يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56616

⸱

مارس 29, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, 2Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, 3Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, 4Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

في هذه المقالة

ملخص

الحيوية يخدر بعظم Morphogenetic البروتين 2 (BMP2) استخدمت كاستراتيجية علاجية جديدة لشفاء كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. للتغلب على الآثار الجانبية الناجمة عن إطلاق سراح منفلتة من العامل، فإننا نقترح وضع استراتيجية جديدة للموقع--شل مباشرة العامل، وبالتالي خلق المواد مع تحسين قدرات أوستيوجينيك.

الملخص

استراتيجيات علاجية مختلفة لعلاج تشوهات العظام الطويلة غير الشفاء قد تم التحقيق المكثف. وتستخدم حاليا العلاجات الحالية العديد من القيود التي أدت إلى استخدام المواد الحيوية في تركيبة مع أوستيوجينيك عوامل النمو، مثل البروتينات مورفوجينيتيك العظام (BMPs). تتطلب أساليب الاستيعاب أو تغليف استخداماً الفسيولوجية أعلاه مبالغ BMP2، عادة ما أسفر عن أثر الإفراج عن دفعة أولى ما يسمى يثير العديد من الآثار الجانبية السلبية الشديدة. استراتيجية ممكنة للتغلب على هذه المشاكل سيكون تساهمي زوجين البروتين السقالة. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء اقتران بطريقة خاصة بالموقع لضمان التوصل إلى نتائج منتج استنساخه. ولذلك، قمنا بإنشاء متغير BMP2، الذي قدم حمض أميني اصطناعية (بروبارجيل-L-يسين) إلى الجزء ناضجة من البروتين BMP2 كودون استخدام التوسع (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk اقترن بالخرز فونكتيوناليزيد عن طريق أزيد تشجعهن النحاس-ألكاين سيكلواديشن (كواك). النشاط البيولوجي من جانب BMP2-K3Plk ثبت في المختبر وقد ثبت نشاط الخرز BMP2-K3Plk-فونكتيوناليزيد أوستيوجينيك في الخلية على أساس فحوصات. حبات فونكتيوناليزيد على اتصال بالخلايا C2C12 كانت قادرة على حمل التعبير الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) بالقرب من المحظورة محلياً من حبة. وهكذا، بهذا الأسلوب، يمكن إنتاج السقالات فونكتيوناليزيد التي يمكن أن تؤدي إلى تمييز الخلية نحو نسب أوستيوجينيك. بالإضافة إلى ذلك، تكفي جرعات BMP2 أقل بسبب توجه BMP2 إلى جانب توجيه الموقع التي تسيطر عليها. مع هذا الأسلوب، يتعرض BMPs دائماً على المستقبلات على سطح الخلية في الاتجاه المناسب، الذي ليس هو الحال إذا كانت تقترن العوامل عبر التقنيات الموجهة من موقع غير اقتران. نتائج المنتج يتم السيطرة عليها بدرجة عالية، وهكذا، ينتج مواد ذات خصائص متجانسة، وتحسين قابليتها لإصلاح الحجم الحرج العظام العيوب.

المقدمة

الهدف النهائي لتجديد الهندسة والعظام أنسجة العظام التغلب على العوائق والقيود التي تحدث خلال فترة العلاج شيوعاً لكسور غير الأعضاء في الاتحاد. السيارات أو الو الزرع هي غالباً ما تستخدم كاستراتيجيات العلاج الحالية، على الرغم من أن كلا منهما لها عدة عيوب. وينبغي حمل الاختلاس العظام المثالي تكون العظم أوستيويندوكشن، فضلا عن أوستيوكوندوكشن، مما يؤدي إلى أوستيوينتيجريشن للفساد في العظام. في الوقت الحاضر، يعتبر فقط صناعة السيارات في زرع "المعيار الذهبي" حيث أنها تقدم كل الخصائص الاختلاس العظام المثالي. ولسوء الحظ، كما يعرض الجوانب السلبية الهامة، مثل أوقات جراحة طويلة وموقع صدمة ثانية التي عادة ما يستتبع مضاعفات أكثر (مثلاً، الألم المزمن، تشكيلات دموي، والالتهابات، وعيوب شكلية، إلخ). من ناحية أخرى بالطعوم allogenic، خصائص الأمثل لجميع الجوانب العامة1. التكنولوجيات الاختلاس العظام البديلة قد تحسنت في السنوات القليلة الماضية، بهدف إنتاج السقالات التي هي أوستيويندوكتيفي، أوستيوكوندوكتيفي، متوافق حيويا، وبيوريسوربابل. نظراً للعديد من المواد الحيوية لا تظهر كل هذه الخصائص أوستيوجينيك، قد أدمجت مختلف عوامل النمو، أساسا، BMP2 و BMP7، بغية تحسين إمكانات osteogenic سقالة خاصة2.

