توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

Claudia Siverino; Barbara Tabisz; Tessa Lühmann; Lorenz Meinel; Thomas Müller; Heike Walles; Joachim Nickel

doi:10.3791/56616

مقالة منهجية

توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

DOI:

10.3791/56616

⸱

مارس 29, 2018

Claudia Siverino¹ , Barbara Tabisz² , Tessa Lühmann³ , Lorenz Meinel³ , Thomas Müller⁴ , Heike Walles¹^,² , Joachim Nickel¹^,²

¹Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, ²Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, ³Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, ⁴Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحيوية يخدر بعظم Morphogenetic البروتين 2 (BMP2) استخدمت كاستراتيجية علاجية جديدة لشفاء كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. للتغلب على الآثار الجانبية الناجمة عن إطلاق سراح منفلتة من العامل، فإننا نقترح وضع استراتيجية جديدة للموقع--شل مباشرة العامل، وبالتالي خلق المواد مع تحسين قدرات أوستيوجينيك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استراتيجيات علاجية مختلفة لعلاج تشوهات العظام الطويلة غير الشفاء قد تم التحقيق المكثف. وتستخدم حاليا العلاجات الحالية العديد من القيود التي أدت إلى استخدام المواد الحيوية في تركيبة مع أوستيوجينيك عوامل النمو، مثل البروتينات مورفوجينيتيك العظام (BMPs). تتطلب أساليب الاستيعاب أو تغليف استخداماً الفسيولوجية أعلاه مبالغ BMP2، عادة ما أسفر عن أثر الإفراج عن دفعة أولى ما يسمى يثير العديد من الآثار الجانبية السلبية الشديدة. استراتيجية ممكنة للتغلب على هذه المشاكل سيكون تساهمي زوجين البروتين السقالة. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء اقتران بطريقة خاصة بالموقع لضمان التوصل إلى نتائج منتج استنساخه. ولذلك، قمنا بإنشاء متغير BMP2، الذي قدم حمض أميني اصطناعية (بروبارجيل-L-يسين) إلى الجزء ناضجة من البروتين BMP2 كودون استخدام التوسع (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk اقترن بالخرز فونكتيوناليزيد عن طريق أزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن (كواك). النشاط البيولوجي من جانب BMP2-K3Plk ثبت في المختبر وقد ثبت نشاط الخرز BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد أوستيوجينيك في الخلية على أساس فحوصات. حبات فونكتيوناليزيد على اتصال بالخلايا C2C12 كانت قادرة على حمل التعبير الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) بالقرب من المحظورة محلياً من حبة. وهكذا، بهذا الأسلوب، يمكن إنتاج السقالات فونكتيوناليزيد التي يمكن أن تؤدي إلى تمييز الخلية نحو نسب أوستيوجينيك. بالإضافة إلى ذلك، تكفي جرعات BMP2 أقل بسبب توجه BMP2 إلى جانب توجيه الموقع التي تسيطر عليها. مع هذا الأسلوب، يتعرض BMPs دائماً على المستقبلات على سطح الخلية في الاتجاه المناسب، الذي ليس هو الحال إذا كانت تقترن العوامل عبر التقنيات الموجهة من موقع غير اقتران. نتائج المنتج يتم السيطرة عليها بدرجة عالية، وهكذا، ينتج مواد ذات خصائص متجانسة، وتحسين قابليتها لإصلاح الحجم الحرج العظام العيوب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف النهائي لتجديد الهندسة والعظام أنسجة العظام التغلب على العوائق والقيود التي تحدث خلال فترة العلاج شيوعاً لكسور غير الأعضاء في الاتحاد. السيارات أو الو الزرع هي غالباً ما تستخدم كاستراتيجيات العلاج الحالية، على الرغم من أن كلا منهما لها عدة عيوب. وينبغي حمل الاختلاس العظام المثالي تكون العظم أوستيويندوكشن، فضلا عن أوستيوكوندوكشن، مما يؤدي إلى أوستيوينتيجريشن للفساد في العظام. في الوقت الحاضر، يعتبر فقط صناعة السيارات في زرع "المعيار الذهبي" حيث أنها تقدم كل الخصائص الاختلاس العظام المثالي. ولسوء الحظ، كما يعرض الجوانب السلبية الهامة، مثل أوقات جراحة طويلة وموقع صدمة ثانية التي عادة ما يستتبع مضاعفات أكثر (مثلاً، الألم المزمن، تشكيلات دموي، والالتهابات، وعيوب شكلية، إلخ). من ناحية أخرى بالطعوم allogenic، خصائص الأمثل لجميع الجوانب العامة¹. التكنولوجيات الاختلاس العظام البديلة قد تحسنت في السنوات القليلة الماضية، بهدف إنتاج السقالات التي هي أوستيويندوكتيفي، أوستيوكوندوكتيفي، متوافق حيويا، وبيوريسوربابل. نظراً للعديد من المواد الحيوية لا تظهر كل هذه الخصائص أوستيوجينيك، قد أدمجت مختلف عوامل النمو، أساسا، BMP2 و BMP7، بغية تحسين إمكانات osteogenic سقالة خاصة².

