مقالة منهجية

حمل جزئ لوكس Cre في قشرة الدماغ الماوس عن طريق انهانسر في الرحم

11.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

نوفمبر 17, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

مهام خلية مستقلة للجينات في الدماغ يمكن دراستها بالخسارة أو الحصول على وظيفة في السكان متفرق من الخلايا. وهنا يصف لنا في الرحم انهانسر توصيل recombinase لجنة المساواة العرقية إلى السكان متفرق لتطوير الخلايا العصبية القشرية بالجينات فلوكسيد يسبب فقدان وظيفة فيفو.

الملخص

يمكن الكشف عنها بالتسبب في فقدان الوظائف العصبية خلية مستقلة للجينات أو الحصول على وظيفة الجينات في مجموعة سكانية صغيرة ومتفرقة من الخلايا العصبية. للقيام بذلك يتطلب توليد فسيفساء محاطة الخلايا العصبية مع الخسارة أو للحصول على وظيفة الجينات التي الأنسجة دونما قلاقل وراثيا. هنا، نحن ضم نظام جزئ لوكس Cre مع انهانسر في الرحم من أجل توليد أنسجة المخ الفسيفساء التي يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجينات في الخلايا العصبية في خلية مستقلة. يتم إدخال الحمض النووي بنيات (متاح عن طريق مستودعات)، الترميز لتسمية الفلورسنت ولجنة المساواة العرقية recombinase، في تطوير الخلايا العصبية القشرية التي تحتوي على جينات محاط بمواقع لوكسب في أدمغة الأجنة ماوس استخدام الرحم انهانسر. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا مختلف التعديلات إلى الأسلوب انهانسر في الرحم التي تزيد من قابلية وإمكانية تكرار نتائج. ويتضمن هذا الأسلوب أيضا إنشاء عيار لاقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية في عدد سكان متفرق أو كثيفة للخلايا العصبية. لا تتطلب التحضير النسيجي من أنسجة الدماغ المسمى (ولكن يمكن تكييفها ل) إيمونوهيستوتشيميستري. بنيات يستخدم ضمان أن المسمى فلوريسسينتلي تحمل الخلايا العصبية الجينات ل recombinase لجنة المساواة العرقية. التحضير النسيجي يسمح بتحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية من خلال تصوير [كنفوكل] العرش الجذعية ومحواري والعمود الفقري الجذعية. لأن الخسارة أو الربح للدالة يتحقق في الأنسجة فسيفساء متناثرة، يسمح هذا الأسلوب دراسة ضرورة خلية مستقلة والكفاية للجينات المنتجات في فيفو.

المقدمة

توليد فسيفساء وراثية نموذج تجريبي كلاسيكية لفهم وظيفة الجينات للفائدة. لتحديد ما إذا كان أحد جينات اللازمة للنمط الظاهري خلوية، أبسط نهج يسبب فقدان وظيفة الجينات في الكائن الحي (مثل خروج المغلوب). لتحديد إذا كان جين مطلوب على وجه التحديد في نوع خلية معينة، خروج المغلوب الجينات في جميع أنحاء الحي غير نهجاً صحيحاً. بدلاً من ذلك، أسلوب المطلوبة التي سوف يؤدي إلى فقدان وظيفة الجينات في خلية معينة بينما محاط بأنسجة wildtype (أي دونما قلاقل وراثيا) – وبعبارة أخرى، إنشاء فسيفساء النسيج. إذا كانت الخلية متحولة يظهر النمط الظاهري المسخ، لكن الخلايا المحيطة wildtype لا، وظائف الجينات بطريقة خلية مستقلة. تحليل الأنسجة الفسيفساء، فيها خلايا متحولة محاطة بأنسجة wildtype، يعتبر مثاليا لفهم وظائف خلية مستقلة للجينات، ولا سيما في الدماغ التي تشكل فيها الخلايا العصبية وإطلاق شبكة مترابطة واسعة من الأنسجة.