كمعيار أساسي، ينبغي أن توفر نظم إيصال عامل النمو هذه إطلاق سراح جرعة التي تسيطر عليها مع مرور الوقت بغية تيسير أحداث أساسية مثل تجنيد الخلية والمرفقات، وخلية إينجرووث والأوعية. ومع ذلك، BMPs، فضلا عن العوامل الأخرى النمو osteogenic عادة المعطل تداولها غير تساهمي3. تقنيات الامتزاز والفخ تتطلب استخدام المبالغ أعلاه الفسيولوجية للبروتين بسبب إطلاق سراح دفعة أولية، الأمر الذي يؤدي إلى عيوب خطيرة المجراة، عادة ما تؤثر على الأنسجة المحيطة بفرط العظام، عظام النهايات وتورم والتهاب4. وهكذا، يمكن الاحتفاظ بعوامل النمو في موقع التسليم لفترات أطول من الوقت بأساليب التثبيت التساهمي. تعديل كيميائيا BMP2 (سوكسينيلاتيد5، أسيتيلاتيد6 أو7من بيوتينيلاتيد)، المهندسة heterodimers8، أو BMP2 أوليجوبيبتيديس المشتقة9 تم تصميمها واستخدامها للتغلب على القيود المتصلة ب الاستيعاب. بيد أن بيو-نشاط هذه الثوابت لا يمكن التنبؤ بها نظراً للترتيب الذي يحتمل أن يمنع ربط يجند المعطل تداولها المستقبلات الخلوية. كما هو موضح سابقا، من الضروري أن جميع سلاسل مستقبلات الأربعة المشاركة في تشكيل مجمعات المنشط مستقبلات يجند التفاعل مع BMP2 المعطل تداولها بغية تنشيط جميع المتلقين للمعلومات مما يشير إلى الشلالات10بالكامل.

للتغلب على مشاكل نتيجة المنتج متنافرة مع قيود من حيث بيواكتيفيتي، والاستقرار، والتوافر البيولوجي العامل المعطل تداولها، قمنا بتصميم متغير BMP قادرة على تساهمي ملزمة السقالات في طريقة توجيه الموقع. وتضم هذا البديل، BMP2-K3Plk، ووصف حمض أميني اصطناعي الذي عرضته كودون الوراثية التوسع في11. ارتبط هذا البديل بنجاح إلى السقالات باستخدام استراتيجية اقتران التساهمية مع الحفاظ على نشاطها البيولوجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إنتاج BMP2 الخيار BMP2-K3Plk