كمعيار أساسي، ينبغي أن توفر نظم إيصال عامل النمو هذه إطلاق سراح جرعة التي تسيطر عليها مع مرور الوقت بغية تيسير أحداث أساسية مثل تجنيد الخلية والمرفقات، وخلية إينجرووث والأوعية. ومع ذلك، BMPs، فضلا عن العوامل الأخرى النمو osteogenic عادة المعطل تداولها غير تساهمي³. تقنيات الامتزاز والفخ تتطلب استخدام المبالغ أعلاه الفسيولوجية للبروتين بسبب إطلاق سراح دفعة أولية، الأمر الذي يؤدي إلى عيوب خطيرة المجراة، عادة ما تؤثر على الأنسجة المحيطة بفرط العظام، عظام النهايات وتورم والتهاب⁴. وهكذا، يمكن الاحتفاظ بعوامل النمو في موقع التسليم لفترات أطول من الوقت بأساليب التثبيت التساهمي. تعديل كيميائيا BMP2 (سوكسينيلاتيد⁵، أسيتيلاتيد⁶ أو⁷من بيوتينيلاتيد)، المهندسة heterodimers⁸، أو BMP2 أوليجوبيبتيديس المشتقة⁹ تم تصميمها واستخدامها للتغلب على القيود المتصلة ب الاستيعاب. بيد أن بيو-نشاط هذه الثوابت لا يمكن التنبؤ بها نظراً للترتيب الذي يحتمل أن يمنع ربط يجند المعطل تداولها المستقبلات الخلوية. كما هو موضح سابقا، من الضروري أن جميع سلاسل مستقبلات الأربعة المشاركة في تشكيل مجمعات المنشط مستقبلات يجند التفاعل مع BMP2 المعطل تداولها بغية تنشيط جميع المتلقين للمعلومات مما يشير إلى الشلالات¹⁰بالكامل.

للتغلب على مشاكل نتيجة المنتج متنافرة مع قيود من حيث بيواكتيفيتي، والاستقرار، والتوافر البيولوجي العامل المعطل تداولها، قمنا بتصميم متغير BMP قادرة على تساهمي ملزمة السقالات في طريقة توجيه الموقع. وتضم هذا البديل، BMP2-K3Plk، ووصف حمض أميني اصطناعي الذي عرضته كودون الوراثية التوسع في¹¹. ارتبط هذا البديل بنجاح إلى السقالات باستخدام استراتيجية اقتران التساهمية مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إنتاج BMP2 الخيار BMP2-K3Plk

