يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

يناير 26, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم طريقة فعالة واستنساخه لعزل وثقافة الخلايا العصبية السلف من الأنسجة الجنينية والولادة في الدماغ إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من هستون 3 يسين 79 ديميثيليشن (H3K79me2)--علامة هيستون تقع داخل مجال كروي من هستون 3.

الملخص

نمو الدماغ هو عملية معقدة، التي يسيطر عليها التدرجات مورفوجينس والبرامج النسخي المختلفة بطريقة الصدغي مكانية. بالإضافة إلى ذلك، تعديلات جينية الكروماتين، مثل مثلايشن هستون، دوراً هاما لإنشاء والحفاظ على مصائر الخلية المحددة في إطار هذه العملية. تحدث الغالبية العظمى من هيستون مثلايشن على ذيل مرنة هستون، الذي الوصول إلى معدلات هستون، ومحايات والبروتينات هستون القارئ. وفي المقابل، مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3 والمتورطة في المهام الإنمائية المختلفة. مثلايشن H3K79 هي تقحم المصانة ويمكن أن تكون وجدت في طائفة واسعة من الأنواع من الإنسان العاقل إلى Saccharomyces cerevisiae. حدث التعديل في خلية مختلفة السكان داخل الكائنات الحية، بما في ذلك فروعه العصبية. موقع مثلايشن H3K79 في مجال كروي من هستون 3 يجعل من الصعب تقييم. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة القشرية السلف الخلايا (Cpc) من الأنسجة الجنينية الدماغ القشرية (E11.5-E14.5) أو فروعه الدماغ العصبية الحبيبية (كجنبس) من الأنسجة بعد الولادة (P5-P7)، وإلى كفاءة إيمونوبريسيبيتاتي H3K79me2 PCR الكمي (qPCR) وتسلسل الجينوم على نطاق المنظومة.

المقدمة

الوظائف الحسية والحركية والإدراكية للدماغ معقدة للغاية وعرضه للتغيرات المادية والبيئية. يتكون الدماغ من ثلاثة أجزاء عامة هند-، منتصف، وفوريبرين، التي ترتبط عميق. ضمن forebrain، يمكن تقسيم تيلينسيفالون تيلينسيفالون الظهرية (DT) وتيلينسيفالون البطني (فاتو). DT الفئران يتكون من ست طبقات القشرية التي تتشكل بين E11.5 و E18.5 بطريقة "من الداخل إلى الخارج"1. ويشمل فاتو امينينسيس جانجليونيك في التنمية، التي تشكل في وقت لاحق2،ganglia القاعدية3. ويمكن تصنيف في الثدييات الجهاز العصبي المركزي مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، أو أوليجوديندروسيتيس4، الذي وضع في طريقة الصدغي مكانية5العديد من أنواع الخلايا. أولاً، تثير الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، إينتيرنيورونس في فاتو، وإسقاط الخلايا العصبية في ديناراً، وفي وقت لاحق إلى الخلايا الدبقية (مثلاً، أستروسيتيس6). خلال التنمية القشرية، والطبقة الأكثر سطحية (طبقة أنا)، الذي يحتوي على خلايا ريتزيوس كيال، تتشكل أولاً. ثم، بين E12.5 و E14.5، تولد الشخصيات العصبية طبقات أعمق (الخامس والسادس) بينما بين 14.5 و 16.5، المتكفل تؤدي إلى الطبقة العليا (رابعا-ثانيا) من الخلايا العصبية7،8. يتم تحديد هوية الخلايا العصبية التي يسببها مورفوجين الصدغي المكانية النسخي البرامج المختلفة وبرامج جينية2بالإضافة إلى ذلك.

يقع في هيندبرين المخيخ، الذي تورط في التنسيق الحركي، وتطور بين E10 وتقريبا P20 في الفئران9. أنه يحتوي على قشرة الدماغ و نوى الدماغ10. قشرة الدماغ الكبار يتكون من ثلاث طبقات والطبقة الجزيئية الأبعد، طبقة خلايا بوركنجي والطبقة الحبيبية الأعمق التي تحتوي على الخلايا العصبية محبب10. الخلايا الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية أصغر وتمثل حوالي 80 في المائة من جميع الخلايا العصبية في الدماغ الفقاريات11. وضع من السلائف التي تقع في منطقة جيرمنال الخارجية والهجرة من خلال طبقة خلايا بوركنجي إلى تلك الوجهة12. مثل ينظم وضع المخيخ في telencephalon، مورفوجينس مهمة عدة، التي لها وظائف محددة الوقت والفضاء التابعة والشروع في تعريف برامج النسخي10.

يتم التحكم في وضع الطبقات القشرية والدماغ النسخي التعبير عن مورفوجينس محددة، ومن ثم الدولة الكروماتين للحمض النووي. في طريقة عرض مبسط، يمكن تقسيم الدول الكروماتين euchromatin كنشاط ترانسكريبتيونالي وهيتيروتشروماتين كمناطق صامتة ترانسكريبتيونالي. نوكليوسومي كوحدة أساسية من الكروماتين يحتوي على نسختين من كل هيستون الأساسية H2A، H2B و H3 و H4، محاطة بزوج قاعدي 147 من الحمض الخلوي الصبغي13. يتم تعديل هيستونيس عالية بوستترانسلاتيونالي مثلايشن acetylation، الفسفرة، أوبيكويتينيشن، سومويليشن، ريبوسيليشن ADP، deamination وبرولين isomerization14،15. يعتبر مثلايشن يسين هستون تعديل هيستون الأكثر استقرارا التي تتحكم في النسخ والنسخ المتماثل وممارسو16، تلف الحمض النووي استجابة17وطابعه الجينوم18. ويمكن ليسينيس مونو-دي-أو ثلاثي ميثليته19 وتظهر ليس فقط في ذيول هيستون موجوداً ولكن أيضا داخل نطاق كروي histones20. ميثيليشنز المحددة في H3K4 و H3K36 ترتبط أساسا يوتشروماتين، ميثيليشنز محددة في H3K9، أو H3K27، أو H4K20 توجد أساسا في مناطق heterochromatic، على الرغم من أن جميع مخلفات تقع داخل الذيل هيستون14، 19،21. مثلايشن H3K79 يقع ضمن مجال كروي هيستون وارتبطت بنشاط النسخي، بل أيضا مع مناطق الجينوم خاملة ترانسكريبتيونالي22. هي تقحم حفظت التعديل نظراً لأنه قد لوحظ في الخميرة والغدة الصعترية العجل والدجاج و الإنسان23. H3K79 مونو ودي تريميثيليشن (H3K79me1، me2، me3) هي تحفزها هيستون ميثيلترانسفيراسيس DOT1L24،25 و النووية مجموعة المجال التي تحتوي على بروتين 2 (Nsd2)26. DOT1L المتورطة في الانتشار وإصلاح الحمض النووي الخلوي ريبروجرامينج27. فقدان Dot1l في الفئران يؤدي إلى وفاة قبل الولادة حوالي28،E10.5 المرحلة الإنمائية29. أثناء تطوير القلب والتمايز ميوكارديوسيتي، DOT1L ضروري ل تنظيم التعبير الجيني30. في الجهاز العصبي المركزي، وقد تورط الدالة DOT1L في الأنبوب العصبي التنمية31، وهي تشارك في قمع Tbr1-التعبير خلال forebrain التنمية32، وقد تعمل في تنظيم ER-الإجهاد استجابة الجينات33. تعتمد على سياق تنشيط أو عمل تقطعون من H3K79me، لا سيما مع حالات في فيفو مثل تطوير الجهاز العصبي المركزي، التاريخ فقط يفهم جزئيا32. منذ مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3، أنها ستيريكالي الوصول إليها أقل بالمقارنة مع تعديلات في ذيول هيستون مرنة23. هناك حاجة لفهم وظيفة مثلايشن H3K79، أساليب تحليل موثوق واستنساخه لتحديد موقعها وبيئة الجينوم. نقدم في هذه الورقة، وأساليب طرق عزل مختلف فروعه العصبية (Cpc للقشرة) وكجنبس المخيخ والعلاج مثبطات DOT1L الفعال وأسلوب رقاقة لتحليل مثلايشن H3K79 عن طريق قبكر أو التسلسل في وقت مختلف النقاط خلال التنمية القشرية والدماغ. لإلقاء نظرة عامة على البروتوكول وإمكانياتها، انظر الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت لجان رعاية الحيوان من جامعة فرايبورغ والسلطات المحلية جميع التجارب الحيوانية (G12/13، G16/11) المشار إليها في البروتوكول التالية.

1-الأعمال التحضيرية

  1. الأعمال التحضيرية لعزل Cpc
    1. قم بإعداد فواصل التزاوج للحصول على الأجنة في مراحل مختلفة من التنمية اللحاء (بين E11.5 و E14.5). استخدام فئران سلالة الرنين (معهد البحوث الطبية البحرية) التي على الأقل 8 أسابيع من العمر. بعد التزاوج، تنظر سداده مهبلية إيجابية في E0.5.
    2. للحصول على ما يكفي من المواد، استخدام القمامة واحد من الفئران الرنين لرقاقة H3K79me2 واحد من كورتيسيس من E12.5 أو E14.5. بعد المراحل الجنينية، استخدام القمامة واحد لمزيد من التحليلات رقاقة (متوسط حجم القمامة الرنين: 10 أجنة).
    3. بريكول Hank´s متوازن الملح الحل (حبس) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 4 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في RT).
    4. حجته 4 درجات مئوية المخزنة يدتا التربسين (0.05% w/v) إلى 37 درجة مئوية.
    5. تحضير الخلية القشرية متوسطة (CCM): تكملة المتوسطة للخلايا العصبية (انظر الجدول للمواد) مع التركيزات النهائية الملحق B-27 2% (v/v)، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين Apo، 1 ميكروغرام/مل الجلوتاثيون، 0.5 مم L-الجلوتامين، الفاءق دسموتاز 0.8 ميكروغرام/مل و 1% (v/v) خليط المضادات الحيوية البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين. تخزينها في 4 درجات مئوية. للتجربة، حجته المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
    6. ذوبان الجليد مصل العجل الجنين (FCS)، الكوة من (50 مل في كل)، وحجته قاسمة واحد إلى 37 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في-20 درجة مئوية).
    7. إعداد مخزون من الدناز 1 (10 مغ/مل) في ح2س لثقافة الخلية. تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    8. إذا لزم الأمر، حل مثبطات DOT1L محددة 5676 مناطق تجهيز الصادرات أو SGC0946 في [دمس] لتركيز أسهم من 100 ملم. يطبق بتركيز 1-5 ميكرومتر نهاية للخلايا في اليوم 0 وتطبيق المانع كل يومين.
    9. للحزب الشيوعي الصيني زراعة، معطف خلية ثقافة لوحات (بئر 6 أو 12 جيدا) مع هيدروبروميد بولي-L-ornithine (1 ملغ/مل في 150 مم الماء المقطر pH 8.4) على الأقل 1 ح في RT، وبعد ذلك مع laminin (1 ملغ/مل) في المتوسط CCM عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. الأعمال التحضيرية لعزل كجنب
    1. تنظيم التزاوج المناسب من الفئران لتوليد الحيوانات P5-P7 لعزل المخيخ (3-5 الحيوانات كل رقاقة والشرط).
    2. إعداد حبس/الجلوكوز عن طريق إضافة 6 مغ/مل الجلوكوز إلى حبس المخزن المؤقت.
    3. إعداد متوسطة الثقافة الخلية كجنب (الجمعية العمومية) بإضافة الملحق 1% (v/v) N2، 1% (v/v) البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين، 25 مم FCS بوكل و 10% دميم-F12. لزراعة كجنب إعداد متوسطة CGM دون FCS ولكن بما في ذلك 0.6 ميكروغرام/مل سونيك القنفذ (SHH) (CGM-SHH) وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
    4. معطف لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا مع 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين ح 1-2 على RT لإزالة خلايا إطلاق. بعد ذلك يغسل مرتين مع ddH العقيمة2س واسمحوا لوحات الجاف. تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    5. لزراعة كجنبس معطف الخلية جيدا 6 لوحات الثقافة مع بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك يغسل مرتين مع ح2س لخلية ثقافة واسمحوا لوحات الجاف.
      ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    6. إعداد التربسين 0.025% (w/v) في حبس/الجلوكوز وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
  3. الأعمال التحضيرية لشريحة من H3K79me2
    1. إعداد منهاج عمل بيجين (1% في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 8) طازجة قبل crosslinking الكروماتين. إعداد منهاج عمل بيجين الحرارة 50 مل برنامج تلفزيوني في الموجات الدقيقة إلى الحد الأقصى من 65 درجة مئوية. أثناء التحريك المستمر إضافة 0.5 ملغ منهاج عمل بيجين إلى برنامج تلفزيوني. قم بإضافة 50 ميليلتر 10 M هيدروكسيد الصوديوم وانتظر حتى يتم حل منهاج عمل بيجين. بعد ذلك، أضف ميليلتر 42.5 HCl (37% v/v) للحصول درجة وضه 8. التحقق من درجة الحموضة مرة أخرى والسماح ثم حل منهاج العمل 1% الوصول إلى الرايت
    2. إعداد الأرصدة رناسي (1 ملغ/مل) و "بروتيناز ك" (20 ميكروغرام/ميليلتر) بشكل منفصل في ddH العقيمة تخزين2سين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    3. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة التالية: برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين، تحلل العازلة، جليكاين، المخزن المؤقت، وتمييع رقاقة رقاقة العازلة 2 والرقائق العازلة 3، المخزن المؤقت 1 والمخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد المخزن المؤقت شطف طازجة في كل مرة.
      1. إعداد برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين. متجر لمعظم أسبوعا واحداً في 4 درجات مئوية.
      2. إعداد تحلل المخزن المؤقت باستخدام 50 مم تريس على درجة الحموضة 8.0، 10 مم يدتا والصوديوم 1% (w/v) دوديسيل كبريتات (SDS) 1 × مثبطات البروتياز.
      3. إعداد جليكاين 2.5 م.
      4. إعداد إضعاف المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) Triton X-100 والحزب الديمقراطي الصربي 0.25% (w/v) 1 × مثبطات البروتياز.
      5. إعداد الرقائق العازلة 1 استخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      6. إعداد الرقائق العازلة 2 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      7. إعداد الرقائق العازلة 3 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 250 ملم ليكل، 2 مم يدتا، 1% (v/v) NP-40، و 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      8. تعد الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس pH 8.0 و 2 مم يدتا.
      9. إعداد المخزن المؤقت شطف الطازجة التي تحتوي على 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 100 ملم ناكو3.

2-العصبية السلف العزلة من أنسجة المخ

  1. عزل وزراعة الاختياري Cpc
    1. Euthanize الحيوانات الحوامل بخلع سرطان عنق الرحم، ونقل الأجنة إلى حبس المثلج.
    2. إزالة الجمجمة مع المقص وعزل الدماغ، ثم إزالة السحايا، إذا كان ذلك ممكناً، مع ملقط صغير وعزل كورتيسيس (الجامعة، DT، أو فاتو) من كلا نصفي الكرة الأرضية عن طريق إزالة جميع أجزاء الدماغ الأخرى تحت مجهر نطاق استخدام الملقط الصغيرة، وإذا كان مقص اللازمة، والصغيرة. تخزين كورتيسيس معزولة في المخزن المؤقت لحبس 5 مل عند 4 درجة مئوية في أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي المواد المعزولة من المخ لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية.
    4. أغسل كورتيسيس مع 5 مل حبس المثلج وتجانسه لهم مع تلميح ماصة 1 مل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. إذا لزم الأمر، قص غيض غيض ماصة.
    5. الطرد المركزي العينة المتجانس لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. إزالة حبس.
    6. أضف 3 مل التربسين واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. أضف 1 مل FCS ومل 5 CCM 30 ميليلتر من الدناز 1 للعينة وتجانسه مع ماصة زجاجية 5 مل العينة التي بيبيتينج بعناية صعودا وهبوطاً.
    8. الطرد المركزي الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق في 1000 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وإضافة 5 مل CCM ومجانسة العينة مرة أخرى.
    9. تمييع قاسمة العينة وتعول عليه نويباور عد-دائرة. ومن المتوقع متوسط مبلغ 4.5 × 106 خلايا للجنين. لزراعة Cpc معزولة المضي قدما خطوة 2.1.10. للرقائق، تشرع فورا بالخطوة 3.
    10. للزراعة، والاطباق في كثافة بين 8 × 104 و 2.5 × 105 خلايا/سم2 في المتوسط CCM لوحة Cpc في بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) ولامينين (1 ملغ/مل) المغلفة واحتضانها لهم في 5% CO2, 37 درجة مئوية والرطوبة النسبية 100%.
    11. منذ البداية Cpc للتفريق في الخلايا العصبية في ثقافة الخلية (بعد 4 أيام تقريبا)، النظر في تاريخ التشريح كيوم في المختبر 0 (يوم 0). لمدة أطول من زراعة، تغيير نصف المتوسط كل يوم الرابع مع الطازجة CCM المتوسطة.
    12. تطبيق 1-5 ميكرومتر SGC0946 أو EPZ5676 حله في [دمس] في اليوم 0 (4-5 ح بعد عزل الخلية) وتحديثها كل يوم الثاني. استخدام [دمس] كعلاج لعنصر تحكم. اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت، إذا لزم الأمر.
  2. عزل وزراعة كجنبس اختياري
    1. Euthanize الحيوانات P5-7 بقطع الرأس باستخدام مقص. إزالة الجلد فروة الرأس وفتح الجمجمة وإزالة الدماغ باستخدام مقص صغير والملقط. عزل المخيخ وأنه نقل إلى هبس/السكر المثلج. إزالة كافة السحايا والأوعية الدموية ونقل سيريبيلا إلى 15 مل أنابيب مملوءة بالبرد هبس/الجلوكوز.
    2. أغسل سيريبيلا ثلاث مرات مع 10 مل هبس المثلج/الجلوكوز (جمع لهم بالطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) ومجانسة سيريبيلا بعد ذلك بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة 1 مل (الحد الأقصى 2-3 مرات) للحصول على 0.5-1 ملم3 الشظايا.
    3. إضافة 5 مل التربسين 0.025% في حبس/الجلوكوز واحتضان الأنسجة تحت التحريك المستمر في حمام مائي 37 درجة مئوية عن 15 دقيقة توقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل من الجمعية العمومية وجمع الأنسجة باستخدام الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية وتريتوراتي الأنسجة مع تلميح بيبيت مل 1 في 1 مل CGM وتحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة.
      ملاحظة: من المهم تجنب فقاعات الهواء.
      1. إضافة 5 مل CGM واحتضان الخليط لمدة 2 دقيقة على الجليد لتسوية مخلفات الأنسجة. نقل المادة طافية في أنبوب 15 مل جديدة. إضافة 2 مل CGM إلى الأنسجة المتبقية وكرر الإجراء تريتوريشن.
    5. تجمع سوبيرناتانتس (بدون مخلفات الأنسجة، حوالي 10 مل في المجموع) والطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع خلايا الدماغ. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM.
    6. منذ astrocytes التمسك بشكل أسرع وأقوى بولي-د-يسين من كجنبس، لوحة الخلايا على 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين المغلفة 6-جيدا-لوحات (تصل إلى 4 مل في البئر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لإزالة أستروسيتيس.
    7. هز اللوحة وجمع المادة طافية. ثم الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنبوب 15 مل. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM وعد الخلايا مع نويباور العد الدائرة.
      ملاحظة: كجنبس هي جولة، صغيرة، وتظهر هالة عند تصويرها باستخدام الطوري.
    8. إذا كان المطلوب، والبذور الخلايا في 37 درجة مئوية قبل استعد CGM على ألواح بولي-L-أورنيثيني-المغلفة (3 × 106 خلايا الواحدة 6-جيدا) واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 الرطوبة النسبية 100%.
      ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ البذر، انتقل إلى الخطوة 3، 1.
      1. بعد 6-12 ساعة، تبادل المتوسط إلى CGM SHH. علاج ح 6 كجنبس معزولة (أو عند تغيير إلى CGM SHH) بعد عزلة مع مثبط DOT1L و [دمس] التحكم وتجديدها كل يوم الثاني (مقارنة مع 2-1-12). اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت إذا لزم الأمر. للرقائق، المضي في الخطوة 3، 3.
        ملاحظة: ترك CGM على اللوحات (ومع ذلك FBS) سيؤدي في التفريق بين كجنبس في الدماغ الخلايا العصبية الحبيبية (كنس).

3-تثبيت الخلايا والقص من الكروماتين

ملاحظة: إجراء الخطوات 3.1 و 3.2 إذا لم تستزرع خلايا، إذا لم تكن للانتقال إلى الخطوة 3، 3.

  1. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 س ز وإضافة 1.3 مل برنامج تلفزيوني. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع 1.3 مل برنامج تلفزيوني.
  2. الخطوة الحاسمة: إضافة 350 ميليلتر 1% منهاج عمل بيجين للعينة واحتضان عليه لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية. للتوقف عن رد فعل، أضف 18.4 ميليلتر جليكاين، وبرنامج تلفزيوني 1 مل. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
    1. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز و 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت التثبيت 5 دقيقة بالضبط للحصول على أفضل النتائج. أرقام خلية مختلفة قد تتطلب تعديلات الوقت.
  3. الخطوة الحاسمة: كجنبس المستزرعة (أو Cpc)، إضافة إلى 1 مل 1% منهاج عمل بيجين إلى الآبار لوحة الثقافة الخلية مباشرة. بعد 5 دقيقة حضانة عند 22 درجة مئوية، إضافة مبلغ مناسب جليكاين وبرنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا مع مكشطة خلية.
    1. نقل الخلايا في أنابيب 1.5 مل والطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لابتداء 5 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
  4. الخطوة الحاسمة: إضافة 700 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (+ مثبطات البروتياز) واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. دوامة العينة كل دقيقة 5 القص الكروماتين الخلايا ليسيد 3 × 10 دقيقة في سونيكاتور (30 s نبض، 30 s وقفه) في الحد الأقصى من الطاقة.
    1. تأكد من أن وحدة التخزين لا تتجاوز 350 ميليلتر كل أنبوب. دوامة فحص العينات كل دقيقة 10 للنوى المتبقية مع مجهر تباين مرحلة.
      ملاحظة: من المهم للحصول على أفضل النتائج القص (مقارنة مع الشكل 1B) لتحليلها في وقت لاحق. في حالة استخدام أساليب أخرى للقص الكروماتين، تحسين القص إلى شظايا الكروماتين الحجم بين 200-500 bp.
  5. بيليه مخلفات الخلية عن 10 دقيقة، 13,000 س ز، 4 درجة مئوية. استخدام المادة طافية لخطوة بريكليرينج 5.2. تجميد العينة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.

4-إعداد الخرز وبريكليرينج

  1. أغسل 45 ميليلتر البروتين A المغناطيسي الخرز/رقاقة و 20 ميليلتر المغناطيسي الخرز/عينة مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين ثلاث مرات استخدام موقفا مغناطيسية. ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج الخرز.
  2. 1 مل المثلج برنامج تلفزيوني والخرز ميليلتر 45/رقاقة، إضافة 3 ميكروغرام من جسم/تشيب (H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار لربط الأضداد الخرز. اعتماداً الضد، استخدم ~ 3 ميكروغرام جسم/رقاقة.
  3. أغسل الجسم-منضم-الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين. إضافة حجم حبة المناسبة (ابتداء من حجم الخرز المغناطيسية المستخدمة) لبرنامج تلفزيوني المثلج ليغسل الجسم-إلى جانب-الخرز.
  4. إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع و 20 ميليلتر من حبات مغناطيسية غسلها للعينة بريكليرينج (الحجم الإجمالي 1,320 ميليلتر) واحتضانها ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار. إزالة الخرز استخدام موقفا مغناطيسية. تأخذ 5% (33 ميليلتر) من ليساتيس كنماذج الإدخال وتجميدها في-20 درجة مئوية.

5-الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن

  1. تقسيم استخراج بريكليريد أنبوبين (حوالي 643.5 ميليلتر)، وإضافة نفس حجم المخزن المؤقت لتمييع والجسم-منضم-الخرز (45 ميليلتر في العينة؛ H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في دوار.
  2. تغسل الخرز مع المثلج الرقائق العازلة 1 والرقائق العازلة 2 والرقائق العازلة 3 لكل 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار. وبعد ذلك يغسل ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في دوار.
  3. الوت الخرز مع شطف المخزن المؤقت لح 1 1,400 لفة في الدقيقة في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة 10 ميكروغرام رناسي (1 ملغ/مل) كل عينة رقاقة و 5 ميكروغرام لنماذج الإدخال واحتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (1,400 لفة في الدقيقة).
  5. إضافة 100 ميكروغرام "ك البروتيناز" (20 ميكروغرام/ميليلتر) كل رقاقة عينة و 50 ميكروغرام كل المدخلات واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية في 1,400 في الدقيقة.

6-تنقية العينات رقاقة

  1. تنقية شرائح وعينات الإدخال مع تنقية الحمض النووي كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا للدليل. استخدام أعمدة تنقية أكثر عندما يتوقع أكثر من 5 ميكروغرام من الحمض النووي. الوت العينة مع 2 × 15 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف الحمض النووي المنصوص عليها في هذه المجموعة.
  2. إجراء التقدير الكمي لهذه العينات (استخدام 1 ميليلتر) باستخدام fluorophore نحققها ومن فلوروسبيكتروميتير (انظر الجدول للمواد).

7-تحليل "العينات رقاقة" عبر قبكر

  1. التصميم التمهيدي لتحليل قبكر، استرداد تسلسل الجينوم للفائدة من المستعرض عارض الجينوم التكاملية (IGV)34. تصميم كبسولة تفجير حول موقع بدء النسخي (TSS) الجينات، حيث H3K79me2 من المحتمل أن يكون موجوداً هناك. كعنصر تحكم، تنظر غير ترميز الجينوم الأقاليم أو المناطق حوالي 10 كيلو بايت المنبع لخدمات الدعم التقني أو 10 كيلو بايت المصب نهاية النسخي الموقع (قسم التدريب والامتحانات).
    1. توليد الإشعال باستخدام https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/مسبقاً بحجم منتج بين 70 و 200 شركة بريتيش بتروليوم، ودرجة حرارة مثلى من 60 درجة مئوية. لأغراض المحاكمة، استخدم كبسولة تفجير لمناطق الجينوم Aft4، Ddit3، Scd1، Aft3، و Npm1 المدرجة في الجدول 1.
  2. اختبار الإشعال المصممة حديثا مع البرنامج قبكر التالية ومزيج الرئيسي تدرج درجة الحرارة انلينغ بين 58 و 63 درجة مئوية، وتحديد درجة حرارة انلينغ بأعلى المنتج كمية ونوعية.
    1. تطبيق الحمض النووي جل التفريد التحكم في حجم الناتج المتوقع. لتحليل قبكر، واستخدام "نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي" (انظر الجدول للمواد).
    2. إعداد مزيج الرئيسي باستخدام 10 ميليلتر بوليميراز الدنا الرئيسي ميكس التمهيدي ميليلتر 0.5 إلى الأمام (10 ميكرون)، 0.5 ميليلتر التمهيدي عكس (10 ميكرون)، 4 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر والحمض النووي 5 ميليلتر (1 نانوغرام/ميليلتر).
    3. استخدام برنامج قبكر 2-خطوة على النحو التالي: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية، 50 x (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية-63 درجة مئوية)، والانحدار تمسخ باستمرار عند 4 درجات مئوية.
  3. إنشاء سلسلة تمييع للجينوم والمنفصمة وتنقية عينات من الحمض النووي (2 نانوغرام/ميليلتر و 1 نانوغرام/ميليلتر، 0.5 نانوغرام/ميليلتر، 0.25 ng/ميليلتر و 0.125 نانوغرام/ميليلتر) واستخدام 5 ميليلتر لاختبار كفاءة استخدام قبكر. تحديد منحدر المنحنى المعياري وحساب كفاءة التمهيدي بالصيغة التالية:
    الكفاءة (%) = (^(-1/slope)-1 من 10) * 100.
    1. استخدام أجهزة الإشعال مع الفعالية بين 90% و 105% في حالة مثالية، أو في الأقل مع الكفاءة بين 85% و 115%.
  4. لتحليل شرائح وعينات الإدخال، قم بتطبيق 0.1-1 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" مختلطة مع كل منهما إلى الأمام وعكس التمهيدي والمياه خالية من نوكلاس بوليميريز الحمض النووي الرئيسي في وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر لكل رد فعل qPCR مزيج.
  5. تحديد قيم العتبة دورة (Ct) شرائح ونماذج الإدخال وتطبيع العينة جر إلى قيمt C من المدخلات لحساب تخصيب (الإدخال %) بالصيغة التالية. استخدام جر القيم التي تم الحصول عليها من مراقبة مفتش لتحديد مستوى الخلفية.
    الإدخال % = 100-2^(norm. − الإدخال هو القاعدة. رقاقة)
    القواعد والمعايير. الإدخال = جر (مدخلات) − سجل2(عامل التخفيف)
    القواعد والمعايير. رقاقة = جر (رقاقة) − سجل2(عامل التخفيف)
    ملاحظة: القاعدة. = تم تسويتها