  1. استنساخ من BMP2-K3Plk بالطفرات الموجهة من الموقع باستخدام PCR 12
    1. تضخيم البشري BMP2 الناضجة (hmBMP2) من ناقل p25N-hmBMP2 (انظر الجدول للمواد) مع تمهيدي إلى الأمام (جاككاجاكاتاتجكتكاجككتاجكاكااكاجك 3 '5') وإدخال تمهيدي عكس (ككاجاجاتككتاجكجاكاكككاكاكككت 3 '5') (كودون وقف العنبر العلامة) في موقف يسين أول جزء BMP2´s ناضجة. إجراء تفاعل PCR باستخدام ميليلتر 33.5 ح2س، 10 ميليلتر من مزيج تفاعل PCR، 1.5 ميليلتر من 10 ميكرون دنتب حل الأسهم، 1.5 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 pmol/ميليلتر)، 1.5 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 pmol/ميليلتر)، 1 ميليلتر من p25N-hmBMP2 (10 نانوغرام/ميليلتر) ، و 1 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) في cycler حرارية (تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 30 من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 1، الصلب في 60 درجة مئوية 1 دقيقة واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
    2. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً عقب توصيات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    3. هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد ندى في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 هضم المنتج بكر مع إنزيم التقييد بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. هضم ناقل pET11a-بيرترنا مع ندى في 37 درجة مئوية ل 2 ح و 45 دقيقة باستخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. الحرارة--إلغاء تنشيط عند 65 درجة مئوية لهضم دقيقة 5 ناقلات pET11a-بيرترنا مع بامهي في 37 درجة مئوية ح 1 استخدام ميليلتر 16 ح2س، 3 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم، 10 ميليلتر من الحمض النووي (20 نانوغرام/ميليلتر)، و 1 ميليلتر من إنزيم التقييد. إلغاء تنشيط الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. فصل المتجهات هضمها عن ناقلات عسر الهضم ومخلفات الهضم قبل [اغروس] هلام التفريد (0.8% [اغروس]، 60 دقيقة في 100 V). اضطر إدراج BMP2-K3TAG هضمها مع العمود الفقري هضمها pET11a-بيرترنا في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 2 استخدام 100 نانوغرام pET11a-بيرترنا العمود الفقري و 34.5 نانوغرام إدراج BMP2-K3TAG (نسبة المولى 1:3). رد فعل خليط يحتوي على العمود الفقري الحمض النووي وإدراج، 2 ميليلتر من المخزن المؤقت ليجاسى، 1 ميليلتر ليجاسى الحمض النووي، وح2س إلى إجمالي حجم 20 ميليلتر.
    6. تؤدي إلى تحول المشارك في pET11a-بيرترنا-BMP2-K3Plk وزلي-دويتو-بيرترناسينث في البكتيريا BL21(DE3):
      1. إضافة 50 نانوغرام لكل بلازميد للبكتيريا، وضع الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة، وصدمتها الحرارة 42 درجة مئوية لمدة 50 s، ضع على الجليد لمدة 5 دقائق وإضافة 500 ميليلتر من متوسطة مرق ليسوجيني (رطل) في الخليط ويهز 300 لفة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
      2. نشر 100 ميليلتر من خليط البكتيرية على كاناميسين المعالجون مسبقاً (50 ميكروغرام/مل)/لوحات الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. التعبير وتنقية BMP2-K3Plk 13 , 14
    1. نشر مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 50 مل متوسطة رطل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية.
    2. تمييع بين عشية وضحاها الثقافات 01:20 إلى 800 مل من مرق رائع (السل) المتوسطة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين، وتنمو في 37 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى التطوير التنظيمي600 من 0.7. أضف بروبارجيل-L-يسين إلى تركيز نهائي 10 مم. جمع 100 عينة ميليلتر من الثقافة قبل الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) التعريفي.
    3. حمل التعبير الجيني بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم. تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية ح 16 في شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة. جمع عينة 100 ميليلتر من الثقافة.
    4. الطرد المركزي ثقافة كاملة في 9000 x ز عن 30 دقيقة تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 30 مل من تبسي المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا)) مع 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا).
      تنبيه: تعامل مع 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد والعيون. تجنب استنشاق بخار أو الضباب. تنفيذ كافة الخطوات استثارة مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على 2-mercaptoethanol تحت غطاء الدخان.
    5. تزن الكأس فارغ للطرد مركزي ونقل بيليه ريسوسبينديد في الكأس الفارغ. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن الكأس مع بيليه. قم بطرح وزن الكأس فارغة لحساب وزن بيليه.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تجميد بيليه في-20 درجة مئوية في الأجل القصير أو في-80 درجة مئوية في الأجل الطويل. عند استئناف البروتوكول، ذوبان الجليد بيليه في الرايت
