كما الميتوكوندريا فقط نسبة مئوية صغيرة من الخلايا النباتية، أنها تحتاج إلى أن تنقية لمجموعة من الدراسات. يمكن أن تكون الميتوكوندريا المعزولة من مجموعة متنوعة من أجهزة المصنع بالتجانس، متبوعاً بالطرد المركزي التدرج التفاضلية والكثافة للحصول على كسر المتقدرية تنقية عالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية المعنية في الأيضية العديدة في النباتات، ولا سيما إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من أكسدة المركبات المخفضة مثل نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) والادنين فلافين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2). الشرح الكامل لجينوم نبات التمويل قد أنشأ الأكثر استخداماً نظام المصنع النموذجي، وهكذا الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من مجموعة متنوعة من الأجهزة (ورقة أو جذر زهرة) اللازمة للاستفادة الكاملة من الأدوات التي تتوفر الآن لنبات لدراسة البيولوجيا المتقدرية. يتم عزل الميتوكوندريا بتجانس النسيج باستخدام مجموعة متنوعة من النهج، متبوعاً بسلسلة من الخطوات الطرد المركزي التفاضلي المنتجة بيليه المتقدرية النفط خام الذي هو تنقية كذلك استخدام التدرج المستمر كثافة الغروية استخدام الطرد المركزي. بعد ذلك يتم إزالة المواد الغروية الكثافة بخطوات استخدام الطرد المركزي متعددة. ابتداء من 100 غرام أنسجة أوراق جديدة، 2-3 مجم الميتوكوندريا يمكن عادة الحصول على. عرض تجارب الجهاز التنفسي على هذه الميتوكوندريا معدلات نموذجية من 100-250 نمول س2 دقيقة-1 ملغ إجمالي البروتين المتقدرية-1 (NADH-تعتمد على معدل) مع القدرة على استخدام مختلف ركائز ومثبطات لتحديد أي تتأكسد ركائز وقدرة أوكسيداسيس الطرفية الفسفرة وبديلة. ويصف هذا البروتوكول طريقة عزل من الميتوكوندريا من أوراق نبات التمويل باستخدام التدرجات كثافة الغروية المستمر وقياسات الجهاز تنفسي كفاءة الميتوكوندريا محطة تنقية.
المقدمة
يعود تاريخ البحوث النباتية الميتوكوندريا على مدى 100 سنة1. في أوائل الخمسينات أولاً عزلة الميتوكوندريا سليمة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. ظهور التدرج كثافة الغروية في الثمانينات سمح الميتوكوندريا تكون تنقيته دون معاناة التكيف ناضح. بينما الميتوكوندريا المنقي التدرج مناسبة لمعظم الأغراض، نظراً لحساسية الكتلي، ملوثات ثانوية نسبيا حتى يمكن اكتشاف وقد يتم تعيين موقع المتقدرية2غير لائق. استخدام التدفق الحر التفريد يمكن إزالة كل بلاستيديك وبيروكسيسومي التلوث3، لكن حرية تدفق التفريد هو تقنية متخصصة للغاية وغير مطلوب للغالبية العظمى من الدراسات. وعلاوة على ذلك، عند تحديد المكان للبروتين يجب أن يكون التذكير بأن جنسية مزدوجة أو متعددة استهداف البروتينات يحدث في الخلايا. يرد ما يزيد على 100 من البروتينات المستهدفة المزدوج للمعايشة/للبلاستيده والميتوكوندريا4، وعدد من البروتينات المستهدفة إلى الميتوكوندريا وبيروكسيسوميس ومن المعروف أيضا5. وعلاوة على ذلك، موقع إعادة البروتينات تحت حوافز محددة، مثل الأكسدة، موضوع ناشئة في بيولوجيا الخلية6. وهكذا، موقع البروتينات يجب أن يؤخذ في سياق درس البيولوجيا، ويتم استخدام مجموعة متنوعة من النهج لتحديد والتحقق من الموقع2.