استنساخ من BMP2-K3Plk بالطفرات الموجهة من الموقع باستخدام PCR ¹²
1. تضخيم البشري BMP2 الناضجة (hmBMP2) من ناقل p25N-hmBMP2 (انظر الجدول للمواد) مع تمهيدي إلى الأمام (جاككاجاكاتاتجكتكاجككتاجكاكااكاجك 3 '5') وإدخال تمهيدي عكس (ككاجاجاتككتاجكجاكاكككاكاكككت 3 '5') (كودون وقف العنبر العلامة) في موقف يسين أول جزء BMP2´s ناضجة. إجراء تفاعل PCR باستخدام ميليلتر 33.5 ح₂س، 10 ميليلتر من مزيج تفاعل PCR، 1.5 ميليلتر من 10 ميكرون دنتب حل الأسهم، 1.5 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 pmol/ميليلتر)، 1.5 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 pmol/ميليلتر)، 1 ميليلتر من p25N-hmBMP2 (10 نانوغرام/ميليلتر) ، و 1 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) في cycler حرارية (تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 30 من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 1، الصلب في 60 درجة مئوية 1 دقيقة واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
2. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً عقب توصيات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
3. هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد ندى في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح₂س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح₂س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. هضم ناقل pET11a-بيرترنا مع ندى في 37 درجة مئوية ل 2 ح و 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح₂س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط عند 65 درجة مئوية لهضم دقيقة 5 ناقلات pET11a-بيرترنا مع بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح₂س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. إلغاء تنشيط الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. فصل المتجهات هضمها عن ناقلات عسر الهضم ومخلفات الهضم قبل [اغروس] هلام التفريد (0.8% [اغروس]، 60 دقيقة في 100 V). اضطر إدراج BMP2-K3TAG هضمها مع العمود الفقري هضمها pET11a-بيرترنا في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 2 استخدام 100 نانوغرام pET11a-بيرترنا العمود الفقري و 34.5 نانوغرام إدراج BMP2-K3TAG (نسبة المولى 1:3). رد فعل خليط يحتوي على العمود الفقري الحمض النووي وإدراج، 2 ميليلتر من المخزن المؤقت ليجاسى، 1 ميليلتر ليجاسى الحمض النووي، وح₂س إلى إجمالي حجم 20 ميليلتر.
6. تؤدي إلى تحول المشارك في pET11a-بيرترنا-BMP2-K3Plk وزلي-دويتو-بيرترناسينث في البكتيريا BL21(DE3):
  1. إضافة 50 نانوغرام لكل بلازميد للبكتيريا، وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة، وصدمتها الحرارة 42 درجة مئوية لمدة 50 s، ضع على الجليد لمدة 5 دقائق وإضافة 500 ميليلتر من متوسطة مرق ليسوجيني (رطل) في الخليط ويهز 300 لفة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
  2. نشر 100 ميليلتر من خليط البكتيرية على كاناميسين المعالجون مسبقاً (50 ميكروغرام/مل)/لوحات الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
التعبير وتنقية BMP2-K3Plk ¹³ ^, ¹⁴
1. نشر مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 50 مل متوسطة رطل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية.
2. تمييع بين عشية وضحاها الثقافات 01:20 إلى 800 مل من مرق رائع (السل) المتوسطة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين، وتنمو في 37 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى التطوير التنظيمي₆₀₀ من 0.7. أضف بروبارجيل-L-يسين إلى تركيز نهائي 10 مم. جمع 100 عينة ميليلتر من الثقافة قبل الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) التعريفي.
3. حمل التعبير الجيني بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم. تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية ح 16 في شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة. جمع عينة 100 ميليلتر من الثقافة.
4. الطرد المركزي ثقافة كاملة في 9000 x ز عن 30 دقيقة تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 30 مل من تبسي المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا)) مع 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا).
  تنبيه: تعامل مع 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد والعيون. تجنب استنشاق بخار أو الضباب. تنفيذ كافة الخطوات استثارة مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان.
5. تزن الكأس فارغ للطرد مركزي ونقل بيليه ريسوسبينديد في الكأس الفارغ. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن الكأس مع بيليه. قم بطرح وزن الكأس فارغة لحساب وزن بيليه.
  ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تجميد بيليه في-20 درجة مئوية في الأجل القصير أو في-80 درجة مئوية في الأجل الطويل. عند استئناف البروتوكول، ذوبان الجليد بيليه في الرايت
6. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت الظريف (10 ملم تريس pH 8.0؛ 150 مم كلوريد الصوديوم؛ يدتا 1 مم، السكروز مم 375 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا)). استخدام 200 مل صق المخزن المؤقت لكل 10 جرام من بيليه.
7. Sonicate تعليق على الجليد (10 دقيقة مع نبض s 40، 20 ثانية فرامل والسعة 30%). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه. كرر الخطوات سونيكاتيون والطرد المركزي 4 مرات.
8. ريسوسبيند بيليه في 100 مل من TBS المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
9. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت نوكلاس (100 مم تريس، 1 مم يدتا، مجكل 3 مم₂) مع إضافة طازجة 80 نوكلاس يو/مليلتر (مثلاً، بينزوناسي) باستخدام 10 مل/ز بيليه. احتضان تعليق بين عشية وضحاها في RT على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
10. إضافة المخزن المؤقت تريتون (60 مم يدتا، 1.5 م كلوريد الصوديوم، 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل جليكول) إلى التعليق. حجم المخزن المؤقت تريتون لإضافة يتوافق مع حجم 0.5 جزء من التعليق. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت (لا التحريك). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
11. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (100 مم تريس، 20 مم يدتا) استخدام مل 8/ز بيليه. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
12. ريسوسبيند بيليه بإضافة 4 مل/ز من 25 مم NaAc pH 5.0 و 5 مل/g لمن جوكل م 6 مع 1 مم ديثيوثريتول (DTT) (أضيف حديثا). احتضان تعليق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
13. الطرد المركزي في 75,500 س ز لمدة 20 دقيقة. وتتضمن المادة طافية الآن البروتين أحادي BMP2 تكشفت. جمع المادة طافية وتركز هذا استخراج إلى 20 مليلتر OD استخدام غشاء كاتشين 3 وقف (موكو) وزن الجزيئي في التركيز الخلية (انظر الجدول للمواد).
14. إضافة مونومرات تتركز في قطره واحدة إلى المخزن المؤقت ريناتوريشن (2 م ليكل، 50 مم تريس، الفصول 25 مم، 5 ملم يدتا، 1 مم الجلوتاثيون ثنائي كبريتيد (جسج)، 2 مم الجلوتاثيون (المدفع جريازيف)) أثناء التحريك (30 لفة في الدقيقة). تبني على RT ح 120 في الظلام.
  ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، ريفولدينج occours. ويتضمن الحل من هذه الخطوة فصاعدا مطوية ديميريك BMP2-K3Plk.
15. ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 3.0 استخدام مركزة HCl. دياليزي الحل ضد 1 مم HCl. وتركز الحل دياليزيد باستخدام غشاء وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) وزن الجزيئي كاتشين 10 في خلية تركيز.
16. حجته أن الحل عن طريق إضافة مخزن مؤقت (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30%). إضافة حجم المخزن المؤقت بالمقابل إلى وحدة تخزين 30% من الحل. الطرد المركزي الحل في 4700 x ز لمدة 15 دقيقة.
17. حجته العمود للتبادل الأيوني على نظام لوني سائل (فبلك) بروتين سريع¹⁵ مع 150 مل من المخزن المؤقت تحميل ألف محلول البروتين على العمود متوازن. الوت الكسور باستخدام تدرج خطي للمخزن المؤقت ب (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30 ٪، كلوريد الصوديوم م 2) استخدام 100 مل من المخزن المؤقت ب جمع 2 مل الكسور.
  ملاحظة: تركيز البروتين قبل التحميل للعمود وفقا لحجم إجمالي العمود. يجب أن يكون حجم البروتين النهائي < 5% حجم إجمالي العمود.
18. تحليل 20 ميليلتر من كل جزء من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام (12 ٪) التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) ¹⁶ و المصبوغة "أخذ الرائعة الأزرق"¹⁷ (انظر الجدول للمواد).
  ملاحظة: "أخذ الأزرق اللامع" الملون جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يظهر الكسور التي تحتوي على dimers (26 كاتشين) والكسور التي تحتوي على مونومرات (كاتشين 13).
19. تجمع الكسور التي تحتوي على ديمر. دياليزي تجمع ديمر التي تحتوي على كسور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ضد 1 مم HCl (حجم 5 لتر). التركيز المنتج النهائي باستخدام كاتشين 10 تركيز وحدة تصفية الطرد المركزي (انظر الجدول للمواد). تحليل المنتج النهائي بالتفريد جل Polyacrylamide (12 ٪) من الحزب الديمقراطي الصربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الأزرق الرائعة".
  ملاحظة: شريط "أزرق لامع أخذ" الملون الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام ينبغي إظهار الفرقة واحد فقط في كاتشين 26. وهذا هو BMP2-K3Plk المنتج النهائي.