    6. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت الظريف (10 ملم تريس pH 8.0؛ 150 مم كلوريد الصوديوم؛ يدتا 1 مم، السكروز مم 375 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (أضيف حديثا)). استخدام 200 مل صق المخزن المؤقت لكل 10 جرام من بيليه.
    7. Sonicate تعليق على الجليد (10 دقيقة مع نبض s 40، 20 ثانية فرامل والسعة 30%). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه. كرر الخطوات سونيكاتيون والطرد المركزي 4 مرات.
    8. ريسوسبيند بيليه في 100 مل من TBS المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    9. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت نوكلاس (100 مم تريس، 1 مم يدتا، مجكل 3 مم2) مع إضافة طازجة 80 نوكلاس يو/مليلتر (مثلاً، بينزوناسي) باستخدام 10 مل/ز بيليه. احتضان تعليق بين عشية وضحاها في RT على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
    10. إضافة المخزن المؤقت تريتون (60 مم يدتا، 1.5 م كلوريد الصوديوم، 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل جليكول) إلى التعليق. حجم المخزن المؤقت تريتون لإضافة يتوافق مع حجم 0.5 جزء من التعليق. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت (لا التحريك). الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    11. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (100 مم تريس، 20 مم يدتا) استخدام مل 8/ز بيليه. الطرد المركزي في 6,360 س ز عن 20 دقيقة تجاهل المادة طافية وتزن بيليه.
    12. ريسوسبيند بيليه بإضافة 4 مل/ز من 25 مم NaAc pH 5.0 و 5 مل/g لمن جوكل م 6 مع 1 مم ديثيوثريتول (DTT) (أضيف حديثا). احتضان تعليق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على لوح التحريك (30 لفة في الدقيقة).
    13. الطرد المركزي في 75,500 س ز لمدة 20 دقيقة. وتتضمن المادة طافية الآن البروتين أحادي BMP2 تكشفت. جمع المادة طافية وتركز هذا استخراج إلى 20 مليلتر OD استخدام غشاء كاتشين 3 وقف (موكو) وزن الجزيئي في التركيز الخلية (انظر الجدول للمواد).
    14. إضافة مونومرات تتركز في قطره واحدة إلى المخزن المؤقت ريناتوريشن (2 م ليكل، 50 مم تريس، الفصول 25 مم، 5 ملم يدتا، 1 مم الجلوتاثيون ثنائي كبريتيد (جسج)، 2 مم الجلوتاثيون (المدفع جريازيف)) أثناء التحريك (30 لفة في الدقيقة). تبني على RT ح 120 في الظلام.
      ملاحظة: خلال هذه الفترة الحضانة، ريفولدينج occours. ويتضمن الحل من هذه الخطوة فصاعدا مطوية ديميريك BMP2-K3Plk.
    15. ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 3.0 استخدام مركزة HCl. دياليزي الحل ضد 1 مم HCl. وتركز الحل دياليزيد باستخدام غشاء وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) وزن الجزيئي كاتشين 10 في خلية تركيز.
    16. حجته أن الحل عن طريق إضافة مخزن مؤقت (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30%). إضافة حجم المخزن المؤقت بالمقابل إلى وحدة تخزين 30% من الحل. الطرد المركزي الحل في 4700 x ز لمدة 15 دقيقة.
    17. حجته العمود للتبادل الأيوني على نظام لوني سائل (فبلك) بروتين سريع15 مع 150 مل من المخزن المؤقت تحميل ألف محلول البروتين على العمود متوازن. الوت الكسور باستخدام تدرج خطي للمخزن المؤقت ب (20 مم NaAc، الايزوبروبانول 30 ٪، كلوريد الصوديوم م 2) استخدام 100 مل من المخزن المؤقت ب جمع 2 مل الكسور.
      ملاحظة: تركيز البروتين قبل التحميل للعمود وفقا لحجم إجمالي العمود. يجب أن يكون حجم البروتين النهائي < 5% حجم إجمالي العمود.
    18. تحليل 20 ميليلتر من كل جزء من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام (12 ٪) التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) 16 و المصبوغة "أخذ الرائعة الأزرق"17 (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: "أخذ الأزرق اللامع" الملون جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يظهر الكسور التي تحتوي على dimers (26 كاتشين) والكسور التي تحتوي على مونومرات (كاتشين 13).
    19. تجمع الكسور التي تحتوي على ديمر. دياليزي تجمع ديمر التي تحتوي على كسور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ضد 1 مم HCl (حجم 5 لتر). التركيز المنتج النهائي باستخدام كاتشين 10 تركيز وحدة تصفية الطرد المركزي (انظر الجدول للمواد). تحليل المنتج النهائي بالتفريد جل Polyacrylamide (12 ٪) من الحزب الديمقراطي الصربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الأزرق الرائعة".
      ملاحظة: شريط "أزرق لامع أخذ" الملون الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام ينبغي إظهار الفرقة واحد فقط في كاتشين 26. وهذا هو BMP2-K3Plk المنتج النهائي.