الميتوكوندريا عادة معزولة من الأنسجة النباتية بالتجانس، وتوازن مطلوب بين كسر جدار الخلية لإطلاق سراح الميتوكوندريا مفتوحة، ولا يضر الميتوكوندريا. تقليديا، التجانس مع البطاطا والقنبيط، ينطوي على استخدام الأجهزة المنزلية خلاط/عصارة جعل استخراج سائل في مخزن مؤقت مع المكونات المختلفة للمحافظة على النشاط. عزل الميتوكوندريا من أوراق البازلاء، (مادة شعبية لعزل المتقدرية استخدام الشتلات الشباب (~ 10 أيام القديمة)، يستخدم خلاط الخلايا كما مادة نبات الناعمة. مع توافر التمويل نبات تي-دنا insertional المغلوب خطوط، الحاجة إلى أن تكون قادرة على تنقية الميتوكوندريا القيام بالدراسات الفنية قد استلزم استحداث طرق لعزل الميتوكوندريا من أوراق أو الجذر أو زهرة الأنسجة. عموما الأساليب المتقدمة لنباتات أخرى عملت جيدا7، مع يستوفوا طحن المواد التي تحتاج إلى تحسين. لنبات وهذا يمكن تحقيقه في مجموعة متنوعة من الطرق (انظر أدناه)، ويختلف بين أنواع الأنسجة (جذر مقابل إطلاق النار). كما يمكن أن يكون الأمثل استخدام الانحدار المستمر ككثافة الميتوكوندريا من مختلف الأجهزة أو مراحل النمو يعني يمكن أن تهاجر بشكل مختلف. وهكذا، لفصل الحد الأقصى يمكن أن كثافة التدرج المكرر لضمان تحقيق أفضل الانفصال.
مرة المنقي الميتوكوندريا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك تجارب امتصاص البروتين والحمض الريبي النووي النقال وفحوصات نشاط الإنزيم وقياسات سلسلة التنفس وتحليل لطخة غربية. يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة لتحليل الطيف الكتلي لوفرة البروتين. المستهدفة من رد فعل متعددة رصد التحليلات (MRM) يسمح للتحديد الكمي لتعريف البروتينات، ولكن تتطلب التنمية المقايسة كبيرة. على النقيض من ذلك، يوفر القياس الكمي بثنائي أو أخرى تسميات النظائر8، نهج اكتشاف في تحديد الاختلافات عبر البروتين الكامل التي يمكن استخدامها للكشف عن رؤى البيولوجية رواية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يستخدم لعزل الميتوكوندريا سليمة من هيئات التمويل نبات يزرع في التربة باستخدام التدرجات كثافة الغروية المستمر. وتنفذ جميع الإجراءات بعد جمع المواد عند 4 درجة مئوية.
1-إعداد طحن العازلة المتوسطة، المياه والصرف الصحي، وحلول متدرجة
- إعداد 300 مل من طحن المتوسطة (ناقص اسكوربات وسيستين) و 200 مل من المخزن المؤقت ليغسل x 2 في الجدول 1 يوم واحد قبل العزلة، وإبقائها الباردة عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: إضافة اسكوربات الصوديوم ولسيستين (قاعدة الحرة) إلى نهائي تركز 17.84 و 20.36 ملم، على التوالي، إلى المتوسطة طحن صباح يوم العزلة. إذا الميتوكوندريا التي ستستخدم للطخة غربية أو الأزرق الأصلي-polyacrylamide جل التحليلات التفريد (BN-صفحة)، يشكلون 2 × أغسل المخزن المؤقت دون جيش صرب البوسنة. - إعداد التدرجات في صباح العزلة المتقدرية (الشكل 1 و الجدول 1).
- جعل الحلول التدرج الثقيلة والخفيفة في قنينة اثنين؛ 35 مل من كل غير كافية أنبوبين التدرج.
- أغسل دوائر برير التدرج والأنابيب البلاستيكية تحوي مع المياه. وضمان تدفق حتى من خلال الأنبوب من جميع الأنابيب.
- 2 مكان أنابيب الطرد المركزي (50 مل) بزاوية طفيفة على الجليد مع منافذ تحوي أنابيب PVC مسجلة إلى داخل الأنابيب لضمان الحل التدرج الذي يمتد أسفل الجانب من الأنابيب.