8-تحليل عينات رقاقة عبر التسلسل

  1. نقل العينات رقاقة (الإدخال وإيمونوبريسيبيتاتيد عينة الحمض النووي) إلى مرفق لتسلسل.
  2. لإعداد باستخدام مكتبة مسبقاً، إعداد مكتبة مناسبة كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحويل 2 نانوغرام المدخلات الحمض النووي وكل شيء من الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد في المكتبات المفهرسة للجيل القادم متعدد التسلسل في وأشارت إلى منصة (انظر الجدول للمواد).
  3. الخطوة الحاسمة: اتباع الإرشادات كيت، اضطر محولات التسلسل (مع تركيز عمل من 15 ميكرون) لوضع حد لإصلاحه والذيل دا شظايا من الحمض النووي. محولات التسلسل وبكر استخدام كبسولة تفجير أوليجوس المناسبة (انظر الجدول للمواد). لهذا المبلغ لإدخال الحمض النووي، استخدام دورات بكر 6-9 لإثراء شظايا من الحمض النووي محول متصلة.
    ملاحظة: عادة، فإنه لا يلزم القيام بتحديد حجم الحمض النووي محول متصلة. فمن الأفضل لاستخدام عدد قليل من PCR دورات ممكن، منذ التضخيم بكر العديد من دورات نتيجة في التكرارات بكر وتحيز GC عالية.
  4. لإجراء فحص نهائي مكتبة، تأخذ 0.5 ميليلتر من رد فعل مجموع إلى تصور حجم التوزيع على جهاز مناسب للتحليل (انظر الجدول للمواد). للتحديد الكمي، استخدام صبغة نحققها في تركيبة مع فلوروسبيكتروميتير أو الأساليب الأخرى (انظر الجدول للمواد).
  5. حيث يبدو أن H3K79me2 تعديل هستون، الذي ينتشر على نطاق واسع على مناطق الجينوم أكبر، تسلسل العينات المزدوجة-النهاية مع طول قراءة من 50 بي بي ومع عمق 75 ميو يقرأ تسلسل.
  6. تحليل البيانات seq رقاقة مع "الملقم فرايبورغ" المجرة/يوني (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. أداء مراقبة الجودة مع تشيبسيق التي تم الحصول عليها مع فاستقك، وإذا كان ذلك مناسباً، خريطة لهم مباشرة مع Bowtie2 الإصدار 2.2.035 مع أو بدون اقتطاع. استخدام الجينوم الجمعية كمرجع mm9 أو mm10 الإصدار الأحدث؛ ومرجع تعليق توضيحي الإصدار FTP انسيمبل 79.
  8. اختياري: قراءة إزالة التكرارات باستخدام "ماركدوبليكاتيس بيكار" (http://broadinstitute.github.io/picard) قبل استدعاء الذروة.
  9. استدعاء قمم مع MACS2 الإصدار 2.1.036 استخدام الخيار 'الواسع' ل H3K79me2.
  10. للحصول على نسبة2 سجل بين رقاقة وإدخال عينة، سجل2 عدد من يقرأ يقرأ استخدام نسبة من كلا عينات بامكوفيراجي وبامكومباري.
  11. لجميع الأخرى seq شرائح محددة من التحليل المتعمق، تطبيق deepTools2 النسخة 2.3.5 أو 2.4.137، أي لتوليد تغطية مسار الملفات (بامكوفيراجي لشرائح فقط، بامكومباري للمقارنة رقاقة للإدخال)، لتقدير رقاقة استخدام الأداء بلوتفينجيربرينت وتوليد استخدام لمحة عامة كومبوتيماتريكس، بلوثياتماب. حدد K-يعني تجميع أثناء عملية كومبوتيماتريكس إلى الكتلة مناطق الجينوم وفقا للتوزيع H3K79me2.
  12. استخدام seq رقاقة البيانات المنشورة ك H3K79me2 DT E14.5 أودعت في نكبي لأغراض المحاكمة (رقم الانضمام: SRP057733).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المخطط العام لعزل السلف العصبية، زراعة، وأساليب التحليل رقاقة H3K79me2 والرقائق: ويبين الشكل 1 مخطط انسيابي لأداء رقاقة H3K79me2 الخلايا القشرية السلف عند نقاط زمنية مختلفة خلال نمو الدماغ الجنينية أو فروعه العصبية الحبيبية الدماغ في المراحل اللاحقة للولادة. وكخطوة أولى، الدماغ يجب أن تكون معزولة وتيلينسيفالون (بين E11.5 و E14.5) أو المخيخ (P5-P7) المراد استردادها. فمن الممكن لتحليل مختلف مناطق telencephalon بتقسيمه إلى DT و vt. بعد ذلك سوف ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك طريقتان الرئيسي لأداء إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للكشف عن الجينوم شغل التعديلات هستون، عوامل النسخ، هستون رمز القراء، والكتاب، أو ومحايات. واحد هو الأسلوب رقاقة الأصلي باستخدام nuclease هضمها، الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن، والآخر هو أن أسلوب عرضها باستخدام الكروماتين ثابتة في منهاج عمل بيجين، والمنفصمة، التي في نوكليوسوميس وغيرها من البروتينات المرتبطة الحمض النووي تساهمي ملزمة للحمض النووي 39-"رقاقة الأصلي" مع معدل الكشف عن الأجسام المضادة عالية ينبغي أن تنطبق على مثلايشن هيستون من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية

شكر وتقدير

ونحن نشكر هنرييت بيرتيميس للمساعدة على إنشاء البروتوكول زراعة CGN داخل المختبر. وأيد هذه الورقة أسلوب "التخلق الطبية" الممولة من DFG CRC992 بتمويل للتلفزيون. يعترف الكتاب الدعم من "فريق غالاكسي فرايبورغ": فيديم بافانكومار، بيورن Grüning، والبروفيسور رولف باكوفين، المعلوماتية الحيوية، جامعة فرايبورغ، ألمانيا تمول "التعاونية أبحاث المركز 992 الطبية اللاجيني" (منحة DFG SFB 2012 992/1) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية منحة 031 A538A ربك (دي. مبادرة حوض النيل)).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Anti-GAPDHAbcamab8245الفئة: < / قوي> الأجسام المضادة
اختصار / تعليق: < / قوي> تخفيف اللطخة المناعية 1: 5000
Anti-H3Abcamab1791الفئة: < / قوي> الأجسام المضادة
اختصار / تعليق: < / قوي> تخفيف اللطخة المناعية 1: 3000
مضاد H3K79me2DiagenodepAb-051-050الفئة: < / قوي> جسم مضاد
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> جسم مضاد ChIP
مضاد ل H3K79me2Abcamab-051-050الفئة: < / قوي> الأجسام المضادة
اختصار / تعليق: < / قوي> تخفيف اللطخة المناعية 1: 1000
مضاد للأرانب IgGDiagenodeC15410206<قوي>الفئة: < / قوي> جسم مضاد
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> ChIP Ctrl الجسم المضاد
المضاد للتوبولين ألفاأبكامab108629<قوي>الفئة: < / قوي> الأجسام المضادة
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> تخفيف اللطخة المناعية 1: 3000
Apo-Transferrin (1 مجم / مل)Sigma-AldrichT1147<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لملحق CCM
B27 (50x)Life Technologies17504044الفئة: < / قوي> ثقافة الخلايا
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لتقنيات CCM
BioanalyzerAgilentG2940CA<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لتحليل الكروماتين المنفصم
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> الموجات فوق الصوتية
حمض البوريك الرقم الهيدروجيني 8.4سيجما ألدريتشB6768<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلايا
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لزراعة CPC CFX
Connect RT نظام الكشف عن PCRBio-Rad1855201 الفئة: < / قوي> تحليل ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> نظام الكشف عن تقنيات الحياة qPCR
DMEM-F1211320-033<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لبروتين CGM
Dynabeads AInvitrogen10001Dالفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> حبات مغناطيسية ، ل ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062<قوي>الفئة: < / قوي> تثبيط DOT1L
اختصار / تعليق: < / قوي> لتثبيط DOT1L في ثقافة الخلايا
حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامينSERVA39760.01الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي>
مصل EDTA للجنين البقري 10٪ (v / v)Gibco10082147<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> لعزل CPC و CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767الفئة: < / قوي> ثقافة الخلايا
اختصار / تعليق: < / قوي> لعزل
CGNP الجلوتاثيون (1.25 مجم / مل)سيجما ألدريتشG4251<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> ل CCM
GlycineCarl Roth3187الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> لتثبيت الخلية
GoTaq mastermixPromegaA6002<قوي>الفئة: < / قوي> تحليل ChIP
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> مزيج رئيسي لبوليميراز الحمض النووي ل qPCR
Hank ' s تقنيات حياة محلول الملح المتوازن14025-100الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> HBSS
L-glutamine (200 mM) LifeTechnologies25030081<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلايا
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> ل CCM
LamininSigma-AldrichL2020الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> لزراعة CPC
كلوريد الليثيومSigma-AldrichL4408الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> ملحق LiCl
N2Life Technologies17502048<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> ل CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> مقياس الطيف الفلوري لقياس الحمض النووي
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit ل IlluminaNEBE7645S<قوي>الفئة: < / قوي> تحليل ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> مجموعة لإعداد المكتبة
NEBNext Multiplex Oligos ل IlluminaNEBE7335الفئة: < / قوي> تحليل ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> أوليغوس لإعداد
المكتبة متوسطعصبي القاعدي جيبكو21103049<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> ل CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: < / strong> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> لمخزن ChIP
ParaformaldehydeCarl Roth335<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> PFA ، لتثبيت الخلايا
البنسلين - الستربتومايسين - نيومايسين 1٪ (v / v) LifeTechnologies15640055 الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / strong> PSN ، ل CCM و CGM
Phosphate BufferedSaline Life Technologies10010023<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> PBS ، لعزل CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: < / قوي> تحليل ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> تصور الصبغة لقياس الحمض النووي
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لعزل CGNP
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> لزراعة CPC
كلوريد البوتاسيومThermo FisherAM9640G<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> KCl ،
لمثبط البروتيازRoche4693159001 الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> ل ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> ل ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: مجموعة < / قوية> لتنقية الحمض
النووي RNAseSigma-AldrichR6513Category: < / strong> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> ل ChIP
SGC0946SelleckchemS7079 الفئة: < / قوي > تثبيط DOT1L
اختصار / تعليق: < / قوي> لتثبيط DOT1L في زراعة الخلايا
بيكربونات الصوديومكارل روث8551.1الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> للمحلول العازلة
كلوريد الصوديومكارل روث9265<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> كلوريد الصوديوم ، للمخزن المؤقت ChIP
ديوكسيكولات الصوديومسيجما-ألدريتش30970<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> ل ChIP
الصوديوم دوديسيل كبريتاتكارلروث 183<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> SDS ، لقنفذ ChIP
Sonic (SHH)سيجما ألدريتشSRP6004<قوي>الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> لعزل CGNP
superoxide dismutase (1mg / ml)Sigma-AldrichS7571الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> ل CCM
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneCarl Roth9090Category: < / strong> ChIP
اختصار / تعليق: < / strong> TRIS ، ل ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
اختصار / تعليق: < / قوي> للمخزن المؤقت ChIP
Trypsin-EDTA 0,05٪ (w / v)Sigma Aldrich59417C الفئة: < / قوي> ثقافة الخلية
اختصار / تعليق: < / قوي> لعزل CPC
Tween20Carl Roth28320<قوي>الفئة: < / قوي> ChIP
<قوي>اختصار / تعليق: < / قوي> لتحضير الخرزة
أجهزة المختبر الأخرى: غرفة عد نيوباور ، الحاضنة ، الدوار ، شاكر ، مجموعة التشريح ، حمام
CCM: وسط
CGM: وسط
CGM الماءالخلية القشرية زراعة الخلايا CGNP

المراجع

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

qPCR
عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.