2-الاستغلال الأمثل للنحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك) الشروط

تأثير الصوديوم اسكوربات (ناعس) والنحاس (II) كبريتات (CuSO ₄ ) _{على نوع البرية BMP2 (BMP2-WT)}
1. احتضان 20 ميكرومتر WT BMP2 مع نسب مختلفة من ناعس إلى CuSO₄. استخدام 0.5 مم ناسك و 0.5 مم CuSO₄ (ابتداء من تركيز) في وحدة تخزين 50 ميليلتر. الشروع بالنسب التالية من ناعس CuSO₄: (1:1)، (1.7:1)، (10:1)، حفظ تركيز₄ CuSO المستمر في 0.5 مم (20:1)، وضبط تركيز ناعس تبعاً لذلك. تنفيذ رد الفعل في ح₂س في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في الرايت
2. إعداد عينات المخفضة عن طريق إضافة تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 5% 2-mercaptoethanol واحتضان عينة عند 95 درجة مئوية لخفض الحد الأدنى 6 تحليل وعينات غير محدود من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام التفريد (12 ٪) (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الزرقاء الرائعة". كوماسي الملون الجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تظهر العصابات في نطاق كاتشين 13 (انخفاض conditons) 26 كاتشين وارتفاع الوزن الجزيئي (الحد من غير شروط).
أثر Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) أمين (ثبتا) في "رد فعل كواك"
1. احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk مع نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO₄. استخدام 5 مم ناعس، و 200 ميكرومتر 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (تبقى ناعس و 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين ثابتة). استخدام 50 ميكرومتر ثبتا و 0.5 مم من CuSO₄كبداية تركيزات. استخدام نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO₄: (7:1)؛ (10:1)؛ (12:1)؛ (15:1)؛ (20:1)-تنفيذ رد فعل في ح₂س (الحجم الإجمالي 50 ميليلتر) لح 24 في RT في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
2. عند اقتران، يصبح 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين صبغة فلورسنت. إعداد عينات في ظروف انخفاض وعدم تخفيض وتحليلها بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تصور المواد الهلامية تحت قناة الإثارة مع طول موجي محدد ل 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (λ_إس = 404 نانومتر؛ λ_م = 477 nm).

3-التساهمي اقتران تقنية BMP2-K3Plk لأزيد فونكتيوناليزيد الخرز [اغروس]

احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk أو BMP2-WT (يستخدم كمراقبة سلبية) مع 20 ميليلتر من الخرز [اغروس] تنشيط أزيد في إجمالي حجم 500 ميليلتر في رد فعل المخزن المؤقت (0.1 M حبيس pH 7.0، اليوريا 3.9 متر، 50 ميكرون CuSO₄، 250 ميكرون ثبتا، اسكوربات الصوديوم 5 مم) ح 2 في RT على روتاتي خلاط نغ (20 لفة في الدقيقة). وقف رد الفعل بإضافة 5 مم يدتا (تركيز النهائي).
تبني على RT لمدة 15 دقيقة في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة). الطرد المركزي عينات من 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في جمع الرايت سوبيرناتانتس.
تغسل بيليه الذي يحتوي على الخرز ثلاث مرات مع 1,000 ميليلتر من ميزانيات₅₀₀ المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 مم كلوريد الصوديوم)، ثلاث مرات مع ميليلتر 1,000 مجكل م 4₂، ومرتين مع 1,000 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). في كل خطوة من خطوات الغسيل، الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT وجمع سوبيرناتانتس. المخزن إلى جانب الخرز في ميليلتر 1,000 لبرنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
تنبيه: عدم الإزعاج بيليه حبة أثناء إزالة المادة طافية.

4-التحقق من الوجود والنشاط البيولوجي المعطل تداولها BMP2-K3Plk استخدام تكساس الأحمر المسمى مستقبلات BMP أنا اكتودومين (بمبر-IA _{الجماعة الأوروبية} )

احتضان 50 ميليلتر الخرز BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد مع 1 ميكرومتر من "تكساس الأحمر" المسمى بمبر-IA_{المفوضية الأوروبية} مع 150 ميليلتر من ميزانيات₅₀₀ المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 ملم كلوريد الصوديوم) على RT ح 1 في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
الطرد المركزي الخرز في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في الرايت تجاهل المادة طافية. أغسل حبات مع 1000 ميليلتر من ميزانيات₅₀₀ المخزن المؤقت. كرر الخطوة الغسيل إضافية 3 مرات. غسالة أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT بعد كل خطوة.
ريسوسبيند الخرز في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و "الماصة؛" 50 ميليلتر على شريحة غطاء زجاج. تعيين عامل تصفية مجهر بين 561 أو 594 شمال البحر الأبيض المتوسط. كشف تكساس الأحمر-بمبر-IA_EC-BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد الخرز استخدام صور مجهرية وتأخذ الفلورسنت.

5-قياس الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير لإثبات بيواكتيفيتي في المختبر إنتاج BMP2-K3Plk قبل و "بعد رد اقتران".