- إغلاق الاتصال بين الدوائر الداخلية والخارجية (ذراع سوداء إلى أسفل). ضع برير التدرج على محرض مغناطيسي مع شريط ضجة صغيرة في الدائرة الداخلية.
- صب 35 مل الثقيلة الحل التدرج في الدائرة الداخلية (الدائرة مع منفذ أنابيب). الاستغناء عن الحل التدرج الثقيلة في أنابيب الطرد المركزي اثنين توضع على الجليد حتى نصف المتبقية مع معدل مضخة تمعجية تعيين إلى سريع (300 مل/ساعة).
- صب الحل 35 مل التدرج الخفيفة في الدائرة الخارجية (الدائرة دون مأخذ أنابيب). فتح الاتصال بين الدوائر (ذراع دفع السود حتى منتصف الطريق) والسماح بإيجاد حلول للمزيج بلطف. مزيج من الحلول استخدام محرض المغناطيسية.
- السماح للحلول التي تعمل ببطء (60 مل/ساعة) حتى كل من مزيج التدرج قد تم الاستغناء عن دوائر أسفر عن اثنين من 0-أنابيب مملوءة بالتدرج بوفيدون (حماية الأصناف النباتية) 4.4% (w/v). إبقاء التدرجات على الجليد حتى جاهزة للاستخدام في "الخطوة 2، 12".
ملاحظة: بمجرد تم إعداد التدرج، تمييع 2 × أغسل المتوسطة إلى س 1 مع بريشيليد--المياه وإبقاء الباردة عند 4 درجة مئوية.
2-التجانس والعزلة المتقدرية
- قطع الأنسجة روزيت كله من 4-الأسبوع القديمة نبات النباتات المزروعة في التربة مع مقص، سيلزم النباتات على الأقل 80 للإعدادية 1.
ملاحظة: يوم 10-14 القديمة المياه الثقافات، 5 الحد الأدنى كما يمكن استخدام الأواني/الإعدادية، أو 2-الأسبوع القديمة الشتلات المزروعة في لوحات أجار Murashige & سكوغ خليط الملح القاعدي (MS)، الحد الأدنى من 4 لوحات،. - ضع نصف المواد النباتية التي قسمت إلى قطع صغيرة في يبرد قبل 4 درجات مئوية كبيرة قذائف هاون ومدقة مع 75 مل من طحن المتوسطة (الجدول 1)، وطحن على نطاق واسع لعدة دقائق حتى يتم ترك لا قطعة كبيرة من الأنسجة.
- قبل الرطب 4 طبقات من مواد الترشيح (22-25 حجم المسام ميكرومتر) مع طحن المتوسطة وتصفية هوموجيناتي من خلال 4 طبقات من مواد الترشيح من خلال قمع بلاستيك في قارورة مخروطية 500 مل.
- طحن النصف المتبقي من الأنسجة مع آخر 75 مل من طحن المتوسطة.
- الجمع بين هوموجيناتيس في مواد تنقية وتصفية بقدر ما يمكن هوموجيناتي من خلال.
- تطحن الأنسجة المتبقية المتبقية على مواد الترشيح مرة أخرى مع 150 مل المتبقية لطحن المتوسطة، عامل التصفية مرة أخرى إلى دورق مخروطي 500 مل.
- الطرد المركزي هوموجيناتي المصفاة في أنابيب بلاستيكية أجهزة الطرد المركزي مبردة مسبقاً 50 مل 8 في س 2,500 ز في 4 درجات مئوية في دوار زاوية ثابتة لمدة 5 دقائق.
- صب المادة طافية في أنابيب الطرد المركزي نظيفة (50 مل؛ تجنب إزعاج بيليه الأخضر) وأجهزة الطرد المركزي في 17,500 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دوار زاوية ثابتة.
- تجاهل جميع ولكن < 3 مل من المادة طافية بالشفط (أو بلطف من أجل إيقاف دون إزعاج بيليه). بلطف ريسوسبيند بيليه في المادة طافية المتبقية باستخدام الرسام غرامة صغيرة.
- أضف 10 مل 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل أنبوبة والجمع أنابيب 4 في أنبوب الطرد المركزي النظيفة 1 (أي، مما أدى إلى أنابيب 2).
