في هذه الدراسة، يصف لنا النهج الخلفي نصف دائري القناة كوسيلة موثوق بها لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الفئران حديثي الولادة. ونحن تبين أن إيصال الجينات عبر قناة نصف دائري الخلفي قادرة على نتخلل الإذن الداخلية كاملة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النهج الخلفي نصف دائري قناة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الماوس الأطفال حديثي الولادة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويوفر العلاج الجيني الإذن الداخلية وعدا كبيرا كعلاج محتمل لفقدان السمع، والدوخة. واحدة من العوامل الحاسمة في نجاح العلاج الجيني الإذن الداخلية هو إيجاد طريقة تسليم التي تؤدي إلى الكفاءة توصيل متسقة من أنواع الخلايا المستهدفة مع التقليل من فقدان السمع. أننا في هذه الدراسة، وصف النهج الخلفي نصف دائري قناة كوسيلة فعالة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الفئران حديثي الولادة. ونحن تبين أن إيصال الجينات عبر قناة نصف دائري الخلفي قادرة على نتخلل الإذن الداخلية كاملة. تحديد القناة نصف دائري الخلفي التشريحية سهلة، فضلا عن التلاعب بالحد الأدنى من العظم الصدغي المطلوبة، نهج جعل هذه الجراحة خياراً جذاباً لإيصال الجينات الإذن الداخلية.
المقدمة
العلاج الجيني الإذن الداخلية حقل التطور السريع للتحقيق. أنه طبق في نماذج مختلفة من الحيوانات لمكافحة مؤقت والصدمة الضوضاء و فقدان السمع الوراثي1. أظهرت دراسات أجريت مؤخرا عدة الانتعاش وظيفية للسمع وتوازن وظائف في الفئران المسخ بعد الإذن الداخلية الجينات العلاج تسليم2،3،4،،من56، 7-من أهم العوامل في تحديد نجاح العلاج الجيني الإذن الداخلية هو النهج الجراحية المستخدمة للوصول إلى الإذن الداخلية. ومن الناحية المثالية، سيكون من السهل لتنفيذ النهج الجراحية والمعالم التشريحية التي ستكون متسقة وسهلة لتحديد وتوصيل الناتجة من أنواع الخلايا المستهدفة ستكون مرتفعة.
في دراسة أجريت مؤخرا، واظهرنا أن عندما تم حقن العلاج الجيني الفيروسي من خلال قناة نصف دائري الخلفي الماوس مركزتين المسخ (نموذج من فقدان السمع، واختلال وظيفي الدهليزية)، كفاءة توصيل لخلايا الشعر حسية كان ينظر إليه في الدهليزية الأجهزة، وكذلك كما هو الحال في القوقعة5. كفاءة عالية لتوصيل الحسية الشعر خلية أسفر عن تحسن الوظائف السمعية والدهليزيه في هذه الفئران المسخ.
في هذه المقالة، يصف لنا بالتفصيل النهج الخلفي نصف دائري قناة الوصول إلى الإذن الداخلية الماوس الولدان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافق جميع الإجراءات الحيوان بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة في المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى NIDCD (ASP1378-15).
1-إجراءات الإعداد والتحضير
- تعقيم جميع الصكوك بأكسيد الإيثيلين في بداية التجربة. بين الحيوانات، وتنظيف أدوات لاستخدام التعقيم حبة.
- تحميل الحل الذي يحتوي على العلاج الجيني الفيروسي في ميكروبيبيتي في مايكرو-الحاقن. النواقل الفيروسية المستخدمة في هذه الدراسة كان AAV2/8-ويرلين (1 × 1013 الجينوم نسخاً في المليلتر، انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: عادة، يتم تحميل 1.1 ميليلتر الحجم الإجمالي إلى ميكروبيبيتي.
2-التخدير
ملاحظة: الضغط الماوس المستخدمة في هذه الدراسة هو الماوس مركزتين. طفرات متماثل (أي/أيمن Whrn) وليتيرماتيس متخالف (Whrn/+ أي) واستخدمت.
- تضع الأم في قفص منفصل (منفصلة من القمامة).
- ضع القفص الصفحة الرئيسية التي تحتوي على القمامة (P0-الجراء P5) على لوح حرارة مغلق (مجموعة عند 37.5 درجة مئوية) الدفء في الفئران.
- قطع الجزء الإبهام من قفاز مطاط، ووضع جرو فيه.
- ضع ألجرو في الإبهام قفاز مطاط في دلو من الجليد ل ~ 2 دقيقة.
- ضع ألجرو أنيسثيتيزيد على حزمة تجميد بلاستيك ساحة تجارية كبيرة مع شاش 4 "4" بين ألجرو والسطح حزمة على.
- ملء قفاز مطاط ثقيلة مع الثلج المجروش، والقفازات الجليد حول ألجرو.
- تحقق لمعرفة إذا كان ألجرو هو تخديره على نحو كاف بغياب كامل لأي استجابة للمنبهات المختلفة (بما في ذلك قرصه إصبع ثابتة). اترك ألجرو في كيس من الثلج لمدة الجراحة (حوالي 5-10 دقيقة).
ملاحظة: نوصي بترك الجراء في كيس من الثلج لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة أثناء الجراحة.
3-العمليات الجراحية نهج (الشكل 1)
- تنظيف الجلد خلف الإذن بمسح اليود ويمسح الكحول مرة واحدة تم تخديره من الحيوان.
- شق بوستاوريكولار ~ 2 مم خلف الإذن باستخدام مقص الصغرى، وتقسيم العضلات الترقوية مع المقص الصغير.
- تحديد العصب الوجهي والفقاعة. الفقاعة عنقية وشبه شفافة في هذا العمر وهو يكذب الآنسي للعصب الوجهي. يمكن رؤية الشريان ستابيديال من خلال الفقاعة في هذا العصر، مما يشكل معلما مفيداً.
- اتبع العصب الوجهي ﻷسلحته وجيدة لتحديد موقع القناة نصف دائري الخلفي (المركز). إزالة ألياف العضلات والأنسجة اللينة التي تغمر القناة نصف دائري الخلفي باستخدام مقص الصغرى.
ملاحظة: بحثتها عنقية في هذا العصر. - اختراق بحثتها استخدام زجاج ميكروبيبيتي (~ 10 ميكرومتر في القطر) على مايكرو-الحاقن.
- حقن العلاج الجيني الفيروسي في الإذن الداخلية.
ملاحظة: عادة، مجموعة حقن 20 من 49 nL العلاج الجيني يتم تسليمها إلى القناة نصف دائري الخلفي ما يزيد على 40 ~ s (إجمالي حجم ~ 1 ميليلتر). وكان عيار الفيروسية المستخدمة 1 × 1013 الجينوم نسخ كل مل. - إغلاق شق الجلد باستخدام خياطة بوليجلاكتين 5-0.
4-بعد العملية الجراحية الرعاية
- ضع ألجرو على لوح الاحترار لاستعادة درجة حرارة جسم طبيعية أثناء الاسترداد من التخدير مع المستمر دليل التحفيز/المتداول مع القفاز الأصابع البشرية.
- مجرد ألجرو مستيقظا، وضعه مرة أخرى في قفصة المنزل.
- عناق كل ألجرو مع مسحه القطن التي تعرضت للفراش القفص المنزل.
ملاحظة: الغرض من هذا هو أن الفئران رائحة كما فعلوا قبل الجراحة، مما يزيد من احتمال الأم إعادة قبول لها القمامة ما بعد الجراحة. إذا كان ذلك ممكناً، يمكن جمع البول من الأم ودعكهما الجراء استخدام مسحه القطن إلى مواصلة تخفيض احتمال الرفض. - تطبيق الزيوت المعدنية للأنف الأم توعي لها8، ويعيد الأم في قفص المنزل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أدى حقن العلاج الجيني ويرلين AAV8 في الفئران مركزتين الأطفال حديثي الولادة من خلال القناة نصف دائري الخلفي ويرلين التعبير (الأخضر) في خلايا الشعر أوتريكولار (الشكل 2)، مع كفاءة الإصابة عموما 53.1 في المائة (SD 38.1، n = 28)5 . كان ممدود ترانسدوسيد الشعر الخلايا ستيريوسيليا (أحمر) مقارنة بخلايا الشعر من آذان غير حقن كونترالاتيرال (5.35 ميكرومتر ± 2.11 مقابل 3.20 ± 0.34 ميكرومتر، على التوالي)5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وصف العديد من الطرق الجراحية الوصول إلى القوارض الداخلية الأذنين. كوتشليوستومي والنهج في إطار جولة هي الأكثر استخداماً للوصول إلى القوقعة، حين الخلفي نصف دائري القناة والنهج endolymphatic sac تستخدم عادة للوصول إلى أجهزة الدهليزية1. في دراسة أجريت مؤخرا، واظهرنا أن القناة نصف دائري الخلفي حقن العلاج بالجينات فيروسية أدت إلى كفاءة عالية لتوصيل خلية الشعر في أجهزة الدهليزية و القوقعة5. في الواقع، كان توصيل cochlear الشعر الخلية أعلى من خلال الحقن اللاحق نصف دائري القناة، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا الكشف عن البيانات ذات الصلة لجعل.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل الأموال من نيدكد شعبة من داخلية البحوث/NIH (DC000082-02 إلى W.W.C.)، وكذلك DC000081 للتصوير الأساسية والمتقدمة. ونحن ممتنون لموظفي مرفق الحيوان نيدكد لرعاية الحيوانات لدينا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر التشغيل | Zeiss | OPMI بيكو مجهر الأنف والأذن والحنجرة. ستعمل أيضا مجاهر التشريح الأخرى. | |
| العلوم | الدقيقة | الدقيقة 11251-10 و 11295-51 | # 5 و # 55 Dumont |
| Micro-Scissors | أدوات العلوم الدقيقة | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision | ||
| وسادة تسخين | Mastex | موديل 500/600 | |
| 5-0 خيوط فيكريل | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | ناقلات Biolabs | ||
| ماصة زجاجية | أدوات Sutter | B100-75-10 | زجاج البورسليكات |
المراجع
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524(2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
