يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس

12K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56647

⸱

فبراير 5, 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

ويقدم هذا البروتوكول في المختبر تصوير لايف البلعمه مقايسة لقياس قدرة astrocytes متجولة. وتستخدم الفئران المنقي astrocytes و microglia جنبا إلى جنب مع سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن حركية الإحاطة وتدهور في الوقت الحقيقي ويوفر منصة فحص مناسبة لتحديد العوامل تحوير astrocyte البلعمه.

الملخص

أستروسيتيس النوع من الخلايا الرئيسية في المخ والاتصال مباشرة بنقاط الاشتباك العصبي والأوعية الدموية. على الرغم من أن خلايا microglial اعتبرت الخلايا المناعية الرئيسية والبالعات فقط في الدماغ، قد أظهرت الدراسات الحديثة أن أستروسيتيس أيضا المشاركة في مختلف العمليات متجولة، مثل القضاء على المشبك التنموية وتطهير لويحات بيتا اميلويد في مرض الزهايمر (AD). وعلى الرغم من هذه النتائج، كفاءة الإحاطة astrocyte وتدهور من أهدافها غير واضحة مقارنة مع ميكروجليا. وهذا الافتقار إلى المعلومات الغالب بسبب الافتقار إلى نظام مقايسة فيه حركية البلعمه astrocyte و microglia وساطة قابلة للمقارنة بسهولة. ولتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير الطويلة الأجل العيش-التصوير في المختبر البلعمه مقايسة لتقييم قدرة متجولة المنقي astrocytes و microglia. في هذا التحليل، كشف في الوقت الحقيقي للإحاطة وتدهور من الممكن استخدام سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني، التي تنبعث منها ومضان أحمر مشرق في العضيات الحمضية، مثل ليسوسوميس. لدينا المقايسة رواية يوفر الكشف عن بسيطة وفعالة البلعمه من خلال تصوير العيش. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الإنزيم البلعمه في المختبر كمنصة فحص لتحديد المواد الكيميائية والمركبات التي يمكن أن تعزز أو تعوق قدرة astrocytes متجولة. كما عطل التقليم متشابك وتراكم البروتينات المسببة للمرض قد ثبت أن يسبب اضطرابات عقلية أو أمراض الأعصاب، المواد الكيميائية والمركبات التي تعدل متجولة قدرة الخلايا الدبقية ينبغي أن يكون مفيداً في معالجة مختلف الاضطرابات العصبية.

المقدمة

الخلايا الدبقية، والتي تشير إلى الخلايا غير منفعل في الدماغ، هي نوع الخلية الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). سابقا، كانت تعتبر الخلايا الدبقية مجرد الخلايا الداعمة التي أساسا تلعب دوراً سلبيا في الحفاظ على بقاء الخلايا العصبية وخصائص متشابك القاعدية. ومع ذلك، تظهر الأدلة كشفت أن الخلايا الدبقية تلعب دوراً أكثر نشاطا في مختلف جوانب علم الأعصاب، مثل الحفاظ على التوازن في الدماغ، بوساطة المشبك تشكيل1،،من23 والمشبك القضاء على4،5و6،اللدونة متشابك تحوير7. وتشمل الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي أستروسيتيس، وميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. بين هذه الخلايا وأستروسيتيس و microglia قد ثبت أن تلعب أدواراً متجولة التي تجتاح الاشتباكات العصبية4،5، أبوبتوتيك خلايا8والحطام العصبية9والبروتينات المسببة للمرض، مثل بيتا اميلويد لويحات10،11. في الدماغ، إزالة astrocytes الاشتباكات العصبية في نواة يتناول الظهرية الجانبية (دلجن) عن طريق البلعمه تعتمد على ميرتك و MEGF104. وبالمثل، microglia أيضا القضاء على الاشتباكات العصبية المغلفة C1q خلال مراحل النمو من خلال تتالي تكملة الكلاسيكية5. من المثير للاهتمام، أشير إلى أن العيوب في تشذيب المشبك يمكن أن تكون أحد المبادرين بالعديد من الاضطرابات العصبية. على سبيل المثال، فقد ثبت أن الطفرات في تكملة العنصر 4 (C4)، مما يزيد من تشذيب المشبك مكملاً بوساطة من microglia، مرتبطة بقوة مع انتشار مرض الفصام في البشر12. ورقة صدرت مؤخرا قد بينت أيضا أن مسار تكملة الكلاسيكية هايبراكتيفاتيد في مراحل بدء الإعلان والحث على الفقدان المبكر المشبك في هذا المرض13.

وبالمقارنة مع وساطة microglia البلعمه، ما إذا كانت تساهم بوساطة astrocyte البلعمه بدء وتطور مختلف الاضطرابات العصبية أقل وضوحاً. بيد أن ورقة صدرت مؤخرا تشير إلى أن العوامل التي تغير معدل التقليم المشبك العادي قبل astrocytes قد زعزعة التوازن الدماغ ويسهم إعلان قابلية وعلم الأمراض14. معدل التقليم المشبك ب astrocytes قوة يسيطر ايزومرات الذين ، مع اليل واقية للإعلان (ApoE2) بقوة تعزيز المعدل واليل خطر للإعلان (ApoE4) إلى حد كبير في تخفيض المعدل. وعلاوة على ذلك، تراكمت الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ApoE4 C1q متشابك أكثر بكثير من السيطرة أو الفئران ApoE2 14. تشير هذه البيانات إلى أن ضعف أستروسيتي بوساطة البلعمه في وقت مبكر قد يحفز الدماغ الإعلانية تراكم الحطام مسن المغلفة C1q الاشتباكات العصبية/متشابك التي ينشط فيها تكملة بوساطة microglial البلعمه، يقود تنكس متشابك . ضعف قدرة متجولة astrocytes في ناقلات ApoE4 قد يسهم أيضا في تراكم لويحات بيتا اميلويد في العقول المتأثرة بالإعلان غير المنضبط.

وبالإضافة إلى ذلك، قد تبين أن الخلايا الدبقية في الدماغ المورفولوجية العمر تفقد قدرتها متجولة بسبب انخفاض ترجمة دريبر، هومولوج من Megf10 التي تستخدم أستروسيتيس فاجوسيتوسينج نهايات. استعادة مستويات دريبر أنقذت متجولة قدرة الخلايا الدبقية، وكفاءة إزالة الحطام محواري التالفة في الدماغ عمره بدرجة مماثلة كالتي في الدماغ الشباب، مشيراً إلى أن الشيخوخة الناجمة عن التغييرات في قدرة متجولة أستروسيتيس قد تسهم في اختلال التوازن في الدماغ15.

وبناء على هذه النتائج الجديدة تحوير متجولة قدرة astrocytes قد تكون استراتيجية علاجية جذابة لمنع وعلاج مختلف الاضطرابات العصبية. وفي هذا الصدد، كانت هناك عدة محاولات لتعزيز قدرة متجولة من أستروسيتيس، على سبيل المثال، من خلال حفز تحمض lysosomes مع جسيمات نانوية الحمضية16 وأوفيريكسبريسينج عامل النسخ EB (تفيب)، التي يمكن أن تعزز نشوء حيوي يحلول17. وعلى الرغم من هذه المحاولات، أنها لا تزال غير واضحة كيف تختلف astrocytes وخلايا microglial في هذه الحركية متجولة وإذا نحن ينبغي زيادة أو إنقاص قدراتها متجولة في مختلف الأمراض.

في هذه الورقة، نقدم رواية في المختبر فحص للكشف عن قدرة astrocytes متجولة في الوقت الحقيقي. إظهار البيانات حركية مختلفة للإحاطة وتدهور في astrocytes و microglia. Astrocyte مكيفة المتوسطة (ACM)، الذي يحتوي على عوامل يفرز من أستروسيتيس، أمر ضروري البلعمه الفعالة لكل من أستروسيتيس وميكروجليا. وعلاوة على ذلك، Megf10، ومستقبل متجولة في أستروسيتيس وهومولوج صعقة-1 و دريبر، يلعب أدواراً حاسمة في البلعمه astrocyte بوساطة8،18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

قد أقرتها جميع الأساليب الموصوفة هنا المعهد الكوري المتقدم للعلوم والتكنولوجيا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك)، KA2016-08.

1. تنقية سينابتوسومي

ملاحظة: هذه الإجراءات هي مقتبس من ورقة نشرت سابقا19 مع تعديلات عدة زيادة غلة المنقي سينابتوسوميس (الشكل 1).

  1. تحضير الوسائط متقطع الكثافة المتدرجة.
    1. ضع ما يلي في الجليد: 3% و 10% و 23% كثافة الحلول التدرج في المخزن المؤقت للتدرج (جلب إلى 250 مل ماء مع ز 109.54 السكروز وملغ 606 من تريس 5 مل م 0.2 يدتا، درجة الحموضة 7.4)؛ المخزن المؤقت للتماثل (إضافة 25 مل 4 × التدرج المخزن المؤقت و 500 ميليلتر من 50 مم DTT إلى 74.5 مل من الماء)؛ الخالطون هاون ومدقة.
      ملاحظة: حل متدرج الكثافة وإعداد ترد في الجدول 1. إعداد الكثافة 3% و 10% و 23% حلول متدرجة، استخدم الحل متدرج الكثافة الخام.
    2. إعداد ست أنابيب الطرد المركزي واضحة جداً كل الفئران الكبار الثلاثة.
    3. أضف 3 مل من 23% الكثافة المتدرجة الحل في الجزء السفلي من كل أنبوبة الطرد المركزي مع ماصة 1 مل. ثم، قم ببطء طبقة مع 3 مل من 10% كثافة محلول التدرج على أعلى كثافة 23% الحل التدرج مع ماصة المراعي وماصة 1 مل. أخيرا، أضف 3 مل من 3% الكثافة المتدرجة الحل على أعلى. في هذه الخطوة، توخي الحذر لتجنب إدخال الفقاعات.
    4. تغطية أنابيب الطرد المركزي مع غلاف بلاستيكي وإبقاء هذه الأنابيب على الجليد.
  2. بريكول الطرد المركزي عالية السرعة وأولتراسينتريفوجي إلى 4 درجات مئوية.
  3. تعقيم المعدات الجراحية (تشغيل المقص والمقص الربيع كاستروفيجو والملقط منحنية) مع الإيثانول 70%. تحضير كوب زجاج صغير مع 25 مل من المخزن المؤقت المتجانس على الجليد وتزن الكأس.
  4. استخراج العقول من الفئران الذكور الكبار الثلاثة (حوالي 12 أسبوعا القديمة).
    1. انخﻻع فقرة سرطان عنق الرحم وقطع الرقبة مع تشغيل المقص. تقشر الجلد من الرأس والجمجمة على طول خط الوسط باستخدام مقص التشغيل والملقط منحنية. المكوس شمي المصابيح والمخيخ مع مقص الربيع كاستروفيجو.
  5. وضع العقول الباقية الكأس مع منحنى ملقط وتزن العقول. غسل أدمغة عدة مرات مع المخزن المؤقت المتجانس المثلج لإزالة الدم على السطح للعقول.
    ملاحظة: سابقا، مل 9 من المخزن المؤقت التماثل إلى 1 غرام أنسجة المخ وأوصى.
  6. إضافة 4 مل من المجانسة المخزن المؤقت وز 1 من أنسجة المخ بمدافع الهاون الخالطون. بينما المجانسة العقول، أضف المجانسة المخزن المؤقت يصل إلى 8 مل.
  7. تقسيم اثنان أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل هوموجيناتي. أغسل الهاون مع 1 مل من المخزن المؤقت المتجانس جديدة وإضافتها إلى الأنابيب.
    تنبيه: المضي قدما من خلال خطوات 1.3-1.7 ك بسرعة قدر الإمكان. ويوصي بأقل من 20 دقيقة.
  8. الطرد المركزي في هوموجيناتيس في أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية مع الفرامل أبطأ.
    ملاحظة: تعيين معدل التباطؤ (الفرامل) في اثنين أو ثلاثة عند الحد الأقصى لمعدل من التباطؤ تسعة.
  9. بعناية بإضافة المادة طافية إلى أنبوب 50 مل جديدة وإضافة يصل إلى 12 مل من المخزن المؤقت للتماثل.
  10. بعناية وبطء "الماصة؛" 2 مل من المادة طافية المخفف على حل متدرج الكثافة 3% مع ماصة 1 مل ووضع الأنابيب على الجليد.
  11. الطرد المركزي في 31,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع لا الفرامل.
    ملاحظة: تعيين معدل التباطؤ في واحدة (صفر) أو بمحاذاة الساحل.
  12. وضع الأنابيب على الجليد وجمع الكسر سينابتوسومي بين 23% الكثافة المتدرجة الحل و 10% كثافة الحل التدرج مع ماصة 2 مل في أنبوب 50 مل. إضافة السكروز المثلج/يدتا المخزن المؤقت تصل إلى 80 مل وتقسيمه إلى أربعة أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل.
    ملاحظة: انظر الشكل 3 لهورمونات سينابتوسوميس مع التدرجات المسمى.
  13. الطرد المركزي في 20,000 ز س لمدة 30 دقيقة في 4 ˚C مع فواصل أقل.
    ملاحظة: تعيين معدل التباطؤ في يومين أو ثلاثة عند الحد الأقصى لمعدل من التباطؤ تسعة.
  14. بعناية إزالة المادة طافية مع ماصة 1 مل، ريسوسبيند سينابتوسومي بيليه مع 1 مل من المخزن المؤقت الفسيولوجية متساوي التوتر (140 ملم كلوريد الصوديوم، 3 مم بوكل، 1.2 مم مجكل2، 1.2 مم نة2بو4و 10 ملم حبيس الجلوكوز 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4)20. إضافة 1 مل من 10% [دمس] في المخزن المؤقت الفسيولوجية متساوي التوتر (تركيز نهائية من [دمس]: 5 ٪) وجمع في سينابتوسوميس إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة 50 مل واحد.
  15. 1 مل الكوة في أنابيب 1.5 مل. قياس تركيز البروتين سينابتوسوميس استخدام مقايسة برادفورد.
  16. بسرعة تجميد الأنابيب وتخزين الأنابيب في ثلاجة عميق-80 درجة مئوية حتى تصريف مؤشر الرقم الهيدروجيني.

2-الأس الهيدروجيني تصريف المؤشر

  1. الطرد المركزي أنابيب 1.5 مل مع سينابتوسوميس في 21,092 س ز لمدة 3-4 دقائق عند 4 درجة مئوية.
  2. إزالة المادة طافية، إضافة 200 ميليلتر من 0.1 م Na2CO3 ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
    ملاحظة: تمت إضافة Na2CO3 لرفع درجة الحموضة إستر سوكسينيميديل الأكثر كفاءة ويتفاعل مع الأمينات الأولية في الرقم الهيدروجيني قلوية قليلاً.
  3. إضافة 2 ميليلتر من مؤشر الرقم الهيدروجيني للأنبوب ودوامه بلطف.
    تحذير: استخدام 1 ميليلتر مؤشر الرقم الهيدروجيني الواحدة 0.3 ملغم لحل سينابتوسومي.
  4. تقليل التعرض للضوء بتغطية هذه الأنابيب مع رقائق الألومنيوم واحتضانها لهم ح 1-2 في درجة حرارة الغرفة (RT) في شاكر تويست بالانفعالات لطيف 30-40 لفة في الدقيقة.
  5. وقف التحريض وإضافة 1 مل دببس.
  6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 21,092 ز س ل 1-2 دقيقة.
  7. إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل دببس ريسوسبيند بيليه بلطيف بيبيتينج.
  8. كرر الخطوات من 2.6-2.7 سبع مرات على الأقل لإزالة مؤشر الرقم الهيدروجيني غير منضم.
  9. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 200 ميليلتر من دببس مع [دمس] 5%.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، كل سينابتوسوميس غير وظيفية. وقد أكدنا أن فوسفاتيديلسيريني (PS) قد تعرضت للغشاء الخارجي سينابتوسوميس، الذي يعمل "أكل-لي" إشارة (الشكل 4).

3-أستروسيتيس وتنقية ميكروجليا

ملاحظة: هذا البروتوكول لتنقية astrocyte مقتبس من ورقة نشرت سابقا21. ويرد في هذا البروتوكول، تنقية astrocytes الفئران وميكروجليا. كما يتم وصف إجراءات محددة لتنقية الماوس astrocytes و microglia في الملاحظات.

  1. قبل تنقية يوم
    1. إعداد أطباق الثقافة الخلية قبل المغلفة والحلول.
    2. إعداد أطباق بيتري خمسة 145 x 20 مم مع 25 مل من 50 مم تريس-HCl (pH 9.5). مكان العلاج جسم أولية أو ثانوية في أطباق بتري بشكل منفصل كما هو موضح أدناه. احتضان الأطباق في الثلاجة بين عشية وضحاها.
      طبق BSL-1: 20 ميليلتر من 5 ملغ/مل BSL-1 (جريفونيا سيمبليسيفوليا يكتين)
      طبق الثانوية فقط: 60 ميليلتر من 2.4 ملغ/مل الماعز الماوس المضادة IgG + IgM (H + L)
      طبق CD45: 60 ميليلتر من 2.4 ملغ/مل الماعز الماوس المضادة IgG + IgM (H + L)
      طبق O4: 60 ميليلتر من 2.4 ملغ/مل الماعز الماوس المضادة IgM (μ-سلسلة محددة)
      Itgb5 (إنتغرين β5) طبق للفأر astrocytes: 60 ميليلتر من 2.4 ملغ/مل الماعز الماوس المضادة IgG + IgM (H + L)
      ملاحظة: لإرفاق جسم الثانوية إلى السطح مسعور طبق بيتري، ينصح مرفق بطيئة في درجات الحرارة المنخفضة. ومع ذلك، من الممكن لمعطف صحن بيتري مع الجسم المضاد الثانوي ح 2 في 37 درجة مئوية. وتستخدم الأجسام المضادة للغسل أستروسيتي بشكل مختلف تبعاً للأنواع الحيوانية؛ على سبيل المثال، هيباكام طبق للفأر astrocytes: 60 ميليلتر من 2.4 ملغ/مل الماعز الماوس المضادة IgG + IgM (H + L)
  2. اليوم لتنقية
    1. إعداد إيمونوبانينج.
    2. إعداد أنابيب 50 مل وإضافة الأرصدة للأنابيب. ويرد في الجدول 1إعداد حل الأسهم مفصلة.
      1. إعداد أنبوب 1 (إنزيم): 22 مل أسهم إنزيم (إنزيم الأسهم: 1 × "الملح حل" إيرل متوازن (EBSS)+0.46% د (+)-الجلوكوز + 26 مم ناكو3 و0.5 مم يدتا).
      2. إعداد أنبوب 2 (منخفض Ovo): 42 مل من مثبط للأوراق المالية (الأسهم المانع: 1 خ EBSS+0.46% د (+)-الجلوكوز + 26 ناكو مم3).
      3. إعداد أنبوب 3 (ارتفاع Ovo): 10 مل من مثبط للأوراق المالية.
    3. إرفاق 0.22 ميكرومتر حقنه مرشحات لنصائح الممصات 2 مل متصلة بخزان2 (95% O2 و 5% CO2) CO. فقاعة CO2 في أنابيب 1-3. وقف محتدما عند الحلول دورة أورانج.
    4. الحلول كاملة.
      تنبيه: استكمال واحتضان الحل في الأنبوب 1 في 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل استخدام تنشيط الإنزيم.
      1. إعداد أنبوب 1 (إنزيم): 22 مل من الأسهم إنزيم + 180 يو غراء + ز 0.004 L-سيستين.
      2. إعداد أنبوب 2 (منخفض Ovo): 42 مل المانع المخزون + 3 مل من Ovo منخفضة + 200 ميليلتر من الدناز.
      3. إعداد أنبوب 3 (ارتفاع Ovo): 10 مل من الأسهم المانع + 2 مل من Ovo عالية + 20 ميليلتر من الدناز.
      4. إعداد أنبوب 4 (BSA 0.2 ٪): 19 مل من 1 X DPBS + 1 مل من جيش صرب البوسنة 4% + 8 ميليلتر من الدناز.
      5. إعداد الأنبوبة 5 (BSA 0.02 في المائة): 45 مل 1 X DPBS + 5 مل من أنبوب 4 + 50 ميليلتر من الدناز.
    5. تسخين مياه كتلة حمام والحرارة في 34 درجة مئوية.
  3. استخراج القشرة الفئران.
    1. تعقيم المعدات الجراحية مع الإيثانول 70% وإعداد أطباق بيتري 100 ملم مع دببس.
    2. إعداد شكل مربع اكريليك. وضع ثلاث طبقات من الأنسجة في الجزء السفلي من المربع وإضافة 1 مل إيسوفلوراني في المربع.
    3. تخدير الجراء ل s 20-40 في المربع وتأكيد أنيسثيتيزيشن برشة سيرا على الأقدام مع الملقط. كشف قلب22 ونتخلل الجراء استخدام حقنه 10 مل مع دببس.
      ملاحظة: يتم استخدام التروية لتجنب تلوث الدم الخلية أثناء الخطوة الغسل microglia.
    4. قص خط ألجرو عنق الرحم العلوي من الرقبة مع مقص التشغيل وجدا جلد الرأس على طول خط الوسط. إجراء شق في الجمجمة على طول خط الوسط وفتح الجمجمة بالملقط منحنية.
    5. المكوس المخيخ مع مقص الربيع كاستروفيجو. تأخذ بها الدماغ المتبقية ووضعه في طبق بتري 100 ملم مليئة دببس.
    6. إزالة مجالات أخرى مثل midbrain والحصين من القشرة مع مقص الربيع كاستروفيجو تحت المجهر. قم بإزالة في السحايا مع الملقط غرامة.
    7. نقل القشرة إلى طبق 60 ملم جديدة وإزالة دببس المتبقية في الطبق. ختم الأنسجة بشفرة رقم 10.
  4. فصل القشرة في تعليق خلية مفردة
    1. من أجل الحل 1 أنبوب المصفاة إلى طبق 60 ملم وإضافة 50 ميليلتر من DNase1. دوامة الحل في الطبق.
      ملاحظة: يتم استخدام الدناز تحول دون تراكم الحمض النووي من الخلايا تمزق.
    2. ضع الطبق في كتلة حرارة 34 درجة مئوية، وتغطية ذلك مع غطاء له حفرة في الوسط. استخدام لحام حديد جعل الثقب في غطاء صحن بيتري 60 ملم.
    3. الاتصال 22-ميكرومتر حقنه مرشحات لأنبوب خزان2 CO ومكان الفلتر في الحفرة.
    4. احتضان الطبق في 34 درجة مئوية عن 45 دقيقة دوامة الحل في الطبق كل 10 إلى 15 دقيقة.
  5. الانتهاء من إعداد أطباق الغسل.
    1. إزالة الأطباق الغسل التي قد تم المغلفة بالأجسام المضادة الثانوية من الثلاجة يوميا قبل الموعد المحدد. ترك صحن BSL-1 وطبق جسم فقط الثانوية في الرايت
    2. غسل الأطباق الأخرى ثلاث مرات مع 20 مل دببس.
    3. صب كمية كافية من جيش صرب البوسنة 0.02% في الأطباق. وضع الأجسام المضادة الأولية المحددة في الأطباق المقابلة:
      طبق CD45: 12 مل من جيش صرب البوسنة 0.02% + 20 ميليلتر من 0.5 ملغ/مل الماوس لمكافحة الفئران CD45
      طبق Itgb5: 12 مل من جيش صرب البوسنة 0.02% + 20 ميليلتر من 0.5 ملغ/مل Itgb5
      طبق O4: 8 مل من جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة و 4 مل من جسم O4
      ملاحظة: للماوس إيمونوبانينج، استخدم الماوس لمكافحة الفئران CD45 (0.5 ملغ/مل) microglia وهيباكام (0.5 ملغ/مل) أستروسيتيس.
    4. إعداد 30 مل من 30% FBS مع وسائل الإعلام نيوروباسال و 10 مل من 1 X ابس. الاحماء كل الحلول في حمام مائي 34 درجة مئوية.
  6. تحول دون رد فعل غراء.
    1. نقل الأنسجة المعالجة بغراء على أنبوب 50 مل جديدة. الانتظار للأنسجة تسوية. نضح السائل بالشفط.
    2. إضافة 4 مل من محلول Ovo منخفضة للأنبوب ودوامه الحل لغسل الخلايا.
    3. كرر الخطوات 3.6.1-3.6.2 ثلاث مرات لإيقاف فعل الإنزيم.
  7. تريتوراتي أنسجة اللحاء.
    1. إضافة 6 مل من Ovo منخفضة للحوض. نضح والإفراج عن الأنسجة بسرعة مع ماصة 5 مل.
      تنبيه: عدم إدخال فقاعات.
    2. إعداد أنبوب 50 مل جديدة وإضافة 5 مل من Ovo منخفضة. جمع الخلايا المفردة في أنبوب جديد.
    3. كرر الخطوات 3.6.1-3.6.2 مرتين وتغيير ماصة 5 مل ماصة 1 مل.
    4. كرر تريتوريشن إلى أكثر من 95% الأنسجة غير مرئية.
    5. جعل طبقة من حل Ovo عالية من أنبوب 3 مع ماصة 10 مل أدناه منخفضة Ovo التي تحتوي على فصل الخلايا.
    6. الطرد المركزي في 190 x ز لمدة 6 دقائق مع الفرامل القليلة.
      ملاحظة: تعيين معدل التباطؤ في واحد أو اثنين عند الحد الأقصى لمعدل من التباطؤ تسعة.
  8. فيلتراتي الخلايا المفردة.
    1. عناية نضح المادة طافية بالشفط، ثم ريسوسبيند بيليه مع 3 مل حل جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة مع ماصة 1 مل.
    2. إضافة حل جيش صرب البوسنة 0.02% تصل إلى 9 مل.
    3. إعداد جديد 50 مل أنبوب ومصفاة الخلية 20 ميكرومتر على رأس الأنبوب. ويت مصفاة الخلية مع 1 مل من محلول جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة.
    4. نقل تعليق خلية مفردة في مصفاة الخلية. تصفية 1 مل في وقت واحد.
    5. أغسل مصفاة الخلية مع 3 مل من محلول جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة. لا تجعل أكثر من 15 مل تعليق خلية واحدة التي تمت تصفيتها.
    6. احتضان الأنبوبة في حمام مائي 34 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة لاستعادة الخلية. الخطوة استرداد الخلية يسمح ريلوكاليزاتيون للخلية البروتينات السطحية للغشاء.
  9. إجراء الغسل للخلايا.
    1. أغسل الطبق CD45 الغسل ثلاث مرات مع 20 مل دببس. أغسل كل صحن ثلاث مرات مع 20 مل دببس فورا قبل الاستخدام.
    2. من أجل تعليق خلية واحدة إلى CD45 الغسل الطبق. يترك الطبق لمدة 28 دقيقة ويهز الطبق لمدة 14 دقيقة. لإزالة الخلايا غير منضم من الأسفل، بعناية يهز الطبق.
    3. نقل تعليق خلية للطبق الثانوي فقط. الانتظار لمدة 20 دقيقة وعناية يهز الطبق لمدة 10 دقائق. للحصول على ميكروجليا من طبق CD45، انتقل إلى الخطوة 3.9.2.
    4. نقل تعليق خلية في صحن BSL-1. يترك الطبق لمدة 10 إلى 12 دقيقة.
    5. نقل إلى الطبق O4. الانتظار لمدة 20 دقيقة ويهز لمدة 10 دقائق.
    6. نقل إلى الطبق Itgb5. يترك الطبق لمدة 40 دقيقة وهزه بلطف كل 10 دقيقة.
      ملاحظة: للغسل الماوس، نقل تعليق خلية في صحن هيباكام.
  10. فصل الخلايا من الطبق.
    1. ميكس 400 ميليلتر من التربسين (30,000 U/mL في ابس) مع بريينكوباتيد مل 8 من 1 X ابس.
    2. من أجل تعليق خلية منفصلة في الطبق في دلو من نفايات.
    3. أغسل الطبق ثماني مرات مع دببس.
    4. صب 8 مل ابس مع التربسين في الطبق.
    5. احتضان الطبق لمدة 5 إلى 10 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 10 دقائق للطبق CD45 و 5 دقائق للاطباق Itgb5 وهيباكام.
    6. انقر فوق الطبق ومراقبة الطبق تحت مجهر.
      ملاحظة: إذا كان عدم فصل أكثر من أستروسيتيس، وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق أخرى.
    7. من أجل 10 مل من 30% FBS في الطبق لتحييد التربسين.
    8. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً في الطبق كامل لفصل astrocytes أو ميكروجليا.
    9. نقل الحل في أنبوب 50 مل.
    10. أضف 10 مل من 30% FBS و 200 ميليلتر من الدناز إلى الطبق. فصل الخلايا مرة أخرى. ويستخدم الدناز لتحول دون تراكم الحمض النووي من الخلايا تمزق.
    11. نقل الحل في الأنبوب. إذا كانت الخلايا تبقى في الطبق، إضافة آخر 10 مل من 30% FBS وفصل الخلايا مرة أخرى.
  11. لوحة الخلايا.
    1. الطرد المركزي الأنبوب في 213 س ز لمدة 10 دقائق.
    2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع وسائل الإعلام.
      ملاحظة: استخدم إيمونوبانيد أستروسيتي الأساسية الوسائط (IP--القذائف التسيارية) astrocytes ووسائل الإعلام الأساسية microglia الشبكية (MBM) مع إيمونوبانيد مكيفة astrocyte الوسائط (IP-ACM) ميكروجليا. وترد في الجدول للموادIP--القذائف التسيارية والتراكيب MBM.
    3. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
    4. لوحة أستروسيتيس وميكروجليا بشكل منفصل في لوحات المغلفة PDL.
      ملاحظة: إعداد لوحة المغلفة PDL قبل الاستخدام. إعداد لوحات المغلفة PDL، إضافة 50 ميليلتر من 1 ملغ/مل بولي-د-يسين في 5 مل ماء المقطر وصب كمية كافية من الحل في اللوحة/الطبق جيدا، وانتظر 30 دقيقة أغسل اللوحة/طبق ثلاث مرات بماء مقطر.
    5. احتضان اللوحة. تغيير نصف وسائل الإعلام كل 7 أيام ل astrocytes و 3 أيام ل microglia.