- ملء هذه الأنابيب مع المخزن المؤقت ليغسل 1 x إلى 50 مل وكرر الخطوات 2.7-2.9.
- تجمع الكريات المتقدرية الخام إلى 1 الأنبوبة باستخدام قطارة وتفريق بالتساوي مع الرسام غرامة (يمكن استخدام كمية صغيرة من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ولكن وحدة التخزين النهائي يجب أن يكون أقل من 3 مل لاحتوائه على رأس التدرج). بلطف طبقة تعليق المتقدرية مع بقطاره إلى 4.4 ٪ (w/v) 0-المستمر 2 حماية الأصناف النباتية التدرجات.
- تحقيق التوازن بين الأنابيب حسب الوزن (باستخدام 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي) والطرد المركزي في 40,000 ز x عند 4 درجة مئوية عن 40 دقيقة تكفل متوقفاً الكسر. الميتوكوندريا سوف تهاجر إلى فرقة القرب من الجزء السفلي من الأنبوب، أو قد تكون موجودة في الحل الثقيلة في الجزء السفلي من الأنبوب (المعرفة بواسطة عصابة غائم، صفراء؛ الشكل 2).
- بعناية إزالة 5 سم العليا من الحل أعلاه الفرقة المتقدرية بالطموح.
- توزيع الحل المتبقية المحتوية على الميتوكوندريا في أنابيب نظيفة 2 وملء مع 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. توزيع بالتساوي التدرج كثافة الغروية والميتوكوندريا التي تغطي فم الأنبوب مع فيلم بارافين بلاستيك وعكس عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 31,000 ز في 4 درجات مئوية مع الكبح بطيئة.
ملاحظة: قبل استخدام الطرد المركزي، تأكد من الميتوكوندريا والتدرج كثافة الغروية المتبقية وتوزع بالتساوي. وبخلاف ذلك، قد يكون التدرج اللوني الغرواني الكثافة التركيز في الجزء السفلي من الأنبوب ومنع التكوير من الميتوكوندريا. - إزالة المادة طافية بالطموح، ملء الأنبوب مع الغسيل 1 x المخزن المؤقت يصل إلى 50 مل، وعكس مرة أخرى التأكد من خلط. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 31,000 س ز في 4 درجات مئوية مع الكبح بطيئة.
- نضح المادة طافية وجمع الكريات المتقدرية في كالصغيرة وحدة تخزين (~ 500 ميليلتر) ممكن استخدام ماصة تعديل نصائح ميليلتر 200 (قص التلميح قليلاً أعلاه نهايتها لزيادة فتح). ضع الميتوكوندريا في أنبوب 1.5 مل والحفاظ على الجليد للاستخدام الفوري أو مخزن في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كان سيتم استخدام الميتوكوندريا للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، BN-الصفحة، أو تحليلات immunoblot، استخدام 1 × أغسل المخزن المؤقت دون جيش صرب البوسنة ليغسل النهائية (أي، خطوة 2.15 و 2.16). - تحديد تركيز البروتين الميتوكوندريا استخدام الأسلوب برادفورد.
ملاحظة: لمختبرين الطرد المركزي BN-الصفحة 4 درجات مئوية، وبيليه مخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لقياس استهلاك الأوكسجين، ويمكن استخدام الميتوكوندريا المعزولة حديثا فقط.
3-الأكسجين قياسات الاستهلاك
ملاحظة: استهلاك الأوكسجين بعزل طازجة النبات يمكن تحليل الميتوكوندريا مع قطب كهربائي أكسجين نوع كلارك، مما يتيح تحديد intactness الميتوكوندريا، السيتوكروم ج مسار النشاط، ونشاط مسار بديل.
- تثبيت البرامج
- تثبيت مرخص الأكسجين رصد البرمجيات على جهاز الكمبيوتر يستخدم لقياس استهلاك الأوكسجين.
- إعداد متوسطة التنفس وركائز والمحاليل الكيميائية الأسهم ومسرى الأوكسجين من نوع كلارك
- يعد التنفس المتوسطة (300 ملم السكروز، كلوريد الصوديوم، 5 مم خ2ص4، 2 مم MgSO4، 10 مم 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA)، 10 مم تدريب الإحصائيين الأوروبيين (الرقم الهيدروجيني 7.2)) تستخدم لفحوصات استهلاك الأوكسجين.