2-الاستغلال الأمثل للنحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك) الشروط

  1. تأثير الصوديوم اسكوربات (ناعس) والنحاس (II) كبريتات (CuSO 4 ) على نوع البرية BMP2 (BMP2-WT)
    1. احتضان 20 ميكرومتر WT BMP2 مع نسب مختلفة من ناعس إلى CuSO4. استخدام 0.5 مم ناسك و 0.5 مم CuSO4 (ابتداء من تركيز) في وحدة تخزين 50 ميليلتر. الشروع بالنسب التالية من ناعس CuSO4: (1:1)، (1.7:1)، (10:1)، حفظ تركيز4 CuSO المستمر في 0.5 مم (20:1)، وضبط تركيز ناعس تبعاً لذلك. تنفيذ رد الفعل في ح2س في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في الرايت
    2. إعداد عينات المخفضة عن طريق إضافة تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 5% 2-mercaptoethanol واحتضان عينة عند 95 درجة مئوية لخفض الحد الأدنى 6 تحليل وعينات غير محدود من الحزب الديمقراطي الصربي Polyacrylamide هلام التفريد (12 ٪) (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وتلطيخ "أخذ الزرقاء الرائعة". كوماسي الملون الجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تظهر العصابات في نطاق كاتشين 13 (انخفاض conditons) 26 كاتشين وارتفاع الوزن الجزيئي (الحد من غير شروط).
  2. أثر Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) أمين (ثبتا) في "رد فعل كواك"
    1. احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk مع نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO4. استخدام 5 مم ناعس، و 200 ميكرومتر 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (تبقى ناعس و 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين ثابتة). استخدام 50 ميكرومتر ثبتا و 0.5 مم من CuSO4 كبداية تركيزات. استخدام نسب مختلفة من ثبتا إلى CuSO4: (7:1)؛ (10:1)؛ (12:1)؛ (15:1)؛ (20:1)-تنفيذ رد فعل في ح2س (الحجم الإجمالي 50 ميليلتر) لح 24 في RT في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
    2. عند اقتران، يصبح 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين صبغة فلورسنت. إعداد عينات في ظروف انخفاض وعدم تخفيض وتحليلها بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تصور المواد الهلامية تحت قناة الإثارة مع طول موجي محدد ل 3-أزيدو-7-هيدروكسيكومارين (λإس = 404 نانومتر؛ λم = 477 nm).

3-التساهمي اقتران تقنية BMP2-K3Plk لأزيد فونكتيوناليزيد الخرز [اغروس]

  1. احتضان ميكرومتر 20 BMP2-K3Plk أو BMP2-WT (يستخدم كمراقبة سلبية) مع 20 ميليلتر من الخرز [اغروس] تنشيط أزيد في إجمالي حجم 500 ميليلتر في رد فعل المخزن المؤقت (0.1 M حبيس pH 7.0، اليوريا 3.9 متر، 50 ميكرون CuSO4، 250 ميكرون ثبتا، اسكوربات الصوديوم 5 مم) ح 2 في RT على روتاتي خلاط نغ (20 لفة في الدقيقة). وقف رد الفعل بإضافة 5 مم يدتا (تركيز النهائي).
  2. تبني على RT لمدة 15 دقيقة في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة). الطرد المركزي عينات من 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في جمع الرايت سوبيرناتانتس.
  3. تغسل بيليه الذي يحتوي على الخرز ثلاث مرات مع 1,000 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 مم كلوريد الصوديوم)، ثلاث مرات مع ميليلتر 1,000 مجكل م 42، ومرتين مع 1,000 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). في كل خطوة من خطوات الغسيل، الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT وجمع سوبيرناتانتس. المخزن إلى جانب الخرز في ميليلتر 1,000 لبرنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: عدم الإزعاج بيليه حبة أثناء إزالة المادة طافية.