4-جمع الملكية الفكرية-ACM

  1. تحضير طبق 100 ملم عند astrocytes المتلاقية مفرط.
  2. تجاهل وسائل الإعلام وغسل الطبق ثلاث مرات مع 10 مل دببس.
  3. صب 15 مل من البروتين المنخفض وسائط الإعلام في الطبق.
    ملاحظة: تكوين البروتين المنخفض وسائل الإعلام يرد في الجدول للمواد.
  4. احتضان الطبق لمدة 7 إلى 10 أيام في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  5. جمع وتركيز وسائط الإعلام مع 10 ك (أو 30 ك) أنابيب الطرد المركزي عامل التصفية.
  6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 851 ز x عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: الطرد المركزي هذه الأنابيب حتى وسائل الإعلام المتبقية أقل من 1 مل.
  7. جمع الإعلام مركزة (IP-ACM) في أنبوب 1.5 مل جديدة.
  8. قياس تركيز الملكية الفكرية-ACM استخدام التحليل الكمي

5-البلعمه العيش-التصوير المقايسة (الشكل 2)

  1. إعداد لوحة 24-جيدا (أو أي لوحة/طبق على استعداد للعيش-التصوير) في أستروسيتيس التي هي المتلاقية (عموما، من 7 إلى 10 أيام الحضانة بعد التنقية مثاليا لتحقيق استقرار الخلايا).
  2. قم بإزالة الوسائط في كل بئر وغسل الآبار مع 1 مل دببس، ثلاث مرات. لتقليل التعرض للهواء، غسل الآبار بسرعة.
  3. إضافة 300 ميليلتر للملكية الفكرية--القذائف مع 5 ميليلتر سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني وعوامل إضافية مثل ACM الملكية الفكرية التي يمكن أن تعدل الخلية الدبقية البلعمه.
  4. احتضان اللوحة في CO2 حاضنة لمدة 40 دقيقة. تسمح هذه الخطوة درجة الحموضة مترافق مؤشر سينابتوسوميس لتسوية إلى الجزء السفلي من اللوحات.
  5. قم بإزالة الوسائط مع سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني غير منضم وغسل كل بئر مع 1 مل دببس، وثلاث مرات.
    تنبيه: لا يغسل قسوة. لتقليل التعرض للهواء، غسل الآبار بسرعة.
  6. إضافة 500 ميليلتر للملكية الفكرية--القذائف مع عوامل إضافية لاختبار في الآبار.
  7. تأخذ اللوحة إلى صك العيش-التصوير وتحديد المواقف. ضبط التركيز وزمن التعرض للضوء والسطوع والسلطة الصمام.
    ملاحظة: إعدادات وقت التعرض، والسطوع، والسلطة الصمام هي متغير اعتماداً على كثافة الأسفار، والغرض من هذه التجربة. في مقايسة التصوير العيش مع سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني، نحن عادة تعيين هذه القيم كما يلي: التعرض: ~ 150-200 مرض التصلب العصبي المتعدد، والسطوع: 15، وأدت الطاقة: 4-6.
  8. تعيين تنسيق الصورة والفاصل الزمني، والعدد الإجمالي لدورات لتصوير العيش. تعيين الفاصل الزمني إلى 1 أو 2 ح اعتماداً على كيفية العديد من المواقف المحددة. 2 ساعة فترات ينصح عند تحديد المواقف أكثر من 150 للعيش-التصوير.
  9. بدء تجارب العيش-التصوير.
  10. تحليل البيانات.
    1. افتح برنامج فيجي.
    2. استيراد تسلسل صورة. تحويل الصور إلى الرمادي 8 بت.
    3. تنفيذ الطرح الخلفية مع المتداول بار دائرة نصف قطرها 50 بكسل.
    4. بدء الوقت سلسلة محلل V3 الإضافات.
      ملاحظة: عنوان الوقت سلسلة محلل الإضافات V3 يرد في الجدول للمواد.
    5. جر المنطقة للفائدة (ROI) في الصورة، وانقر فوق إضافة في إدارة العائد على الاستثمار.
    6. انقر فوق "الحصول على مجموع كثافة" في السلسلة الزمنية V3_0.
    7. حفظ النتائج ودمج البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا في المختبر البلعمه المقايسة مع تصوير العيش الطويل الأجل، كنا سينابتوسوميس من الماوس الكبار الدماغ هوموجيناتيس، التي كانت مفصولة (تنبيذ فائق في الحل التدرج بين 23% التدرج الحل والحل التدرج 10% الشكل 3). بعد الإعداد، يتعرض سينابتوسوميس PS في على الغشاء الخارجي (الشكل 4)، مما يوحي بأنها فقدت وظيفتها ويمكن التعرف عليه بواسطة مستقبلات PS في أستروسيتيس وميكروجليا. كما هو موضح في الشكل 5، تن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة، نقدم طرق الطويلة الأجل العيش-التصوير في المختبر البلعمه مقايسة استخدام الخلايا الدبقية المنقي وسينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني. نظهر بالمقارنة مع microglia، أستروسيتيس تمتلك قدرة الإحاطة والتدهور المختلفة أثناء البلعمه سينابتوسوميس. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا بيانات تشير إلى أن العوامل يفرز أستروسيتي، والتي تحتوي على جزيئات سد مثل GAS6، والبروتينات، و MEGE8، ضروري لكفاءة PS-تعتمد على البلعمه من الخلايا الدبقية في الدماغ. وعلاوة على ذلك، تظهر أستروسيتيس كو Megf10 البلعمه معيبة من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون "جونغ" يون-جو لدعم تجريبية لها أثناء تنقية سينابتوسومي وحديقة جونججو لصور سينابتوسوميس مع التعرض PS. وباﻹضافة إلى ذلك، ونحن نشكر جميع الأعضاء في مختبر تشونغ لمناقشة مفيدة. هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (جبهة الخلاص الوطني) منحة ممولة من الحكومة الكورية (مسيب) (2016M3C7A1905391-جبهة الخلاص الوطني وجبهة الخلاص الوطني-2016R1C1B3006969) (دبليو-س. ج).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > تنقية المشبك< / قوي>
PercollGE علوم الحياة للرعاية الصحية17-0891-01
البداية السريعة مجموعة فحص البروتين برادفورد 2BIO-RAD5000202
> اقتران مؤشر الأس الهيدروجيني < / قوي >
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)محلولLPSDMSO100
pHrodo الأحمر ، إستر السكسينيميديلMolecula المجساتP36600
< قوي > مناعي < / قوي >
10X إيرل محلول الملح المتوازن (EBSS)سيجماE7510
مصل الأبقار الألبومينبوفوجينBSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase)ورثينجتونIs002007
(DMEM)جيبكو11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin (BSL-1)Vector LabsL-1100
Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H + L) JacksonImmunoResearch115-005-044
Goat Anti-Mouse IgM (& mu - سلسلة)Jackson ImmunoResearch115-005-020
عامل نمو البشرة المرتبط بالهيبارينSigmaE4643
الأجسام المضادة للهيباككام البشريةR & أنظمة DMAB4108
إنتجرين بيتا 5 الجسم المضاد أحادي النسيلة (KN52)eBioscience14-0497-82
L-cysteineSigmaC7880
L-glutamateGibco25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC)SigmaA8199
الوسائط العصبيةالقاعدية Gibco21103-049
O4 الورم الطافي الهجين(الفأر IgM)Bansal et al.23
PapainWorthingtonIs003126
Penicillin / StreptomycinGibco15140-122
Pluristrainer 20 & mu; مPluriSelect43-50020-03
Poly-D-lysineSigmaP6407
ProgesteroneSigmaP8783
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
الفئران المنقاة المضادة للفأر CD45BD Pharmingen550539
الماوس المنقى المضاد للفئران CD45BD Pharmingen554875
بيروفات الصوديومجيبكو11360-070
سيلينيت الصوديومسيجماS5261
ترانسفيرينسيجماT1147
التربسينسيجماT9935
مثبط التربسينورثينجتونLS003086
أنبوب فائق الوضوح (أنبوب ، رقيق الجدار ، فائق الوضوح)344059 بيكمان كولتر
<قوي> جمع IP-ACM< / strong>
Macrosep أجهزة الطرد المركزي المتقدمة مع غشاء أوميغا (10 كيلو)PALLMAP010C37
أجهزة الطرد المركزي Macrosep Advance مع غشاء أوميغا (30 كيلو)PALLMAP030C37
<قوي > البلعمة مقايسة التصوير المباشر < / قوي >
جولي المرحلةNanoEntek
Time Series Analyzer V3https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html
< قوي ثنائي الإضافات

المراجع

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871(2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355(2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

البلعمة في الخلايا النجميةالسينابتوسومات ذات المؤشر الأس الهيدروجيني (pH)التقام الخلايا الدبقيةالمقارنة مع الخلايا الدبقية الصغيرةتحضير السينابتوسوماتالتصوير بالفاصل الزمنيالقياس الكمي للفلورةتعطيل جين MEGF10فحص الاضطرابات العصبية
الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.