- تعد ركائز ومثبطات، والمستجيبة يستخدم لقياس التنفس المتقدرية (الجدول 2). وهذه يمكن إعداده في وقت سابق والمخزنة في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: تحييد الرقم الهيدروجيني لحلول الحمضية مثل الأحماض العضوية على درجة الحموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم قبل الاستخدام. - حرارة متوسطة تنفس بنفس درجة الحرارة كقاعة الفحص (25 درجة مئوية).
- تجميع مسرى الأوكسجين كلارك من نوع كما هو موضح في البروتوكول من الشركة المصنعة.
- ضع 1 مل من الماء الهواء المشبعة (هو الحصول على المياه الهواء المشبعة بقوة تهز كمية صغيرة من المياه في قارورة مخروطية كبيرة) في قاعة قياس. للتبديل على محرض، انقر فوق الزر "محرض بسرعة". انقر فوق الزر "تشغيل" وتعيين سرعة محرض إلى 65 لفة في الدقيقة. انقر فوق "موافق" للمتابعة. يحرك الماء باستمرار عند 25 درجة مئوية.
- معايرة لقطب الأكسجين
- حرارة المياه التي سيتم استخدامها لمعايرة لنفس درجة الحرارة كقاعة الفحص (25 درجة مئوية).
- انتظر الحالية لتحقيق الاستقرار ومعايرة مسرى الأوكسجين.
- لبدء المعايرة لمسرى الأوكسجين، انقر فوق الزر "معايرة"، حدد "المعايرة المرحلة السائلة"، ومن ثم "المياه المشبعة الجوية".
- سيتم فتح نافذة جديدة (معايرة الأوكسجين (الطور السائل)-الخطوة 1 من 5). قم بتحديد القناة معايرة (قناة يتم إرفاقه في مربع عنصر التحكم الكهربائي) وإدخال متغيرات (مجموعة "درجة حرارة الغرفة" إلى 25 درجة مئوية و "الضغط الجوي" للجيش الشعبي الكوري 101.32). انقر فوق "موافق" للمتابعة.
- بالتالي الخطوة (الخطوة 2 من 5)، إعداد سرعة محرض (65 لفة في الدقيقة) وانقر فوق "موافق" للمتابعة.
- في الخطوة 3 من 5, انتظر إشارة إلى التوصل إلى هضبة. المصطلح "الهضبة الذي تم التوصل إليه، اضغط موافق للمتابعة" سوف تظهر في المربع. انقر فوق "موافق" للمتابعة.
- في الخطوة 4 من 5, إنشاء صفر الأكسجين في الدائرة بإضافة 5 ملغ صوديوم ديثيونيتي. انقر فوق "موافق" للمتابعة.
ملاحظة: يجب أن تكون مرئية في التتبع انخفاضا في تركيز الأوكسجين وينبغي أن تصل إلى 0. - في الخطوة الأخيرة من المعايرة (الخطوة 5 من 5)، انتظر للإشارة إلى الوصول إلى هضبة. المصطلح "الهضبة الذي تم التوصل إليه، اضغط موافق للمتابعة" سوف تظهر في المربع. انقر فوق "موافق" للمتابعة.
- انقر فوق "حفظ المعايرة" لحفظ المعايرة. سيتم فتح نافذة جديدة. انقر فوق "موافق" لتأكيد لحفظ المعايرة الجديدة في مربع عنصر التحكم الأوكسجين.
ملاحظة: بعد نجاح المعايرة، سوف تظهر وصفها "الأوكسجين (نمول/mL)" على المحور ص. - بعد المعايرة، تنظيف غرفة قياس قبل الشطف الدائرة مع الماء (على الأقل 5-10 مرات) لضمان النظافة المناسبة. مل 1 مكان للتنفس المتوسطة إلى قياس الدائرة، والسماح لحجته لبضع دقائق حتى يتم تتبع استهلاك الأوكسجين الخطي الغشاء.
- التكيف مع جدول تتبع استهلاك الأكسجين للحصول على عرض منحدر جيدة. انقر فوق "تكبير/تصغير س ص" وإدخال متغيرات (تعيين "الأكسجين" إلى 0-300، و "محور الوقت" إلى 0-45 دقيقة).