وقدمت عدة أشكال من أنسجة المخ فسيفساء نماذج قوية للتحقيق في مهام خلية مستقلة للجينات. دراسات تركز على زرع الخلايا العصبية1من الإناث mosaicism ترتبط X2،3،4، و mosaicism الجسدية الذاتية5،6 وضعت استنتاجاتهم تستند إلى فسيفساء أنسجة المخ. حذف الشرطي الجينات من خلال نظام جزئ لوكس Cre هو طريقة التي تحيط استفادة كاملة من توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا كبيرة. في هذا الأسلوب، يتم عرض موقعين لوكسب على جانبي تسلسل المطلوبة من الجينات (مثل إكسون)، تاركة محاط بمواقع لوكسب أن تواجه معا في نفس الاتجاه ("فلوكسيد"). لجنة المساواة العرقية recombinase excises التسلسل بين مواقع لوكسب7. يمكن اقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية بعبور فلوكسيد الفئران إلى آخر السطر الماوس معربا عن recombinase Cre جنبا إلى جنب مع علامة مضيئة في مجموعة فرعية خلايا ("لجنة المساواة العرقية مراسل الخط"). وهذا قد تجلى في مجموعة متنوعة من الطرق للكشف عن وظائف الجينات في مجموعات فرعية خلايا، مثل الخلايا العصبية ضادات أو أستروسيتيس8. يمكن التعبير عن خطوط مراسل Cre كريرT2 للسماح باقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية أن المخدرات إيندوسيبلي (واحد-العصبية وسم مع إيندوسيبلي بالضربة القاضية بوساطة لجنة المساواة العرقية، أو بقعة)9. في استراتيجية أخرى تسمى التحليل الفسيفساء مع ضعف علامات (مآدم)10،11، يسمح بوساطة لجنة المساواة العرقية جزئ إينتيرتشروموسومال متحولة متماثل المراد إنشاؤها جنبا إلى جنب مع أنسجة متخالف. في هذه النهج، يحتاج خط جديد من الفئران إنتاج كل الوقت لكل مرشح الجينات أو نوع فرعي الخلوية التي يتم اختبارها. بدلاً من ذلك، ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية ويمكن إدخال وأرزان ارتباط المستقبلات عن طريق الرحلان12 ، أو عن طريق النواقل الفيروسية (مثل الفيروسات المرتبطة بالغدة13 أو lentiviruses14 تحمل الخلوية الخاصة بالنوع الفرعي دعاة). هذه الاستراتيجية إنشاء العلامات القوية وبعد الولادة. لاستهداف تنمية الخلايا العصبية القشرية الدماغية قليلة وبريناتالي، استراتيجية مثالية في الرحم انهانسر من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية مع علامة نيون.

بالإضافة إلى الجمع بين جزئ لوكس Cre خلال انهانسر في الرحم لإنتاج الفسيفساء الأنسجة في الجسم الحي، ونقدم عدة تعديلات على إجراءات من غيرها البروتوكولات المنشورة15،، من16 17،،من1819،،من2021. نحن نقدم المعلومات لتحسين النجاح في تربية الإناث الحوامل في الوقت المناسب. ونحن أيضا الخطوط العريضة لدينا استراتيجيتين لإدخال العلامات متفرق ومشرق للخلايا العصبية في الأنسجة القشرية: استراتيجية واحدة تيتراتي مستويات بناء واحد الترميز ل recombinase لجنة المساواة العرقية، وعلامة نيون22. استراتيجية أخرى لاستخدام نظام "سوبر نوفا"، تستهدف على وجه التحديد مع هذه المعايير في الاعتبار23،24. بالإضافة إلى ذلك، نقدم لإدخال تحسينات على إنتاج الماصات microinjection متسقة والتبسيط لجراحة انهانسر في الرحم . وأخيراً، فإننا مخطط الخطوات الحاسمة في تحضير النسيجي مبسط يسمح تحليل الأشواك الجذعية والجذعيه ومحواري العرش، دون تلطيخ المزيد أو إيمونوهيستوتشيميستري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأساليب الموصوفة هنا وافق عليها "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (أكوك) من جامعة جيمس ماديسون، ووفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة.