تحليل الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في المتوسط (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%₂.
2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 10⁴ خلايا/بئر إلى ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة واحتضان خلايا C2C12 حضور 0.5-200 نانومتر BMP2 WT أو BMP2-K3Plk في 100 ميليلتر/جيدا من دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%₂ لح 72.
3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل بئر. خلايا في الرايت ح 1 من المخزن المؤقت لتحلل 100 ميليلتر/جيدا (1% NP-40، جليكاين م 0.1، pH 9.6، 1 مم مجكل₂, 1 ملم زنكل₂) على هز لوحة (220 لفة في الدقيقة).
4. إضافة من الب المخزن المؤقت (0.1 M جليكاين، pH 9.6، 1 مم مجكل₂، 1 مم زنكل₂) 100 ميليلتر/جيدا مع 1 ملغ/مل فنيتروفينيلفوسفاتي (أضيف حديثا) إلى الخلية ليستي.
5. قياس الامتصاص في 405 نانومتر في قارئ مولتيبلاتي بعد إضافة المخزن المؤقت لحزب العمال الأسترالي، وكل 5 دقائق حتى يكتمل وضع اللون. إنشاء منحنيات استجابة الجرعة وقيم EC50 باستخدام نموذج سوقي، y = أ₂ + (أ₁-أ₂)/(1 + (x/x₀)^p).
تلوين الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%₂.
2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 10⁴ خلايا/بئر ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة وإضافة 20 ميليلتر/بئر BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز. BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز في 1000 ميليلتر لتعليق برنامج تلفزيوني.
3. تعد حلاً من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في دميم. تذوب في الميكروويف (600 واط لمدة 3 دقائق) وندعه يبرد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. إضافة 20 ميليلتر من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في كل بئر (تغطي الخرز والخلايا). أجهزة الطرد المركزي في عام 2000 x ز لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية. إضافة 80 ميليلتر دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%₂ لح 72.
5. إزالة المتوسطة، مع الحرص على عدم فصل في طدت 0.4% [اغروس]. إضافة 100 ميليلتر/بئر NBT الخطوة 1/بسب (كلوريد تيترازوليوم نيترو--الأزرق، الملح ف 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate-تولويدين) الركيزة الحل.
6. تحليل الفوسفاتيز القلوية تلطيخ استخدام مجهر الضوء فورا بعد تلطيخ الأرجواني يصبح واضحا. استخدام مجهر الحقل مشرق والتقاط الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لزوجين متغير جديد BMP2، BMP2-K3Plk، تساهمي لأزيد المتاحة تجارياً فونكتيوناليزيد [اغروس] الخرز (الشكل 1). تم التحقق من صحة بيواكتيفيتي الخيار BMP2-K3Plk المنتجة باستحثاث الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير الجيني في الخلايا C2C12. الاختبار في المختبر يظهر مستويات مماثلة من التعبير الب الناجمة عن نوع البرية BMP2 (BMP2-WT) و BMP2-K3Plk (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توليد المتغيرات البروتين الموسومة بتوسيع كودون الوراثية يسمح الأخذ بمختلف الأحماض الأمينية غير طبيعية النظير أساسا في أي موضع من تسلسل البروتين الأساسي. في حالة BMPs مثل BMP2, العلامات المشتركة مثل علامة 6-الحامض الأميني (له) لا يمكن عرض ن لا شفاء منها، منذ نهاية protein´s ج-الطرفية مدفونة داخل هيكل البروتين العالي، ومما لا يمكن الوصول إليها من الخارج. في مواقع أخرى، قد من المرجح جداً أن يؤدي حجم العلامة أدخلت التعديلات الهيكلية التي وبالتالي طمس بيواكتيفيتي BMP´s. علاوة على ذلك، إدخال طفرة في تسلسل BMP2 يمكن أن تؤثر على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتور م. روبيني (كونستانز، ألمانيا) لتوفير بلازميد ترميز بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال وتوفير برسفدويت-بيرترناسينث ترميز سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المطابق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>المواد
1-Step NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	إضافة محلول إلى الخلايا
3-Azido-7-hydroxycoumarin	BaseClick	BCFA-047-1	مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
Agarose منخفضة نقطة الانصهار	Biozym	840101	Agarose لاختبار ALP
حبات أزيد الاغاروز	جينا بيوساينس	CLK-1038-2	الخرز المستخدمة في رد الفعل
BamHI (إنزيم الهضم السريع)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	إنزيم تقييد
مستقبلات BMP IA (BMPR-IA_{EC) < / sub>}	--	--	أنتجت في مختبرنا
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye	Thermo Fisher Scientific	20279	مادة كيميائية تستخدم ل Coomassie تلطيخ أزرق لامع ل SDS PAGE
كبريتات النحاس (II) اللامائية (CuSO_{4< / sub>) Alfa}	Aesar	A13986	مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
فوق بوليميراز الحمض النووي ومخزن التفاعل ؛	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco ' s النسر المعدل s medium (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	وسائط زراعة الخلية
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	مادة كيميائية تستخدم لإيقاف تفاعل النقر
Isopropyl ß ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Carl	Roth GmbH	2316.5	تحريض البكتيريا (التركيز النهائي 1 ملم) ؛
NdeI (إنزيم الهضم السريع)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	إنزيم التقييد
تكساس ريد لايف المنشطة ب NHS		T6134	مقترنة بالمستقبلات
P- نيتروفينيل فوسفات	سيجما ألدريتش GmbH	N4645-1G	الفوسفاتيز القلوي
p25N-hmBMP2 & nbsp ؛	--	--	تفضل ببلازميد المقدمة من Walter Sebald إلى J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	--	مقدمة من كرسي الصيدلانيات والصيدلة الحيوية ، جامعة فورتسبورغ
بروبارجيل-L-lysine (Plk)	--	--	مقدمة من رئيس الصيدلة والصيدلة الحيوية ، جامعة فورتسبورغ
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	مقدمة من كرسي الصيدلانيات والصيدلة الحيوية ، مجموعة استخراج جل Qiagen بجامعة فورتسبورغ
	Qiagen	28704	تنقية هلام
Qiagen PCR Kit	Qiagen	28104	PCR Purification ؛
الصوديوم L-ascorbate	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
T4 DNA Ligase	ThermoScientific	EL0011	Ligation
تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازوليل ميثيل) أمين (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100 ؛
name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml	Merck KGaA	UFSC40001	وحدة التركيز
Amicon Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي Merck	KGaA	UFC901024	الطرد المركزي المركزة
Ä ؛ KTA avant FPLC	& Auml ؛ KTA	-	آلة FPLC
Avanti J-26XP	Beckman Coulter ؛	393124	جهاز طرد مركزي للثقافة البكتيرية
حاضنة الاهتزاز البكتيرية	Infors حاضنة اهتزاز HT		للثقافة البكتيرية
بروتين نظام FluorChem	Q بسيط	-	نظام التصوير والتحليل ل SDS-PAGE
متوافق الفلورسنت	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO) Fractogel
& reg ؛ EMD SO_{3< / sub>^{-< / sup> (M)}}	Merck KGaA	116882	التبادل الأيوني مادة عمود الكروماتوغرافيا
Greiner CELLSTAR & reg ؛ 96 لوحة بئر	Sigma	M5811-40EA	96 ألواح بئر لزراعة الخلايا (فحص ALP)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	-	جهاز طرد مركزي
M-20 Microplate يتأرجح دلو الدوار	ThermoScientific	75003624	الدوار لجهاز الطرد المركزي الدقيق للوحة أثناء تلطيخ ALP
جهاز طرد مركزي دقيق - 5417R	Eppendorf	-	طرد مركزي
OriginPro 9.1 G	OriginLab	-	برنامج للتحليل الثابت لبيانات فحص ALP
البوليسين	شرائح المجهر 10143265 ThermoScientific
Rotor JA-10	Beckman Coulter & nbsp ؛	-	الدوار لأجهزة الطرد المركزي Avanti J-26XP
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter ؛	-	الدوار لجهاز الطرد المركزي Avanti J-26XP
الدوار JA 25.50	Beckman Coulter ؛	-	الدوار لأجهزة الطرد المركزي Avanti J-26XP
Tecan اللانهائية M200 قارئ متعدد الألواح	Tecan Deutschland GmbH	-	قارئ متعدد الألواح لفحص ALP
Thermocycler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	-	PCR
TxRed - مرشح المجهر	مرشح Keyence		لمجهر الفلورسنت ؛
أقراص السليلوز المجددة بالترشيح الفائق 3 كيلو دالتون	Merck KGaA	PLBC04310	تستخدم مع خلية تركيز الأميكون 400 مل
أقراص السليلوز المجددة بالترشيح الفائق 10 كيلو دالتون	Merck KGaA	PLGC04310	تستخدم مع خلية تركيز الأميكون 400 مل

تقنيات وحدة جهاز شرائح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BMP2 CuAAC

توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة