائل من كل لوحة، وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
    7. كرر الخطوة 4.2.6 مرتين أخريين.
    8. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 1% أوزميوم تيتراوكسيدي مخزنة في برنامج تلفزيوني لكل بئر.
      ملاحظة: حتى يتم تجفيف العينات، يتم إجراء هذه الخطوة وكل الخطوات اللاحقة في غطاء دخان.
    9. السماح بالتثبيت تحدث لبخار أوزميوم 30 دقيقة من السائل يمكن إصلاح العينات الأخرى في نفس اللوحة؛ ولذلك، تقسيم العينات تبعاً لذلك قبل هذه الخطوة.
      تنبيه: تيتراوكسيدي أوزميوم درجة عالية من التفاعلية مع الأنسجة ومتقلبة. أنه أمر خطير وينبغي التعامل معها في غطاء الدخان مع القفازات. وأي فورا غسلها ينبغي أن يتم التخلص منها بشكل منفصل.
    10. كرر الخطوة 4.2.6 ثلاث مرات.
    11. نضح السائل وأضف الخلائط التجفيف في القائمة أدناه، حسب الترتيب، واحتضان (درجة حرارة الغرفة) للوقت المشار إليه. ابدأ بالتدريج إضافة الإيثانول (EtOH) ثم يتبع هيكساميثيلديسيلازاني (همدس). انظر الجدول 2 لكل زيادة.
      ملاحظة: عند إضافة همدس، كوفيرسليبس يمكن بشدة التمسك بالبلاستيك وأصبحت صعبة للغاية لإزالة. يمكن منع هذا بوضع منصة بلاستيكية صغيرة تحت زلة الزجاج بعد التطبيق الأول من همدس. بعد الاحتضان EtOH الثانية، يمكن أخذ العينة ومروى في النتروجين السائل لبضع ثوان لتجميد كسر العينة.
    12. بعناية إزالة العينات المجففة وجبل العينات على بذرة المسح الإلكتروني المجهري مع مزدوج الوجهين الشريط موصلة.
    13. معطف الرش العينات مع الحد أدنى من الذهب. وضع العينات في حامل ويعمل الجهاز لمدة 2 دقيقة في 15 mA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويتطلب نظام المختبر في نموذج استجابة المضيف الأنسجة العصبية وندبة الدبقية في إنتاجية عالية، سقالة خلية ثلاثية الأبعاد مع مادة مصفوفة الذي هو متوافق حيويا، لا تتحمل حدثاً السامة للخلايا أثناء تكوين في الموقع ، وهو قابل للتعديل مع المكونات النشطة بيولوجيا لتوجيه استجابة الخيرين. وتحقيقا لهذه الغاية، ونحن إنشاء نظام سقالة خلية 3D يستند إلى حمض الهيالورونيك، ومغلفة سكان الرئيسية خلية الدبقية مختلطة لدراسة التفاعلات خلية خلية وبيوريكتيفيتي الدبقية. وأجريت دراسة موجزة بصرية لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحو تحقيق هدف توليد نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد إلى طراز بيوريكتيفيتي الدبقية وعملية تندب الدبقية، قمنا بتطوير نظام يمكن أن تدعم microglia مثقف الأولية، أستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس ويمكن توصيف قوية للخلية التفاعلات مورفولوجيا وخلية خلية. من ميكروجرافس هو مبين، كان مورفولوجية كل نوع خلية اختلافاً واضحا مع 2D و 3D-حماة و 3D منصات خليط الصفيحة القاعدية حماة. في نظام ثنائي الأبعاد، ومورفولوجيا كان متحيزا متميز على طول طائرة السطح، لكن عند مقارنتها بحماة 3D، microglia و astrocytes عموما أصغر داخل المصفوفة، باستثناء مجموعات ol...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

