مطلوب تميع السائل المنوي للحيوانات المنوية أن يتحرر من هلام المنوي. وتوفر هذه الدراسة إجراءات جمع السائل المنوي من الجماع بعد انتهاء الأنثى التناسلي، وقياس الوقت تميع السائل المنوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جمع بعد التزاوج السائل المنوي من الإناث المسالك التناسلية وقياس لتسييل المني في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الفئران، تودع أنزل المني في الرحم. يتغير السائل المنوي بعد القذف، الاتساق من جل تشبه إلى مائي، تسمى عملية تسييل. في هذه الدراسة، علينا إظهار كيفية جمع السائل المنوي بعد اجاكولاتيد من المسالك التناسلية الإناث في طراز ماوس. أولاً، الكبار الفئران الإناث في مرحلة السفاد داخل قفص الذكور بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، أكدت وجود المكونات كوبولاتوري في افتتاح المهبل الجماع. كانت الفئران الإناث مع المقابس copulatory euthanized، وجمعت كل التناسلي ككل (المهبل، الرحم، أوفيدوكتس، والمبايض)، ضمان نظام مغلق لاحتواء السائل المنوي. وضع المسالك التناسلية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وانقطع المهبل بالإفراج عن السائل المنوي في الأنبوب. للتأكد من حجم السائل المنوي كحد أقصى للتحليل، استخدمت الملقط بلا أسنان للضغط على قرون الرحم من المبيض نهاية إلى نهاية المهبل طرد السائل المنوي المتبقية. ثم تم تجاهلها كلياً التناسلي. كان نسج الأنبوبة المحتوية على السائل المنوي بإيجاز إلى أسفل. ماصة شعرية 25 ميكروليتر وضعت في أنبوب بزاوية 180 درجة (موازية لجدار الأنبوبة). تم تسجيل مقدار الوقت المستخدم لملء الأنبوب الشعرية إلى السطر 25 ميكروليتر. وعادة ما يستغرق السائل المنوي من مربي ذكور ثبت حوالي 60-180 s لملء أنبوب شعري 25 ميكروليتر. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب جمع السائل المنوي في التطبيقات الأخرى المتلقين للمعلومات مثل تحليل التصوير وحركية الحيوانات المنوية.
المقدمة
وتتألف التناسلي الإناث المسالك العلوي والسفلي. ويشمل المسالك التناسلية العليا فالوب والرحم، واندوسيرفيكس. ويشمل التناسلي السفلي في اكتوسيرفيكس والمهبل. في البشر، وهو إيداع السائل المنوي اجاكولاتيد في الجدار الأمامي للمهبل، المتاخمة لل اكتوسيرفيكس1. في الفئران، ولكن السائل المنوي هو اجتاحت الرحم في غضون دقائق بعد التزاوج2.
السائل المنوي يحتوي على جل المنوي هو توطد في غضون ثوان قذف، مما تسبب في الحيوانات المنوية تكون شرك والمعطل تداولها3. تسييل النشرات الحيوانات المنوية المعطل تداولها بتغيير السائل المنوي من جل تشبه إلى اتساق مائي. هذه العملية ضروري لعدد الحيوانات المنوية الحركة واستنساخ الثدييات. معظمها يستند إلى المعرفة تميع السائل المنوي في المختبر الدراسات حيث يصبح المني المسال في صحن ثقافة. في البشر، والنشاط الأنزيمي مستضد البروستات محددة أو هيكل السلام والأمن (المعروف أيضا كاليكرين المتصلة peptidase 3 أو KLK3) هو المساهم الرئيسي لاسالة عن طريق التحلل المائي سيمينوجيلينس (هلام تشكيل البروتينات الموجودة في السائل المنوي)4 ،،من56. تدهور سيمينوجيلينس تحرر الحيوانات المنوية من coagulum المنوي، زيادة تنقل الحيوانات المنوية. أطلق سراح الحيوانات المنوية تسبح نحو قناة فالوب لتخصيب البويضة. تسييل (أو لزوجة السائل المنوي) الاختبارات واحدة من العروض الأولية القياسية لتحليل السائل المنوي في عيادات الخصوبة لتقييم خصوبة الذكور7.
مقال نشر مؤخرا تبين أن تحليل السائل المنوي التي جمعت من الماوس الأنثى التناسلي بعد التزاوج يمكن استخدامها لتوضيح قصورا في تسييل وبعد ذلك يمكن أن يسبب الخصوبة العيوب8. تسييل معيبة مثل هايبرفيسكوسيتي السائل المنوي يساهم 11.8-32.3 في المائة حالات العقم في الرجال9، مما يوحي بأن اسأله عادية لا غنى عنه لاستنساخ الثدييات. ومع ذلك، ركزت الدراسات وعلاج العيوب تسييل حصرا على الذكور7. لم تستكشف إمكانية أن الأنثى التناسلي يلعب دوراً في تميع السائل المنوي. ولذلك، سيوفر طرق جمع السائل المنوي وقياس الوقت تسييل الباحثين أداة تشخيصية جديدة لتحديد سواء تسييل يمكن أن يكون واحداً من أسباب العقم في الكائن الحي النموذجي للفائدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الحيوانات والإجراءات المستخدمة في هذه الدراسة تم التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية جامعة الدولة واشنطن (WSU) العناية بالحيوان واستخدام اللجنة ووفقا لبروتوكولات الحيوانية وافقت WSU #4702 و #4735.
1-الفئران
-
استخدام معيار C57BL/6J الفئران الذكور البالغين أو السلالات الأخرى ذات الاهتمام. الحفاظ على الحيوانات تحت بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة، مع وصول libitum الإعلانية للماء والغذاء.
- استخدام مربي الذكور تتراوح بين 8 أسابيع من العمر 10 أشهر. استخدم فقط ثبت مربي في التجارب.
-
استخدام الفئران الإناث الكبار مع حذف انتقائي أنسجة من المسالك التناسلية الإستروجين مستقبلات α (المشفرة بواسطة الجين Esr1 ) في الخلايا الظهارية10 (Wnt7aCre/+؛ Esr1و/واو، يسمى خروج المغلوب أو "كو") والتحكم في ليتيرماتيس (Esr1f/f، تسمى "CTRL") في هذه الدراسة.
- استخدم 8 أسبوع الإناث. إعمار الإناث تختلف باختلاف هذه التجربة للفائدة.
- تحديد مراحل دورة الشبقية في الصباح في ح 08:00. استخدم فقط من الإناث في مرحلة الدورة السفاد. لطرق مفصلة لتلطيخ المهبلية وتحليل الخلوية، تشير إلى أن الإجراءات المنشورة سابقا11.
2-التزاوج وتقييم المقابس Copulatory
- في يوم السفاد (ح 16:00)، منزل الأنثى في قفص الذكور.
- في صباح اليوم التالي (08:00 h)، فصل الإناث عن الماوس الذكور.
- استخدم لتكيف من الأسلوب المنشورة سابقا12 للوصول إلى وجود أو عدم وجود المكونات المهبل أو كوبولاتوري كمؤشر للتزاوج.
- أمسك الماوس الإناث من قاعدة الذيل رفع أطرافه هند بإيجاز.
- البحث عن المكونات كوبولاتوري بوجود coagulum المنوي البيض في افتتاح المهبل باستخدام مسواك. إذا كان التوصيل copulatory الحالية، لن قادراً على إدراجها في القناة المهبلية المسواك.
3-إعداد قبل جمع الأنسجة
- إعداد 10 مل ليبوفيتش في L-15 وسائط الإعلام، وتستكمل مع 1% مصل بقرى الجنين (تسمى الوسائط L15 + 1% FBS) في أنبوب 15 مل. وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي احتضانها.
- بغية المحافظة على استمرارية الأنسجة والحيوانات المنوية للتطبيقات المصب، الكوة 2 مل المعالجون مسبقاً وسائل الإعلام L15 + 1% FBS في ميكروسينتريفوجي 2 مل أنبوب لجمع الأنسجة.
- الحارة مرحلة ستيريوميكروسكوبي إلى 37 درجة مئوية. تعيين الحرارة-الكتلة إلى 37 درجة مئوية ووضع أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 فارغة في الكتلة.
- إذا تتطلب التطبيقات المصب التصوير لعدد الحيوانات المنوية الحركة، الحارة الشريحة الزجاجية إلى 37 درجة مئوية.
4-الأنسجة جمع
- إحضار المعالجون مسبقاً L15 الوسائط + 1% FBS قاسمة لمنطقة جمع الأنسجة.
- Euthanize الأنثى (~ 08:30 ح) استخدام الخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بخلع عنق الرحم.
ملاحظة: هذا ما يقارب 8 ح بعد التزاوج، على افتراض أن التزاوج يحدث في منتصف الليل. - وضع الحيوان في موقف ضعيف لفضح منطقة البطن.
- رذاذ الكحول 70% في البطن قرب هند أطرافه.
- استخدام مقص تشريح لقطع صغيرة (~ 1 سم) على الجلد من أسفل البطن.
- استخدام اليد المهيمنة لسحب الذيل (واطرافهم هند إذا لزم الأمر) بينما تسحب اليد غير المهيمنة الجلد في الاتجاه المعاكس (نحو الرأس) لفضح عضلة البطن. يتم استخدام هذا الأسلوب لتقليل كمية التلوث الشعر إلى أجهزة الحشوي.
- قطع عضلة البطن في الخامس-شكل عند قاعدة البطن، المتاخمة للمهبل، للكشف عن أجهزة الحشوي.
- تحريك الأمعاء والدهون في منطقة البطن إلى الجانب لفضح المسالك التناسلية.
- تقليم قبالة الأنسجة الأخرى فوق منطقة المهبل والمثانة.
- قص العانة الارتفاق عن بعضها البعض للوصول إلى الأنسجة المهبلية.
- رفع الأنسجة المهبلية عند افتتاح المهبلي واستخدام المقص لفصل القناة المهبلية من أنسجة المستقيم.
- تقليم بعناية قبالة الدهون المساريقي العلوي من كلا الجانبين من الرحم باستخدام مقص الربيع.
تنبيه: هشة للغاية مع السائل المنوي داخل الرحم. يجب الحرص على عدم ثقب الرحم، وأﻻ فسوف تضيع السائل المنوي. - رفع التناسلي السفلي وقطع لوحة الدهون المبيض الخروج من كلا الجانبين.
- نقل كامل التناسلي في أنبوب L-15 وسائل الإعلام قبل حرارة ليبوفيتش + 1% FBS.
5-قياس تميع السائل المنوي (اللزوجة) من جمع المحتوى الرحم
- في مرحلة ساخنة ستيريوميكروسكوبي، نقل الأنسجة إلى طبق استنبات الأنسجة معقمة 35 ملم مليئة 3.5 مل استعد قبل الإعلام L-15 + 1% FBS لتنظيف أنسجة الدم والملوثات الأخرى.
تنبيه: أثناء الغسيل، انتزاع الأنسجة من الدهون، لا الرحم. عند هذه النقطة، من المتوقع السائل المنوي يكون سليمة داخل الرحم. - لطخة الأنسجة الزائدة الوسائط باستخدام مناديل المختبر.
- اضغط الأنسجة في نهاية المهبل أثناء وضع نهايات المبيض في أنبوب ميكروسينتريفوجي قبل ساخنة. حين عقد في نهاية المهبل، قص قرون الرحم في قاعدة الرحم، والسماح لقرون الرحم إلى الوقوع في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- السائل المنوي واسمحوا تدفق من قرون الرحم إلى الأنبوب. استخدام الملقط بلا أسنان للضغط بلطف قرون الرحم من المبيض نهاية إلى نهاية المهبل، طرد من بقايا السائل المنوي.
- تجاهل الأنسجة في حقيبة واقية وحرقها.
- باختصار تدور أسفل السائل المنوي في مينيسينتريفوجي (~ 1-2 s).
- وضع الأنبوب، موازية لمرحلة ساخنة--سوف لا تسرب السائل المنوي خارجاً.
- جهاز ضبط الوقت جاهزة وتعيين 'العد'.
- إدراج أنبوب شعري 25 ميليلتر في عينة السائل المنوي بزاوية 180 درجة (موازية لجدار الأنبوبة). وهذا لتقليل التفاوت بين كل محقق من عقد الأنبوبة الشعرية في زوايا مختلفة.
- اضغط جهاز ضبط الوقت حالما الأنبوبة الشعرية يجعل الاتصال مع السائل المنوي.
- تسجيل الوقت (s) فإنه يأخذ للسائل المنوي الوصول إلى خط 25 ميليلتر.
- عند الانتهاء من القياس فورا الأنبوب الذي يحتوي على السائل المنوي مرة أخرى في كتلة الحرارة الجافة لمزيد من التحليل الوظيفي، مثل التصوير بالفيديو لعدد الحيوانات المنوية الحركة.
- تطهير الأنبوبة الشعرية التي تحتوي على السائل المنوي بغمر الأنبوب في حل التبييض 10% لمدة 20 دقيقة، وتجاهل الأنبوبة الشعرية في حاوية الأدوات الحادة.
6-فيديو تصوير لعدد الحيوانات المنوية الحركة
- قم بتشغيل المجهر وبرامج التصوير الفيديو.
- "الماصة؛" 20 ميليلتر من السائل المنوي المتبقية على شريحة الزجاج المعالجون مسبقاً، في حين يتم وضع الشريحة الزجاجية في مرحلة ساخنة.
- تغطية مع ساترة زجاج.
- ضع الجانب ساترة الشريحة إلى أسفل في المجهر.
- استخدام 20 X عدسة الهدف لإيجاد مجال الاهتمام.
- تغيير إلى 100 عدسة الهدف العاشر للتصوير بالفيديو.
- تسجيل الفيديو 12 الإطارات في الثانية (fps) لمدة 30 ثانية.
- سجل أشرطة الفيديو عشوائياً في مناطق مختلفة على الأقل 3 للحيوان الواحد.
- إجراء التصوير بسرعة وتقليل التعرض للضوء على الشريحة حفاظا على عدد الحيوانات المنوية الحركة وقدرتها على البقاء.
ملاحظة: هذا الإجراء التصوير، وينبغي أن يتم ضمن 2-3 دقيقة. - القيام بتحليل البيانات استخدام برنامج إيماجيج كما هو موضح سابقا8.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم جمع السائل المنوي من CTRL وكو ح الإناث حوالي 8 بعد التزاوج مع الذكور CTRL خصبة. تسييل (أو لزوجة السائل المنوي) هو كمياً بالوقت الذي يستغرقه لملء 25 ميكروليتر الأنبوبة الشعرية مع السائل المنوي. السائل المنوي التي جمعت من السيطرة التي استغرق 2.06 ±0.12 دقيقة (mean±S.E.M, n = 5) لملء الأنبوب الشعرية (الشكل 1). غير أن السائل المنوي التي جمعت من كو التي استغرق وقتاً أطول من 60 دقيقة (60.0 ±0.0، mean±S.E.M، ن = 5) من الوقت التجريبي. تشير هذه البيانات إلى أن السائل المنوي هو إل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
جمع السائل المنوي من الماوس التي يمكن أن توفر مزايا أكثر من السائل المنوي تحليل في المختبر كما السابق ويمكن توضيح التفاعلات الفسيولوجية بين السائل المنوي والإفرازات من الأنثى التناسلي. تسمح التقنيات المعروضة في هذه الدراسة الباحثين لتحديد نوعية السائل المنوي وكذلك بقاء الحيوانات المنوية وحركية في الظروف الفسيولوجية المثالية. وعلاوة على ذلك، هناك مختلف التحليلات المتلقين للمعلومات التي يمكن أن يؤديها باستخدام السائل المنوي التي جمعت من يشكل، على سبيل المثال، يمكن أن تحسب الحيوانات المنوية لتحديد العدد ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل كلية الطب البيطري (WSU) بدء الصندوق إلى WW. يشكر المؤلفون سييرا أولسن (WSU) لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مسواك | الماس | 750 - معقمة مسطحة | معقمة ، استخدم عود أسنان ضعيف. لا تستخدم |
| مقص تشريح | Fisher | 08-940 | |
| مقص زنبركي | Roboz | RS-5600 | |
| ملقط ناعم | Roboz | RS-5045 | |
| 25-& mu ؛ L أنبوب شعري زجاجي | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz ' s L-15 وسائل الإعلام | Life Technologies | 11415064 | مكمل مع 1٪ FBS |
| مصل الأبقار الجنين (FBS) | الجوزاء المنتجات الحيوية | 100-106 | |
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Axygen | MCT-200-A | |
| سخان بلوك جاف رقمي | VWR | 13259-052 | لتسخين أنبوب الطرد المركزي الدقيق قبل جمع السائل المنوي |
| جهاز الطرد المركزي | المصغر Corning | LSE 6765 | |
| طبق ثقافة 35 مم | VWR | 10861-656 | |
| الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 15 مل | VWR | 10025-686 | |
| حمام مائي | دقيق | TSGP05 | |
| مجهر مجهر مجسم للمرحلة الساخنة | Leica Microsystems | MZ10F | للحفاظ على دفء الأنسجة قبل مجموعة السائل المنوي |
| مجهر برايتفيلد | لايكا مايكروسيستمز | DMi8 | اختياري. للتصوير بالفيديو لحركة المنوية |
| كاميرا | Leica Microsystems | DMC2900 | اختياري. لتصوير الفيديو لحركة المنوية الشرائح |
| الزجاجية | فيشر | 12-552-3 | اختياري. لتصوير الفيديو لحركة المنوية |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | اختياري. للتصوير بالفيديو لحركة المنوية |
| مخفف التبييض | في dH2< / sub>O إلى تركيز 10٪ |
المراجع
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
