مقالة منهجية

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

DOI:

10.3791/56617

⸱

نوفمبر 3, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (جهاز تسوية المنازعات) خطيرة الحمض النووي آفات. تحليل لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات ذات الصلة بطائفة واسعة من مجالات البحوث بما في ذلك سلامة الجينوم وسمية جينية وبيولوجيا الإشعاع، والشيخوخة، والسرطان وتطوير العقاقير. ردا على جهاز تسوية المنازعات، هو فوسفوريلاتيد هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج ميجاباسي تشكيل بؤر النووية منفصلة يمكن كشفها بالفحص المجهري الفلورة. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 (البروتين p53 1) آخر بروتين المراعية لجهاز تسوية المنازعات الهامة تعزيز إصلاح جهاز تسوية المنازعات قبل نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية بينما تمنع جزئ مثلى. وفقا للمهام المحددة في γH2AX و 53BP1، قد يكون الجمع بين تحليل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نهجاً معقولاً لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة وتستكمل مع ملاحظات منهجية لأداء التقنية. على وجه التحديد، يتضح تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX الليفية العادي الخط الخلية نهدف. علاوة على ذلك، يبين قيمة البؤر γH2AX كالعلامات البيولوجية لمفاوية المشع بالأشعة السينية لشخص سليم. وأخيراً، عدم الاستقرار الوراثي هو التحقيق في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد مجهرية الفلورة γH2AX و 53BP1.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلف الحمض النووي بشكل مستمر بالذاتية (مثلاً، الإجهاد النسخ المتماثل، الأنواع الأكسجين التفاعلية، وعدم استقرار جوهري للحمض النووي) وخارجية (مثلاً، الجذور الكيميائية، والتشعيع) مصادر (الشكل 1)1،2 ،،من34. بين الأضرار الحمض النووي، والحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (جهاز تسوية المنازعات) آفات خطيرة بصفة خاصة وقد تؤدي إلى موت الخلايا أو التسرطن. وقد تنشأ حوالي 50 جهاز تسوية المنازعات كل خلية ودورة الخلية5. في خلايا الثدييات، وضع جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) ونونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) كمسارات رئيسية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات (الشكل 2). الموارد البشرية يحدث في أواخر المرحلة S/G2 ويستخدم أخت سليمة تشروماتيد كقالب لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء. وبالمقارنة، نج نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون مطفرة كما يمكن إضافة زوج قاعدي أو مستأصل قبل ربط نهايات مكسورة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمارس من الانضمام إلى نهاية بديلة كآلية بطيئة مطفرة إصلاح احتياطية في حالة عوز نهيج6،7.

حمل جهاز تسوية المنازعات الفسفرة هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج مجباس حول كل جهاز تسوية المنازعات. البؤر النووية تشكل تسمى البؤر γH2AX ويمكن كشفها ب الفحص المجهري الفلورة8. ΓH2AX تشجع توظيف المزيد من البروتينات المراعية لجهاز تسوية المنازعات، وهو يشارك في الكروماتين يعيد البناء وإصلاح الحمض النووي، والإشارات تنبيغ9. كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، التحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة من الممكن، الذي أثبت في خطوط خلايا السرطان وعينات المرضى10،11، 12 , 13 , 14-53BP1 (البروتين p53 1) بروتين رئيسي آخر في التوسط لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. أنها تشارك في تجنيد المراعية لجهاز تسوية المنازعات البروتينات، مما يشير إلى نقطة تفتيش، وتشابك جهاز تسوية المنازعات تنتهي15. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 يلعب دوراً حاسما في اختيار مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. فإنه بتشغيل إصلاح جهاز تسوية المنازعات نحو نج بينما منعت16ساعة. قد يكون التحليل المتزامن ل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نظراً لمهام حقيقية γH2AX و 53BP1 في إصلاح جهاز تسوية المنازعات، وسيلة مفيدة لتحليل دقيق لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات.

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء الفحص المجهري الفلورة γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية. على وجه التحديد، يتم تطبيق التقنية في الخلايا الليفية العادي الخط الخلية نهدف، في الأشعة السينية المشع لمفاوية فرد صحية وفي CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تفاصيل الأسلوب هي أشارت في سياق النتائج المعروضة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا من "الثاني لجنة الأخلاقيات" في "مانهايم كلية الطب" في جامعة هايدلبرغ. كتب تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأفراد-

1. "إعداد مواد"

  1. حل الأسهم تخثر الدم: تعد حلاً أسهم التخثر 200 وحدة دولية الهيبارين كل مل في كلوريد الصوديوم 0.9%. ملء كل من أنابيب جمع (رسم حجم مل 9) مع 2 مل الحل الأسهم التخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.
  2. حل تحلل للخلايا الحمراء: تحضير 10 × حل تحلل للخلايا الحمراء مع ز 82.91 كلوريد الأمونيوم وبيكربونات الأمونيوم 7.91 ز 2 مل من 0.5 م الإيثيلين حل حمض pH 8.0 بتذويب الوكلاء في الماء المقطر مزدوجة لإجمالي حجم 1 ل.
  3. حل التثبيت: ميليلتر 8.3 إضافة حل هيدروكسيد البوتاسيوم 1 متر إلى 360 ملغ بارافورمالدهيد (PFA) في أنبوب ميكروتيتير. ملء الأنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للعلامة 1 مل من الأنبوب والحرارة الأنبوب في كتلة تدفئة في 95 درجة مئوية للحصول على 1 مل حل منهاج العمل 36%. نقل الحل منهاج العمل 36% 1 مل إلى أنبوب بسعة 15 مل. إضافة 8 مل برنامج تلفزيوني في حل منهاج العمل 36% 1 مل، للحصول على 9 مل حل الأسهم منهاج العمل 4%. قاسمة 4% PFA الحل المخزون والمخزن عند-18 درجة مئوية حتى تستخدم لتثبيت الخلايا.
    تنبيه: 1) هيدروكسيد البوتاسيوم والحل التآكل. كن على علم من حماية العين والجلد. 2) منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان. تجنب تماس الجلد والاستنشاق. إعداد الحل التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-
  4. الحل بيرميبيليزيشن: إضافة 50 ميليلتر أوكتوكسينول 9 إلى 50 مل برنامج تلفزيوني الحصول على حل حوالي 0.1% 9 أوكتوكسينول-
  5. عرقلة الحل: إعداد 5% و % 2 عرقلة الحلول بخلط البروتين عامل حجب مع برنامج تلفزيوني ومخزن في 6 – 8 ° C.

2. إعداد العينات

  1. الليفية في ثقافة الخلية: زراعة الخلايا الليفية البشرية خط الخلية نهدف في هوميديفيد 5% CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 4 مم الجلوتامين، و 1% البنسلين/ستربتوميسين. إزالة الليفية
    1. إعداد شريحة مجهر مع تمسكا
      1. المتوسطة من قارورة (منطقة النمو 2 75 سم) مع تزايد الليفية نهدف أضعافاً مضاعفة. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني قارورة. أغسل الليفية ملتصقة بلطف بالهز يدوياً قارورة للحد الأدنى 1
        2. إزالة برنامج تلفزيوني
      2. وإضافة التربسين 1 مل إلى قارورة. هز قارورة بلطف لضمان شمول جميع الخلايا ملتصقة التربسين. إزالة التربسين من قارورة. وضع في قارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
        3. تأخذ قارورة خارج الحاضنة
      3. وإضافة 10 مل RPMI 1640 المتوسطة إلى قارورة. "الماصة؛" المتوسط صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق الخلايا الليفية.
      4. "الماصة؛" 0.3 مل الليفية متناثرة على كل من هذين المجالين من الشريحة المجهر ووضع الشريحة في الحاضنة ل 24 ساعة حيث أن الخلايا الليفية الانضمام إلى الشريحة. ل immunostaining γH2AX و 53BP1 في نويات الخلايا الليفية، انتقل إلى الخطوة 3، 1-
  2. عينات المرضى
    1. عينات الدم: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل الحل الأسهم التخثر وإضافة 7 مل الدم في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3)-
    2. عينات نخاع العظام: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل من محلول الأسهم التخثر (الخطوة 1، 1) وإضافة 7 مل نخاع العظام في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3). استخدام CD34 ميكروبيدس والخلية أعمدة الفصل لعزل الخلايا CD34 +-
    3. عزل الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي
      ملاحظة: الخلايا وحيدات النوى معزولة من عينات نخاع العظم والدم بكثافة الطرد المركزي التدرج 17 ، ، من 18 19.
      1. ديلوتى عينة الدم هيبارينيزيد بنسبة 1:1 مع برنامج تلفزيوني وعينه نخاع العظم هيبارينيزيد بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين.
        2. إضافة
      2. حجم متوسط الكثافة المتدرجة إلى أنبوب جديد. بلطف طبقة الدم المخفف أو نخاع العظام فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. الحرص على عدم خلط الطبقتين.
      3. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س رسم طبقة البلازما العليا قبالة مع الماصة. ثم بعناية حصاد الخلايا وحيدات النوى في الطبقة فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. نقل الخلايا وحيدات النوى في أنبوب جديد.
        4. إضافة
      4. على الأقل ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني للخلايا وحيدات النوى في الأنبوب. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س
      5. بعد تدور إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من 4 درجة مئوية، 1 x حل تحلل للخلايا الحمراء. ريسوسبيند الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 30 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية والطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س
    4. إعداد سيتوسبينس
      1. إعداد سيتوسبينس اثنين مع الخلايا وحيدات النوى من عينات المرضى (أي، سيتوسبين واحد لتلطيخ الفلورة γH2AX وسيتوسبين واحد ل γH2AX و 53BP1 جنبا إلى جنب تلطيخ الفلورة) بالطرد المركزي (300 x ز، 10 دقيقة) 1.0 × 10 5 خلايا لكل إعداد ( الشكل 3 و 4)-

3-γH2AX و "تلطيخ الفلورة" 53BP1

  1. التثبيت وبيرميبيليزيشن: إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من 4% منهاج العمل لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. ثم بيرميبيليزي الخلايا مع 200 ميليلتر من 0.1% 9 أوكتوكسينول للحد الأدنى 10 يغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من محلول حظر 5% لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. كتلة الخلايا في 30 مل الطازجة 5% إعاقة الحل حاء – 1
  2. الحضانة مع الأجسام المضادة
    1. احتضان إعداد واحدة من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) وإعداد أخرى من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) أرنب [بولكلونل] جسم المضادة-53BP1 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 ° C.
    2. بعد الاحتضان غسل الخلايا بلطف 3 مرات مع 30 مل محلول حظر 2% لكل 5 دقائق على شاكر مختبر.
    3. إزالة الحل حظر واحتضان إعداد الخلايا بجسم ماعز مترافق Alexa488 المضادة ماوس ثانوي (1: 500) الأولى والثانية إعداد الخلايا مع (المضادة ماوس ثانوي جسم ماعز مترافق Alexa488 1: 500) ودونكي Alexa555 مترافق أرنب المضادة ثانوية جسم (1: 500) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  3. المتوسطة التركيب: وضع الشريحة مع الخلايا في وعاء وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لكل 5 دقائق على شاكر معمل. إزالة برنامج تلفزيوني وجبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي. حذر وضع ساترة من فوق المتوسطة متصاعدة حيث تكون لا فقاعات الهواء المضمنة. الانتظار على الأقل 3 ح لتصلّب المتوسطة المتصاعدة قبل تحليل الخلايا بالميكروسكوب fluorescence.

4. تحليل γH2AX و 53BP1 البؤر

  1. المجهري Fluorescence: تحليل البؤر γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية مجهر الأسفار مزودة بمرشحات DAPI و 488 أليكسا Cy3 أثناء التصوير إلى هدف X 100 التكبير. تسجيل الصور مع كاميرا ومعالجة الصور مع برامج التصوير المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا الأكثر دقة في مرحلة G0/G1 و G2 عند ظهور بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة (الشكل 5A). على النقيض من ذلك، تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا أثناء مرحلة ثانية يعقدها تلامس مشتتة γH2AX عموم النووية الناجمة عن عملية النسخ المتماثل (الشكل 5 (ب)).

تم إجراء تثبيت الخلايا مع 4% منهاج عمل بيجين (10 دقيقة) وبيرميبيليزيشن مع 0.1% 9 أوكتوكسينول (10 دقيقة). يمكن اس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل تكوين وإصلاح جهاز تسوية المنازعات في نطاق عريض من المجالات البحثية. معلمات الحرجة التي تؤثر على نتائج هذه التجارب هي مرحلة دورة الخلية، العوامل المستخدمة لتثبيت و permeabilization للخلايا، والاختيار من الأجسام المضادة، والأجهزة والبرمجيات من المجهر الأسفار.

وتجلى تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX تزايد أضعافاً مضاعفة الليفية العادي الخط الخلية نهدف. ظهرت بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة في G0/G1 ومراحل G2 بالمقارنة مع تلامس γH2AX عموم ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد المشروع "الألماني خوسيه كاريراس اللوكيميا المؤسسة" (14 دجكلس R/2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI متوسطSigma-AldrichR0883متوسط لزراعة الخلايا
الصوديوم الهيبارينفارمPZN 3029843  الهيبارين 5,000 وحدة دولية / مل
محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪B. BraunPZN 1957154مكون من محلول مخزون مضاد للتخثر
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02وسيط لعزل الخلايا أحادية النواة
محلول التربسين 10XSigma-Aldrich59427Cإنزيم لتفكك الخلايا الليفية في زراعة الخلايا
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702عزل خلايا السلف النخاعي CD34 +
شرائح المجهر التشخيصيThermo ScientificER-203B-CE24شرائح المجهر
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060  أجهزة الطرد المركزي المنضدية 
غطاء جهاز
غطاء Heraeus76003422للعمل بدون أنابيب صغيرة
حاوية Cytoحاوية Heraeus75003416Cyto مع 2 تجاويف مخروطية
حامل مشبكHeraeus75003414Carrier لحمل حاوية cyto وشريحة
دعم إدراجHeraeus75003417إدراج الدعم ل حمل حامل مشبك
Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112منظف لنفاذية أغشية الخلايا
محلول هيدروكسيد البوتاسيوم 1MMerck Millipore109107ضروري لتحضير محلول بارافورمالدهايد
سيجما-ألدريتشP6148عامل التثبيت
محلول ملحي مخزن فوسفاتسيجما ألدريتشD8537محلول ملح متوازن
ChemiblockerMerck Millipore2170عامل حجب
الماوس أحادي النسيلة مضاد جاما ؛ الجسم المضاد H2AX (JBW301)Merck Millipore05-636الجسم المضاد الأساسي للكشف عن & جاما ؛ H2AX
الأرنب متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد 53BP1 (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304الجسم المضاد الأساسي للكشف عن 53BP1
Alexa Fluor 488 مترافق الماعز المضاد للجسم المضاد للفأرInvitrogenA-11001الجسم المضاد الثانوي
Alexa Fluor 555 المترافق الحمار المضاد للأرانبInvitrogenA-31572المضاد الثانوي
Vectashield تصاعد الوسطVector LaboratoriesH-1200على DAPI لتلوين DNA
Axio Scope.A1Zeiss490035المجهر الفلوري
Cool Cube 1 CCD CameraMetasystemsH-0310-010-MSالكاميرا للتسجيل الرقمي
برنامج IsisMetasystemsغير قابل للتطبيقبرنامج المجهر
نسبةCytospin الجسم يحتوي نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H2AX 53BP1 CD34 H2AX

مقالات ذات صلة