1. إعداد الماوس

  1. بيت شباب (> P60) الماوس فلوكسيد متماثل الذكور والإناث معا لإعداد من زوج مربي25.
    ملاحظة: عنصر تحكم سلبي جيدة هو إعداد على زوج مربي إضافية wildtype الفئران، في لجنة المساواة العرقية التي لن يسبب التعبير recombinase فسيفساء26.
  2. تسمح الأنثى تضع مولودها ورفع القمامة أول لها مع الذكور. تبقى الذكور مع الإناث لزيادة البقاء على قيد الحياة للقمامة. بعد الفطام فصل القمامة، مثلاً في يوم بعد الولادة (ف) 21، ذكر وأنثى.
  3. تربية مورين
    1. قم بإعداد توقيت التزاوج بين الذكور والإناث25. استخدام الإشارات المرئية لتحديد دورة السفاد الإناث27، والتحقق من المقابس المهبلي في صباح اليوم التالي التزاوج25.
    2. إذا تم العثور على أحد المكونات، فصل، وتزن الأنثى. عد اليوم كيوم الجنينية (ه) 0.5.
    3. ما زالت تزن الأنثى كل 3-5 أيام لتحديد ما إذا كانت حاملا. وسيكون الإناث الحوامل بزيادة 10-20 ٪ في وزن الجسم 7-10 أيام بعد الحمل (E0).
      ملاحظة: هذه الخطوة تؤكد الحمل في وقت سابق وأكثر موثوقية من التفتيش البصري25.
    4. إذا لم تكن الأنثى الحامل، كرر الخطوات 1.3.1-1.3.3.
  4. حالما يتم تأكيد الحمل، اختر تاريخ انهانسر في الرحم . لاستهداف طبقة الثاني/الثالث القشرية المتكفل الخلايا العصبية الهرمية، أداء انهانسر في E15.5.

2. إنشاء الحمض النووي

  1. اختر بناء الحمض النووي واحد تلك الرموز recombinase لجنة المساواة العرقية، فضلا عن علامة نيون، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)28،29. بدلاً من ذلك، استخدام نظام "سوبر نوفا"، ووصف بالتفصيل في المنشورات السابقة23،24. انظر على سبيل المثال بنيات قائمة بالمواد.
  2. تضخيم construct(s) الحمض النووي من الخطوة 2، 1 في كولاي استخدام التقنيات القياسية الميكروبيولوجية30.
  3. تنقية بنية الحمض النووي مع مجموعة مواد تنقية بلازميد خالية من الذيفان اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الوت في البناء مع المياه خالية من الذيفان.
    ملاحظة: اختيار مجموعة مواد تنقية الذيفان مجاناً على مجموعة مواد تنقية قياسية الحاسمة.
  4. تركز النذرة الحمض النووي إلى 1-3 ملغ/مل اعتماداً على كثافة وضع العلامات المطلوب26.
    ملاحظة: يلزم عيار دائماً تنشأ عند العمل مع بنية الحمض النووي جديد، نظراً لأن لها أطوال مختلفة والمروجين. النظر بالحقن بناء على عدة تركيزات مختلفة و/أو المبالغ لتقييم التعبير. على سبيل المثال، حقن 1 ميليلتر أو ميليلتر 1.5 2.0 ملغ/مل التجارة والنقل. لجنة المساواة العرقية يمكن أن يؤدي متفرق (1 ميليلتر) أو كثيفة (1.5 ميليلتر) وسم طبقة الخلايا العصبية الهرمية القشرية المرئي الثاني/الثالث26.
  5. إضافة 0.4% تريبان الأزرق في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4 ح2س، تعديل درجة الحموضة 7.4 مع HCl) 01:10 في حل الحمض النووي مركزة.
  6. إضافة برنامج تلفزيوني x 10 01:10 إلى الحل الحمض النووي مركزة.
  7. مخزن الحل الحمض النووي تتركز في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين الحل إلى أجل غير مسمى.

3-ماصة الإعداد

  1. استخدام ساحبة شعرية زجاج، سحب ماصة مع طويلة جداً (10-15 ملم) تفتق وجيد جداً نصيحة، نموذجية من الماصات لحقن الخلايا الجذعية الجنينية أو النقل النووي31.
    ملاحظة: لمنع الأنقاض من تلويث الماصات، ينبغي خلال يومين الجراحة.
    1. معايرة ساحبة الشعرية الزجاج عن طريق إجراء اختبار الانحدار، اتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدام قيمة الحرارة الناتجة لهذا البرنامج سحب البروتوكول استخدام المعلمات التالية: الحرارة = (قيمة الاختبار المنحدر + 15)، سحب = 30، حطي = 120، وقت = 100، ضغط = 200. إدراج الشعرية الزجاج وربط المشابك على ساحبة وتفعيل البروتوكول سحب المبرمجة، وخلق تفتق على شعري الزجاج.
    2. التأكد من أن طول تفتق ما بين 10-15 مم استخدام مجهر ضوء مركب (مثلاً 10 الهدف العاشر)31.
  2. كسر مرة أخرى الماصة شكل تلميح الخام ارتفع إلى قطرها 20-25 مليميكرون.
    1. مركز مسح مهمة طبقة واحدة (انظر قائمة المواد) أكثر 50 مل كوب وتمتد يمسح مشدود مع يد واحدة. من جهة أخرى، عقد ودفع ماصة (تفتق الجانب الأسفل) عمودياً والكامل من خلال مركز المسح، مما تسبب في كسر نظيفة في تفتق31.
      ملاحظة: دفع ماصة تماما من خلال المسح ستنتج 20-25 ميكرومتر تلميح قطرها حوالي 70 في المائة الوقت.
    2. تأكيد تحت مجهر مركب خفيفة (مثل الهدف 20 x).
      تحذير: استخدام حماية العين أثناء كسر الزجاج.
  3. معايرة ماصة واسطة يسفط ميليلتر 1 من 0.4% تريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني x 1 إلى بيبتي معبأ جزئيا، ثم تخرجه الماصة مع علامات 1 ميليلتر استناداً إلى ارتفاع 1 ميليلتر في الماصة، استخدام علامة مقاوم للكحول يميل الجميلة. استخدام ماصة معايرة للدراسات العليا في الماصات الأخرى قبل تجاهل. تبقى الماصات في حامل ماصة خالية من الغبار والجزيئات الأخرى.