الكتاب ممتنون للدعم المالي من الأموال و CFI، عيس، والخدمات الصحية في ألبرتا والهبات ديفي "أبحاث الدماغ".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>1. مواد لتخليق HAMA والبلمرة الضوئية < / قوي >
حمض الهيالورونيك (HA)سيجما ألدريتش53747-10GStreptococcus equi ، ميغاواط: 1.5 - 1.8 × 10 ^ 6
أنهيدريد ميثاكريليك (MA)سيجما ألدريتش275585-100 مل
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتش221465-25 جم
إيثانول (EtOH) كحولتجاري شركه.
ملحي عازل بالفوسفات اللامائي (درجة الحموضة 7.4) أقراصفيشر ساينتفيك18912014
تري إيثانول أمين (TEA) سيجماألدريتش90279-100 مل
1-فينيل 2 بيروليدينون (NVP) سيجماألدريتشV3409-5G
EosinY (EY) سيجماألدريتشE6003-25G
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) سيلجارد 184 سيليكون طقم المطاطالصناعي داو كورنينج
3- (تريميثوكسي سيليل) بروبيل ميثاكريلاتسيجما ألدريتش440159-100 مل
دورق (100 مل)كورنينج1000-100
دورق (500 مل)كورنينج1000-600
ورق الأس الهيدروجيني (عصا المختبر)سيجما ألدريتش9580
<قوي>الاسم< / قوي>< strong>company catalog numberComments
2. مواد لعزل الخلايا الدبقية وزراعة الخلايا < / قوي > P1-2
صغار الفئران سبراج داوليتشارلز ريفرCD سبراغ داولي رمز سلالة الفئران 001
مقص التشريح - شفرات رفيعة (صغيرة)أدوات العلوم الدقيقة14081-09
مقص جراحي - Toughcut (كبير)أدوات العلوم الدقيقة14130-17
ملقط ناعم (Dumont # 5)أدوات العلوم الدقيقة11521-10
ملقط دقيق منحني (دومون # 7)أدوات العلوم الدقيقة11271-30
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)جيبكو14170-112
وسط النسر المعدل من Dulbecco وخليط المغذيات لحم الخنزير F-12 (DMEM / F12)جيبكو11320-033
البنسلين الستربتومايسين (PS)جيبكو15140-122
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو12483-020
0.25٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)جيبكو25200-072
بولي إل ليسين (PLL)سيجما ألدريتشP-6282
50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيالشكل فيشر ساينتفيك05-539-13
15 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيالشكل فيشر Scientific05-539-5
12 بئر ألواح معالجة لزراعة الأنسجة (Cellstar)Greiner Bio-One665 108
10 مل ماصة مصليةفيشر Scientific13-676-10F
25 مل ماصة مصليةفيشر Scientific12-676-10K
طبق بتري (60 مم × 15 مم)FB0875713Aفيشر ساينتفيك
( 100 مم × 15 مم)FB0875712فيشر
العلمي (18 مم)فيشر ساينتفيك12-545-100 18CIR
NameCompanyCatalog NumberComments
3. مواد للفحص المجهري (المجهر الإلكتروني متحد البؤر والماسح) < / قوي >
فأر أحادي النسيلة مضاد ل CNPaseabcamab6319
أرنب مضاد ل Iba1كيماويات مختبر واكو019-17741
دجاج مضاد ل GFAPabcamab4674
Hoechst 33342فيشر Scientific62249
فلوروماونت-جيفيشر سينتيفيك00-4958-02
الفورمالينسيجما ألدريتشHT501128-4 لترمخزن مؤقت (10٪)
تريتون X-100فيشر ScientificBP151-500
مصل الحصانجيبكو16050-122
علوم الفحص المجهري بارافورمالديهايدإلكتون157-8مخزن (8٪)
Guteraldehydeعلوم الفحص المجهري المختار16019مخزن (8٪)
رباعي أكسيد الأوزميومعلوم الفحص المجهري إلكتون19152مخزن مؤقت (2٪)
هيكساميثيلديلازان (HMDS) علوممجهر الإلكتون16700
الإيثانول (EtOH) علومالمجهر الكهربائي15055لا مائية
(25 × 75 × 1 مم)VWR International48311-703
محلول طبق بتري غطاء مجهر شريحة مجهر

المراجع

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016(2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343(2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258(2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528(2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072(2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001(2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904(2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6(2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606(2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85(2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة