كما الميتوكوندريا فقط نسبة مئوية صغيرة من الخلايا النباتية، أنها تحتاج إلى أن تنقية لمجموعة من الدراسات. يمكن أن تكون الميتوكوندريا المعزولة من مجموعة متنوعة من أجهزة المصنع بالتجانس، متبوعاً بالطرد المركزي التدرج التفاضلية والكثافة للحصول على كسر المتقدرية تنقية عالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية المعنية في الأيضية العديدة في النباتات، ولا سيما إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من أكسدة المركبات المخفضة مثل نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) والادنين فلافين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2). الشرح الكامل لجينوم نبات التمويل قد أنشأ الأكثر استخداماً نظام المصنع النموذجي، وهكذا الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من مجموعة متنوعة من الأجهزة (ورقة أو جذر زهرة) اللازمة للاستفادة الكاملة من الأدوات التي تتوفر الآن لنبات لدراسة البيولوجيا المتقدرية. يتم عزل الميتوكوندريا بتجانس النسيج باستخدام مجموعة متنوعة من النهج، متبوعاً بسلسلة من الخطوات الطرد المركزي التفاضلي المنتجة بيليه المتقدرية النفط خام الذي هو تنقية كذلك استخدام التدرج المستمر كثافة الغروية استخدام الطرد المركزي. بعد ذلك يتم إزالة المواد الغروية الكثافة بخطوات استخدام الطرد المركزي متعددة. ابتداء من 100 غرام أنسجة أوراق جديدة، 2-3 مجم الميتوكوندريا يمكن عادة الحصول على. عرض تجارب الجهاز التنفسي على هذه الميتوكوندريا معدلات نموذجية من 100-250 نمول س2 دقيقة-1 ملغ إجمالي البروتين المتقدرية-1 (NADH-تعتمد على معدل) مع القدرة على استخدام مختلف ركائز ومثبطات لتحديد أي تتأكسد ركائز وقدرة أوكسيداسيس الطرفية الفسفرة وبديلة. ويصف هذا البروتوكول طريقة عزل من الميتوكوندريا من أوراق نبات التمويل باستخدام التدرجات كثافة الغروية المستمر وقياسات الجهاز تنفسي كفاءة الميتوكوندريا محطة تنقية.
المقدمة
يعود تاريخ البحوث النباتية الميتوكوندريا على مدى 100 سنة1. في أوائل الخمسينات أولاً عزلة الميتوكوندريا سليمة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. ظهور التدرج كثافة الغروية في الثمانينات سمح الميتوكوندريا تكون تنقيته دون معاناة التكيف ناضح. بينما الميتوكوندريا المنقي التدرج مناسبة لمعظم الأغراض، نظراً لحساسية الكتلي، ملوثات ثانوية نسبيا حتى يمكن اكتشاف وقد يتم تعيين موقع المتقدرية2غير لائق. استخدام التدفق الحر التفريد يمكن إزالة كل بلاستيديك وبيروكسيسومي التلوث3، لكن حرية تدفق التفريد هو تقنية متخصصة للغاية وغير مطلوب للغالبية العظمى من الدراسات. وعلاوة على ذلك، عند تحديد المكان للبروتين يجب أن يكون ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يستخدم لعزل الميتوكوندريا سليمة من هيئات التمويل نبات يزرع في التربة باستخدام التدرجات كثافة الغروية المستمر. وتنفذ جميع الإجراءات بعد جمع المواد عند 4 درجة مئوية.
1-إعداد طحن العازلة المتوسطة، المياه والصرف الصحي، وحلول متدرجة
- إعداد 300 مل من طحن المتوسطة (ناقص اسكوربات وسيستين) و 200 مل من المخزن المؤقت ليغسل x 2 في الجدول 1 يوم واحد قبل العزلة، وإبقائها الباردة عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: إضافة اسكوربات الصوديوم ولسيستين (قاعدة الحرة) إلى نهائي تركز 17.84 و 20.36 ملم، على التوالي، إلى المتوسطة طحن صباح يوم العزلة. إذا الميتوكوندريا التي ستستخدم للطخة غربية أو الأزرق الأصلي-polyacrylamid....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من الكشف عن مختلف البروتينات المتقدرية بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، البروتين المعزولة من الأنسجة ثقافة المياه غير كافية للكشف عن عصابة خافت (2 ميكروغرام). كثافة إشارة يزيد تناسبياً على المبالغ التي تم تحميلها. الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة التي نمت على لوحات (الشكل 3B)، استجابة للضغوط الخفيفة العالية يمكن أن تحلل المعاملة في مختلف الأنماط الوراثية الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عادة، يترك عزلة الميتوكوندريا من نبات الغلال حتى 3 ملغ الميتوكوندريا من حوالي 80-100 3-النباتات 4-الأسبوع القديمة، على الرغم من أن غلة أكبر من 5 ملغ غالباً ما يمكن أن يتحقق مع طحن دقيق. يختلف مع ظروف نمو العائد ويقلل جذريا كما يترك سينيسسي، على الرغم من أن هيكل الميتوكوندريا ويبدو كذلك الإبقاء على أثناء الشيخوخة9. واحدة من السمات الأكثر أهمية للحصول على عائد جيد هو الأسلوب لطحن إلى الخلايا لإطلاق سراح الميتوكوندريا. بينما عدد من الأجهزة الميكانيكية طحن متاحة للشراء، لنبات طحن بقذائف الهاون والمدقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذه الدراسة وأيده "الأسترالية مجلس المركز المتميز للبحوث" في مصنع الطاقة علم الأحياء CE140100008، الأسترالية مجلس المستقبل زمالة بحثية (FT130100112) إلى MWM، وزمالة أبحاث لنن فيودور (ألكسندر فون همبولت مؤسسة، وألمانيا) لشبيبة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Antimycin الكيميائي |
| A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical ، يذوب في |
| الجسم المضاد | من Tom Elthon | Elthon et al. ، 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase من Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| ألبومين مصل الأبقار الكيميائي (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | الوضوح الكيميائي |
| الركيزة الغربية ECL | مختبرات Bio-Rad | 1705061 | الكيميائي |
| المواد الهلامية مسبقة الصب الخالية من البقع 8-16٪ 18 مختبرات بيورز | بيو | راد 5678104 | السيانيد الكيميائي |
| سيجما ألدريتش | 60178 | كيميائي | |
| السيتوكروم ج | سيجما ألدريتش | C3131 | كيميائي |
| ديفكو أجار ، حبيبات | BD Biosciences | 214530 | كيميائي |
| ديثيوتريتول | سيجما ألدريتش | D0632 | الكيميائي |
| EDTA ملح ثنائي الصوديوم | سيجما ألدريتش | E5134 | الكيميائية |
| Gamborg B-5 القاعدية المتوسطة | Austratec | G398-100L | الكيميائية |
| محلول فيتامين Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | |
| ماعز كيميائي مضاد للفأر IgG (H + L) -HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2 مل | |
| ماعز كيميائي مضاد للأرانب IgG (H + L) -HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | كيميائي |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | |
| كبريتات | المغنيسيوم الكيميائيةسيجما ألدريتش | 230391 | كيماويات |
| Murashige & خليط الملح القاعدي Skoog (MS) | Austratec | M524-100L | كيميائي |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | كيميائي ، يذوب في الإيثانول |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | |
| الجسم المضاد الكيميائي Ndufs4 | من Etienne Meyer | Meyer et al. ، 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | الكيميائية ، تذوب في الإيثانول |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | مادة كيميائية ، تدرج الكثافة الغروية |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | سيانيد البوتاسيوم الكيميائي |
| Sigma-Aldrich | 60178 | ||
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4) Sigma-Aldrich | P5655 | البيروفات | |
| الكيميائي سيجما ألدريتش | P2256 | كلوريد الصوديوم الكيميائي | |
| Chem-Supply | SA046 | كيميائي | |
| ثنائي ثيونيت الصوديوم | سيجما ألدريتش | 157953 | كيميائي |
| الصوديوم L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | سكسينات كيميائية |
| Sigma-Aldrich | S2378 | السكروز الكيميائي | |
| Chem-Supply | SA030 | الكيميائية | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | كيميائي |
| رباعي الصوديوم بيروفوسفات (Na4P2O7 & middot ؛ 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | الكيميائية |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories Bio-Rad | Laboratories 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | الكيميائية والمنظفات |
| كاشف الحجب الغربي | سيجما | 11921681001 | التوازن الكيميائي |
| Mettler توليدو | XS204 | معدات | |
| أكواب | Isolab | 50 مل | |
| أجهزة الطرد المركزي | بيكمان كولتر | أفانتي J-26XP | معدات |
| أنابيب الطرد المركزي | Nalgene | 3117-9500 | معدات |
| تعميم | Julabo | 1124971 | المرفقة غرفة قطب الأكسجين |
| قارورة مخروطية | Isolab | 500 مل | |
| قطارة | 3 مل | ||
| دوار بزاوية ثابتة | Beckman Coulter | JA25.5 | قمع المعدات |
| لكل Alimenti | 14 سم | لتصفية | |
| مدفق التدرج | Bio-Rad | 165-4120 | لتحضير التدرجات |
| النمام المغناطيسي ATE | معدات F20300165 VELP Scientifica | ||
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | مواد الترشيح |
| الملاط والمدقة | جيمي أوليفر | جرانيت ، معدات 6 بوصات | |
| O2view | Hansatech Instruments | برنامج مراقبة الأكسجين | |
| نظام Oxygraph Plus | نظام Hansatech Instruments | 1187253 | الأكسجين من نوع كلارك |
| فرشاة | الرسم الفنان الخيار الأول | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | البلاستيك فيلم البارافين |
| مضخة التمعجية | جيلسون | F155001 | لإعداد التدرجات |
| الأنابيب التمعجية | جيلسون | F117930 | لإعداد التدرجات |
| حمام مائي | VELP Scientifica | OCB | المعدات |
المراجع
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