4- في الرحم انهانسر

  1. ضع جرايفى الملقط وقزحية مقص وهارتمان الملقط البعوض، والإسفنج الشاش غير المنسوجة، الملقط خاتم ذات الرؤوس وأطباق بيتري على صينية فولاذ المقاوم للصدأ، والتفاف مع رقائق الألومنيوم. ضع صينية والمالحة 0.9% 1 لتر (0.9% wt/المجلد كلوريد الصوديوم في الماء) في اﻷوتوكﻻف. إزالة من اﻷوتوكﻻف اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية و 3.5 الجيش الشعبي الكوري عن 40 دقيقة مكان في منطقة العمليات جراحية لتطهيرها.
    ملاحظة: من المهم للحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة.
  2. الحارة 1 لتر يعقم زجاجة المالحة في حمام مائي صغير إلى 38 درجة مئوية على الأقل 2 ساعة قبل الجراحة.
  3. قم بتوصيل أقطاب كهربائية نوع الملاقط ودواسة القدم المولد (انظر قائمة المواد). اتباع إرشادات الشركة المصنعة، مجموعة المولد لتسليم خمس نبضات 50 مللي 50 الخامس (مع فاصل زمني 950 مللي ثانية) عندما فجرها دواسة القدم. تطهير أقطاب الملاقط-نوع ومكان على تطهير المنطقة الجراحية.
  4. جعل مخروط آنف تخدير ك منشور مسبقاً32، ولكن استخدام نهاية النتريل أو إصبع قفاز مطاط لتشكيل غشاء يناسب بشكل أمن عبر فتح مخروط الآنف. قطع ثقب في الحجاب الحاجز كبيرة بما يكفي لتناسب على آنف للماوس.
  5. عميق تخدير الفئران الحوامل في E15.5 في دائرة التعريفي مليئة إيسوفلوراني (2-4%) في الأكسجين النقي التي تتدفق في 1 لتر في الدقيقة. بعد ~ 1 دقيقة، اختبار المعاكسة رايتينج (بلطف إمالة الدائرة التعريفي والتأكد من أن الماوس لم الحق نفسه). وزن الماوس لتحديد جرعات التسكين التي تديرها في وقت لاحق أثناء الجراحة.
  6. نقل الماوس إلى منطقة العمليات الجراحية وإدارة isoflurane المستنشقة (1-2 ٪) في الأكسجين النقي التي تتدفق في 1 لتر في الدقيقة عن طريق مخروط الآنف للحفاظ على الماوس في الطائرة الجراحية. استخدام الملقط لاختبار رد الفعل دواسة (قرصه في مخلب بلطف وضمان عدم عودة الماوس منعكس) للتحقق من أنيسثيتيزاتيون. رصد معدل التنفس وجهد، تبحث عن انتظام التنفس العميق، (~ 70-100 نفسا بالدقيقة)، وأن تكون الأغشية المخاطية الوردية اللون ورطبة.
  7. تطبيق ما يكفي مرهم العيون البيطرية على العينين لتغطية لهم تماما للحماية ضد تجفيف أثناء الإجراء.
  8. فليكس القرص المنشط المعدني للحقيبة مختومة مليئة بالتشبع الحل الملح (انظر قائمة المواد)، تفعيل بلورة طارد للملح. 2 مناديل مهمة طبقة واحدة على رأس الحقيبة، ووضع الماوس على الحقيبة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  9. تدليك كريم مزيل الشعر على منطقة البطن مع مسحات القطن حتى يذوب الفراء البطن (حوالي 20-40 ثانية)، ثم تمحو الفراء البطن. نظيفة بعناية من أي كريم للمخلفات ومزيل الشعر المتبقية مع 70% من الإيثانول والقطن مسحات. ضع ثني جراحية معقمة fenestrated فوق منطقة البطن.
  10. باستخدام تقنية معقمة، سحب الجلد لأعلى وبعيدا عن البطن بالملقط جرايفى، وجعل شق خط الوسط البطني ~ 2 سم على الجلد باستخدام مقص آيريس، ضمان أن لا يتم قطع العضلات الأساسية.
    ملاحظة: بديل مقبول لإجراء شق مع مقص ملقط وايريس جرايفى استخدام مشرط، كما نشرت سابقا17.