- تصميم السلامة المتقدرية
- مع الغطاس مفتوحة، إضافة ميليلتر 970 تنفس الهواء المشبعة المتوسطة إلى دائرة رد الفعل.
- إضافة 30 ميليلتر معزولة الميتوكوندريا أو 150 ميكروغرام من مجموع البروتين المتقدرية يحددها بعد عزلة الميتوكوندريا (مجموع البروتين يجب أن يدرج في الحسابات بعد ذلك) إلى دائرة رد الفعل باستخدام ماصة مع تلميح قص.
- إثارة تعليق المتقدرية باستمرار استخدام محرض مغناطيسية بار (65 لفة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية الهواء تشبع الحل.
- ختم الدائرة مع المكبس، انقر فوق "بدء التسجيل" لتسجيل استهلاك الأوكسجين، والسماح بتتبع استهلاك الأكسجين لاستقرار (1-2 دقيقة).
- تحديد معدل استهلاك الأكسجين يدوياً بعد إضافة اسكوربات 10 ملم و 25 ميكرومتر الفسفرة ج لمدة 5 دقائق للحصول على معدل "قبل المنظفات".
ملاحظة: لتسمية إضافة ركائز، ومثبطات، والمستجيبة مباشرة في التتبع، انقر فوق الزر "إضافة علامة الحدث" وأدخل تسمية تسمية المطابق. انقر فوق "موافق" للمتابعة. - تحديد معدل استهلاك الأكسجين يدوياً لمدة 3 دقائق بعد إضافة المنظفات 0.05% (v/v) لإعطاء معدل "بعد المنظفات". انقر فوق "إيقاف التسجيل".
- انقر فوق الزر "جدول أسعار التغيير". 2 المؤشرات تظهر كخطوط عمودية على شاشة الرسم البياني. انقر واسحب زوج المؤشرات معدل للوظائف المطلوبة في التتبع لتحديد معدل الفاصل الزمني. أنقل الفاصل الزمني المعدل على طول التتبع باستخدام رأس المؤشر الأيسر معدل. تعيين الفاصل الزمني المعدل نفسه باستخدام المؤشر المعدل الصحيح. الأكسجين رصد البرامج تلقائياً رسم خط لتناسب أفضل بين المؤشرات اثنين بينما تتحرك في معدل الفاصل الزمني للمؤشرات على طول التتبع.
- بمجرد تم تعريف الفاصل الزمني المعدل المنشود والموقف، إدخال المعدل في الجدول مع حق انقر على واحد المؤشرات 2، وحدد "إضافة معدل للجدول". انقر فوق الزر "إضافة" لتأكيد عرض المعدل على الجدول المعدل الأساسي.
- حساب سلامة المتقدرية بقسمة معدل "قبل المنظفات" نسبة "بعد المنظفات"، معبراً عنه بنسبة مئوية، وطرح عليه من 100.
- تصميم التنفس المتقدرية
- مع الغطاس مفتوحة، إضافة ميليلتر 970 من تنفس الهواء المشبعة المتوسطة إلى دائرة رد الفعل. إضافة 500 ميكرومتر ATP و 30 ميليلتر معزولة الميتوكوندريا أو 150 ميكروغرام من مجموع البروتين المتقدرية استخدام ماصة مع تلميح قص إلى متوسط التنفس في دائرة رد الفعل.
- إثارة تعليق المتقدرية باستمرار استخدام محرض مغناطيسية بار (65 لفة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية.
- إغلاق المكبس، انقر فوق "بدء التسجيل" لتسجيل استهلاك الأوكسجين، والانتظار لمدة 1-2 دقيقة لمعدل استهلاك الأوكسجين لتحقيق الاستقرار (عند تتبع استهلاك الأوكسجين الخطي). إضافة succinate 5 ملم. سجل معدل استهلاك الأوكسجين لحوالي 2 دقيقة.
ملاحظة: لتسمية إضافة ركائز، ومثبطات، والمستجيبة مباشرة في التتبع، انقر فوق الزر "إضافة علامة الحدث" وأدخل تسمية تسمية المطابق. انقر فوق "موافق" للمتابعة. - أضف 1 مم الادينوسين diphosphate (ADP). تواصل تسجيل معدل استهلاك الأكسجين لمدة 2 دقيقة.
- أضف 1 مم NADH. سجل معدل استهلاك الأكسجين لمدة 4-8 دقائق. هذا المعدل هو قدرة التنفس عن طريق السيتوكروم أوكسيديز.
- إضافة 1 مم سيانيد البوتاسيوم (KCN) (أو 2.5 ميكرون ميكسوثيازول أو 5 ميكرومتر أنتيميسين A) تعوق مسار السيتوكروم ج ، والاستمرار في تسجيل لحوالي 2 دقيقة لمراقبة استهلاك الأكسجين عن طريق أوكسيديز البديلة.
- إضافة 5 مم ديثيوثريتول (DTT) وبيروفات 10 ملم تنشيط أوكسيديز البديلة بالكامل. الاستمرار في تسجيل لمدة 5-7 دقائق: هذا هو قدرة أوكسيديز البديلة.
- إضافة 500 ميكرومتر البروبيل – يبيغاللوكاتيشين (nPG)، وسجل لمدة 2 دقيقة. ويقيم هذا معدل استهلاك الأوكسجين المتبقية التي لا يمكن أن تحول دون كيميائيا. قم بطرح هذا المعدل من المعدلات الأخرى المسجلة، كما أنه من غير المحتمل أن تكون المتقدرية في الأصل. استهلاك الأوكسجين التي ما زالت تحدث بعد تثبيط السيتوكروم ج وممر أوكس (بواسطة KCN و nPG) من المحتمل جداً أن تأتي من بيروكسيداسيس الحالية كملوثات في الميتوكوندريا المعزولة9.
- انقر فوق "إيقاف التسجيل".
- انقر فوق الزر "جدول أسعار التغيير" وإدخال المعدل في الجدول مع حق انقر على واحد من المؤشرات اثنين، وحدد "إضافة المعدل لجدول". انقر فوق الزر "إضافة" لتأكيد عرض المعدل على الجدول المعدل الأساسي.
ملاحظة: عند إضافة المستجيبة المذابة في المذيبات العضوية (مثلاً.، أنتيميسين أ، nPG، ميكسوثيازول)، الدائرة والغطاس يجب شطفها مع الإيثانول والمياه ثم ضمان التنظيف السليم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول، تمكنا من الكشف عن مختلف البروتينات المتقدرية بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، البروتين المعزولة من الأنسجة ثقافة المياه غير كافية للكشف عن عصابة خافت (2 ميكروغرام). كثافة إشارة يزيد تناسبياً على المبالغ التي تم تحميلها. الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة التي نمت على لوحات (الشكل 3B)، استجابة للضغوط الخفيفة العالية يمكن أن تحلل المعاملة في مختلف الأنماط الوراثية الت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عادة، يترك عزلة الميتوكوندريا من نبات الغلال حتى 3 ملغ الميتوكوندريا من حوالي 80-100 3-النباتات 4-الأسبوع القديمة، على الرغم من أن غلة أكبر من 5 ملغ غالباً ما يمكن أن يتحقق مع طحن دقيق. يختلف مع ظروف نمو العائد ويقلل جذريا كما يترك سينيسسي، على الرغم من أن هيكل الميتوكوندريا ويبدو كذلك الإبقاء على أثناء الشيخوخة9. واحدة من السمات الأكثر أهمية للحصول على عائد جيد هو الأسلوب لطحن إلى الخلايا لإطلاق سراح الميتوكوندريا. بينما عدد من الأجهزة الميكانيكية طحن متاحة للشراء، لنبات طحن بقذائف الهاون والمدقة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذه الدراسة وأيده "الأسترالية مجلس المركز المتميز للبحوث" في مصنع الطاقة علم الأحياء CE140100008، الأسترالية مجلس المستقبل زمالة بحثية (FT130100112) إلى MWM، وزمالة أبحاث لنن فيودور (ألكسندر فون همبولت مؤسسة، وألمانيا) لشبيبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Antimycin الكيميائي |
| A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical ، يذوب في |
| الجسم المضاد | من Tom Elthon | Elthon et al. ، 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase من Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| ألبومين مصل الأبقار الكيميائي (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | الوضوح الكيميائي |
| الركيزة الغربية ECL | مختبرات Bio-Rad | 1705061 | الكيميائي |
| المواد الهلامية مسبقة الصب الخالية من البقع 8-16٪ 18 مختبرات بيورز | بيو | راد 5678104 | السيانيد الكيميائي |
| سيجما ألدريتش | 60178 | كيميائي | |
| السيتوكروم ج | سيجما ألدريتش | C3131 | كيميائي |
| ديفكو أجار ، حبيبات | BD Biosciences | 214530 | كيميائي |
| ديثيوتريتول | سيجما ألدريتش | D0632 | الكيميائي |
| EDTA ملح ثنائي الصوديوم | سيجما ألدريتش | E5134 | الكيميائية |
| Gamborg B-5 القاعدية المتوسطة | Austratec | G398-100L | الكيميائية |
| محلول فيتامين Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | |
| ماعز كيميائي مضاد للفأر IgG (H + L) -HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2 مل | |
| ماعز كيميائي مضاد للأرانب IgG (H + L) -HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | كيميائي |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | |
| كبريتات | المغنيسيوم الكيميائيةسيجما ألدريتش | 230391 | كيماويات |
| Murashige & خليط الملح القاعدي Skoog (MS) | Austratec | M524-100L | كيميائي |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | كيميائي ، يذوب في الإيثانول |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | |
| الجسم المضاد الكيميائي Ndufs4 | من Etienne Meyer | Meyer et al. ، 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | الكيميائية ، تذوب في الإيثانول |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | مادة كيميائية ، تدرج الكثافة الغروية |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | سيانيد البوتاسيوم الكيميائي |
| Sigma-Aldrich | 60178 | ||
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4) Sigma-Aldrich | P5655 | البيروفات | |
| الكيميائي سيجما ألدريتش | P2256 | كلوريد الصوديوم الكيميائي | |
| Chem-Supply | SA046 | كيميائي | |
| ثنائي ثيونيت الصوديوم | سيجما ألدريتش | 157953 | كيميائي |
| الصوديوم L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | سكسينات كيميائية |
| Sigma-Aldrich | S2378 | السكروز الكيميائي | |
| Chem-Supply | SA030 | الكيميائية | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | كيميائي |
| رباعي الصوديوم بيروفوسفات (Na4P2O7 & middot ؛ 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | الكيميائية |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories Bio-Rad | Laboratories 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | الكيميائية والمنظفات |
| كاشف الحجب الغربي | سيجما | 11921681001 | التوازن الكيميائي |
| Mettler توليدو | XS204 | معدات | |
| أكواب | Isolab | 50 مل | |
| أجهزة الطرد المركزي | بيكمان كولتر | أفانتي J-26XP | معدات |
| أنابيب الطرد المركزي | Nalgene | 3117-9500 | معدات |
| تعميم | Julabo | 1124971 | المرفقة غرفة قطب الأكسجين |
| قارورة مخروطية | Isolab | 500 مل | |
| قطارة | 3 مل | ||
| دوار بزاوية ثابتة | Beckman Coulter | JA25.5 | قمع المعدات |
| لكل Alimenti | 14 سم | لتصفية | |
| مدفق التدرج | Bio-Rad | 165-4120 | لتحضير التدرجات |
| النمام المغناطيسي ATE | معدات F20300165 VELP Scientifica | ||
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | مواد الترشيح |
| الملاط والمدقة | جيمي أوليفر | جرانيت ، معدات 6 بوصات | |
| O2view | Hansatech Instruments | برنامج مراقبة الأكسجين | |
| نظام Oxygraph Plus | نظام Hansatech Instruments | 1187253 | الأكسجين من نوع كلارك |
| فرشاة | الرسم الفنان الخيار الأول | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | البلاستيك فيلم البارافين |
| مضخة التمعجية | جيلسون | F155001 | لإعداد التدرجات |
| الأنابيب التمعجية | جيلسون | F117930 | لإعداد التدرجات |
| حمام مائي | VELP Scientifica | OCB | المعدات |
المراجع
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