4-التحقق من الوجود والنشاط البيولوجي المعطل تداولها BMP2-K3Plk استخدام تكساس الأحمر المسمى مستقبلات BMP أنا اكتودومين (بمبر-IA الجماعة الأوروبية )

  1. احتضان 50 ميليلتر الخرز BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد مع 1 ميكرومتر من "تكساس الأحمر" المسمى بمبر-IAالمفوضية الأوروبية مع 150 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت (50 مم حبيس، 500 ملم كلوريد الصوديوم) على RT ح 1 في خلاط الدورية (20 لفة في الدقيقة).
  2. الطرد المركزي الخرز في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة في الرايت تجاهل المادة طافية. أغسل حبات مع 1000 ميليلتر من ميزانيات500 المخزن المؤقت. كرر الخطوة الغسيل إضافية 3 مرات. غسالة أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة على RT بعد كل خطوة.
  3. ريسوسبيند الخرز في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني و "الماصة؛" 50 ميليلتر على شريحة غطاء زجاج. تعيين عامل تصفية مجهر بين 561 أو 594 شمال البحر الأبيض المتوسط. كشف تكساس الأحمر-بمبر-IAEC-BMP2-K3Plk فونكتيوناليزيد الخرز استخدام صور مجهرية وتأخذ الفلورسنت.

5-قياس الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير لإثبات بيواكتيفيتي في المختبر إنتاج BMP2-K3Plk قبل و "بعد رد اقتران".

  1. تحليل الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
    1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في المتوسط (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 104 خلايا/بئر إلى ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة واحتضان خلايا C2C12 حضور 0.5-200 نانومتر BMP2 WT أو BMP2-K3Plk في 100 ميليلتر/جيدا من دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2 لح 72.
    3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل بئر. خلايا في الرايت ح 1 من المخزن المؤقت لتحلل 100 ميليلتر/جيدا (1% NP-40، جليكاين م 0.1، pH 9.6، 1 مم مجكل2, 1 ملم زنكل2) على هز لوحة (220 لفة في الدقيقة).
    4. إضافة من الب المخزن المؤقت (0.1 M جليكاين، pH 9.6، 1 مم مجكل2، 1 مم زنكل2) 100 ميليلتر/جيدا مع 1 ملغ/مل فنيتروفينيلفوسفاتي (أضيف حديثا) إلى الخلية ليستي.
    5. قياس الامتصاص في 405 نانومتر في قارئ مولتيبلاتي بعد إضافة المخزن المؤقت لحزب العمال الأسترالي، وكل 5 دقائق حتى يكتمل وضع اللون. إنشاء منحنيات استجابة الجرعة وقيم EC50 باستخدام نموذج سوقي، y = أ2 + (أ1-أ2)/(1 + (x/x0)p).
  2. تلوين الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)
    1. الثقافة بروميوبلاستيك C2C12 الخلايا (ATCC CRL-172) في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. البذور C2C12 الخلايا في كثافة 3 × 104 خلايا/بئر ميكروسكوبية 96-جيدا. السماح للخلايا إرفاق بين عشية وضحاها. إزالة المتوسطة وإضافة 20 ميليلتر/بئر BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز. BMP2-K3Plk، إلى جانب الخرز في 1000 ميليلتر لتعليق برنامج تلفزيوني.
    3. تعد حلاً من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في دميم. تذوب في الميكروويف (600 واط لمدة 3 دقائق) وندعه يبرد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    4. إضافة 20 ميليلتر من 0.4 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في كل بئر (تغطي الخرز والخلايا). أجهزة الطرد المركزي في عام 2000 x ز لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية. إضافة 80 ميليلتر دميم (FCS 2%، 100 يو/مليلتر البنسلين G و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 5%2 لح 72.
    5. إزالة المتوسطة، مع الحرص على عدم فصل في طدت 0.4% [اغروس]. إضافة 100 ميليلتر/بئر NBT الخطوة 1/بسب (كلوريد تيترازوليوم نيترو--الأزرق، الملح ف 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate-تولويدين) الركيزة الحل.
    6. تحليل الفوسفاتيز القلوية تلطيخ استخدام مجهر الضوء فورا بعد تلطيخ الأرجواني يصبح واضحا. استخدام مجهر الحقل مشرق والتقاط الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لزوجين متغير جديد BMP2، BMP2-K3Plk، تساهمي لأزيد المتاحة تجارياً فونكتيوناليزيد [اغروس] الخرز (الشكل 1). تم التحقق من صحة بيواكتيفيتي الخيار BMP2-K3Plk المنتجة باستحثاث الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) التعبير الجيني في الخلايا C2C12. الاختبار في المختبر يظهر مستويات مماثلة من التعبير الب الناجمة عن نوع البرية BMP2 (BMP2-WT) و BMP2-K3Plk (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توليد المتغيرات البروتين الموسومة بتوسيع كودون الوراثية يسمح الأخذ بمختلف الأحماض الأمينية غير طبيعية النظير أساسا في أي موضع من تسلسل البروتين الأساسي. في حالة BMPs مثل BMP2, العلامات المشتركة مثل علامة 6-الحامض الأميني (له) لا يمكن عرض ن لا شفاء منها، منذ نهاية protein´s ج-الطرفية مدفونة داخل هيكل البروتين العالي، ومما لا يمكن الوصول إليها من الخارج. في مواقع أخرى، قد من المرجح جداً أن يؤدي حجم العلامة أدخلت التعديلات الهيكلية التي وبالتالي طمس بيواكتيفيتي BMP´s. علاوة على ذلك، إدخال طفرة في تسلسل BMP2 يمكن أن تؤثر على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور م. روبيني (كونستانز، ألمانيا) لتوفير بلازميد ترميز بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال وتوفير برسفدويت-بيرترناسينث ترميز سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المطابق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد
1-Step NBT/BCIPThermo Fisher34042إضافة محلول إلى الخلايا
3-Azido-7-hydroxycoumarinBaseClickBCFA-047-1مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
Agarose منخفضة نقطة الانصهارBiozym840101Agarose لاختبار ALP 
حبات أزيد الاغاروزجينا بيوساينسCLK-1038-2الخرز المستخدمة في رد الفعل
BamHI (إنزيم الهضم السريع)Thermo Fisher ScientificFD0054إنزيم تقييد
مستقبلات BMP IA (BMPR-IAEC) < / sub>----أنتجت في مختبرنا
Coomassie Brilliant Blue G-250 DyeThermo Fisher Scientific20279مادة كيميائية تستخدم ل Coomassie تلطيخ أزرق لامع ل SDS PAGE
كبريتات النحاس (II) اللامائية (CuSO4< / sub>) AlfaAesarA13986مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
فوق بوليميراز الحمض النووي ومخزن التفاعل   ؛KapabiosystemsKK2102KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco ' s النسر المعدل s medium (DMEM) GlutaMAXGibco61965-026وسائط زراعة الخلية
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)Sigma Aldrich GmbHE5134-1kgمادة كيميائية تستخدم لإيقاف تفاعل النقر
Isopropyl ß ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) CarlRoth GmbH2316.5تحريض البكتيريا (التركيز النهائي 1 ملم)   ؛
NdeI (إنزيم الهضم السريع)Thermo Fisher ScientificER0581إنزيم التقييد
تكساس ريد لايف المنشطة ب NHST6134مقترنة بالمستقبلات
P- نيتروفينيل فوسفاتسيجما ألدريتش GmbHN4645-1Gالفوسفاتيز القلوي
p25N-hmBMP2 & nbsp ؛----تفضل ببلازميد المقدمة من Walter Sebald إلى J. Nickel
pET11a-pyrtRNA----مقدمة من كرسي الصيدلانيات والصيدلة الحيوية ، جامعة فورتسبورغ
بروبارجيل-L-lysine (Plk)----مقدمة من رئيس الصيدلة والصيدلة الحيوية ، جامعة فورتسبورغ
pSRFduet-pyrtRNAsynth----مقدمة من كرسي الصيدلانيات والصيدلة الحيوية ، مجموعة استخراج جل Qiagen بجامعة فورتسبورغ
Qiagen28704تنقية هلام
Qiagen PCR KitQiagen28104PCR Purification   ؛
الصوديوم L-ascorbateSigma Aldrich GmbHA7631-100Gمادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
T4 DNA LigaseThermoScientificEL0011Ligation 
تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازوليل ميثيل) أمين (THPTA)BaseClickBCMI-006-100مادة كيميائية تستخدم لتفاعل النقر
4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكولSigma Aldrich GmbHX100-1LTriton X 100   ؛
nameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml Merck KGaAUFSC40001وحدة التركيز
Amicon Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي MerckKGaAUFC901024الطرد المركزي المركزة
Ä ؛ KTA avant FPLC& Auml ؛ KTA-آلة FPLC
Avanti J-26XPBeckman Coulter   ؛393124جهاز طرد مركزي للثقافة البكتيرية
حاضنة الاهتزاز البكتيريةInfors حاضنة اهتزاز HTللثقافة البكتيرية
بروتين نظام FluorChemQ بسيط-نظام التصوير والتحليل ل SDS-PAGE
متوافق الفلورسنتKeyenceBZ-9000 (BIOREVO) Fractogel
& reg ؛ EMD SO3< / sub>-< / sup> (M)Merck KGaA116882التبادل الأيوني مادة عمود الكروماتوغرافيا
Greiner CELLSTAR & reg ؛   96 لوحة بئرSigmaM5811-40EA96 ألواح بئر لزراعة الخلايا (فحص ALP)
Heraeus Multifuge X1RThermoScientific-جهاز طرد مركزي
M-20 Microplate يتأرجح دلو الدوارThermoScientific75003624الدوار لجهاز الطرد المركزي الدقيق للوحة أثناء تلطيخ ALP
جهاز طرد مركزي دقيق - 5417REppendorf-طرد مركزي
OriginPro 9.1 G OriginLab-برنامج للتحليل الثابت لبيانات فحص ALP
البوليسينشرائح المجهر 10143265 ThermoScientific
Rotor JA-10Beckman Coulter & nbsp ؛-الدوار لأجهزة الطرد المركزي Avanti J-26XP
Rotor JLA 8.1Beckman Coulter   ؛-الدوار لجهاز الطرد المركزي Avanti J-26XP
الدوار JA 25.50Beckman Coulter   ؛-الدوار لأجهزة الطرد المركزي Avanti J-26XP
Tecan اللانهائية M200 قارئ متعدد الألواحTecan Deutschland GmbH-قارئ متعدد الألواح لفحص ALP
Thermocycler - Labcycler GradientSensoQuest GmbH-PCR
TxRed - مرشح المجهرمرشح Keyenceلمجهر الفلورسنت   ؛
أقراص السليلوز المجددة بالترشيح الفائق 3 كيلو دالتونMerck KGaAPLBC04310تستخدم مع خلية تركيز الأميكون 400 مل
أقراص السليلوز المجددة بالترشيح الفائق 10 كيلو دالتونMerck KGaAPLGC04310تستخدم مع خلية تركيز الأميكون 400 مل
تقنيات وحدة جهاز شرائح

المراجع

  1. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
  2. Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
  3. Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  4. Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
  5. Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
  6. Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  7. Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
  8. Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
  9. Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
  10. Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
  11. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
  12. Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
  14. Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
  15. Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
  16. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  17. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
  18. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
  19. Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
  20. Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
  21. Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
  22. Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

متغير BMP2الاقتران الموجه للموقعالتعبير البروتينيمقايسة الفوسفاتاز القلويالتثبيت التساهميتفاعل CuAACالتمايز العظميتوسيع الشفرة الوراثيةوظيفية الخرزات
توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.