  11. العثور لينيا ألبا تصور خط الوسط البطنية المستقيمة. سحب العضلات أعلى وبعيدا عن البطن بالملقط جرايفى، وجعل آخر شق خط الوسط ~ 2 سم هناك مع مقص آيريس، تعريض تجويف البطن (الرحم شفافة والأجنة سوف تكون مرئية تحت). ضمان أن الكامنة وراء أنسجة الرحم والأمعاء لا تقطع. جعل شق فقط كبيرة بما يكفي (عادة ~ 2 سم) لسحب وفضح الرحم بشكل مريح.
    ملاحظة: بديل مقبول لإجراء شق مع مقص ملقط وايريس جرايفى استخدام مشرط، كما نشرت سابقا17.
  12. استخدام تلميح ميكروبيبيتي عقيمة 10 ميليلتر، الاستغناء عن والايبوبروفين (حله في عقيمة المالحة 0.9 في المائة) في 4 مغ/كغ في تجويف البطن للتسكين.
  13. المشبك الملقط البعوض هارتمان واحد على الحافة اليسرى من شق البطنية المستقيمة. الراحة الملقط على طبق بيتري انقلبت إلى يسار الشق، الحفاظ على الجانب الأيسر من الشق مفتوحة. المشبك الملقط البعوض هارتمان آخر على الحافة اليمنى لشق البطنية المستقيمة وتستند الملقط طبق بيتري انقلبت إلى الحق في الشق، الحفاظ على الجانب الأيمن من الشق مفتوحة. ضع الأسفنج الشاش حول منطقة الشق.
  14. استخدام الملقط الدائري (بدون مسمار حد مرفقة)، سحب في الرحم بين أي اثنين من الأجنة المجاورة دون سحق أو إصابة أي نسيج. البدء في سحب جميع الأجنة من خلال الشق، زرعها على رأس الشاش الأسفنج. تأكد عند سحب الأجنة الأخير من تجويف البطن، لا لسحب على المبايض أو عنق الرحم. بمجرد عرضه، من الضروري إبقاء الرحم رطبة مع الملحية الدافئة. يحتوي عادة على الرحم بين 5 و 8 أجنة.
    ملاحظة: من الممكن إضافة البنسلين وستربتوميسين إلى المالحة17.
  15. الاتصال معايرة ماصة للجمعية أنبوب المضخة (انظر قائمة المواد)، وحقن بالضبط 1 ميليلتر الحل الحمض النووي إعدادها في الخطوة 2 من خلال جدار الرحم إلى البطين جانبي لكل جنين. البطينات الجانبية تظهر كبقع اثنين في تيلينسيفالون الظهرية للجنين (وبقع أغمق من أنسجة telencephalon المحيطة). استخدم الإبهام والسبابة أثناء microinjection وانهانسر للتلاعب بالأجنة، كشف البطينات الجانبية والسماح للأجنة يتم دفعها بلطف ضد جدار الرحم أثناء الحقن. تأكيد نجاح الحقن عن طريق مراقبة تريبان الأزرق ملء البطين الجانبي.
  16. ضع كاثود أقطاب الملاقط من نوع (انظر قائمة المواد) في الرحم، ومباشرة فوق قشرة الآنسي ووالذيليه لاستهداف القشرة البصرية (استهداف مجالات بديلة للدماغ سيتطلب وضع قطب كهربائي مختلفة)16، 26. ضع اﻷنود في الرحم، وأدنى فقط وعرفت الرأس للجنين.
  17. وتؤكد أن لمس اﻷنود والكاثود الرحم المحيطة بالجنين في المواقع المناسبة. مع دواسة قدم، يؤدي إلى تسليم خمس نبضات 50 مللي 50 الخامس (مع فاصل زمني 950 مللي ثانية) عبر أقطاب كهربائية.
    ملاحظة: حقن، سلبا على مشحونة بالحمض النووي سوف تتحرك نحو الكاثود وستدمج في خلايا منطقة البطين الأقرب إلى الكاثود.
  18. عودة الرحم إلى تجويف البطن في نفس اتجاه وجد. استخدام المياه المالحة لتليين الرحم أثناء توجيه ذلك يدوياً والغاية بلطف، مع الحرص على عدم تشريد الأجنة من مركزها في الرحم.
  19. إغلاق عضلات البطن مع خيوط قابلة للامتصاص (انظر قائمة المواد) باستخدام غرزة توقف بسيطة، ربط ينتهي عقده بجراح. لا لا مقطع النهايات قريبة جداً من العقدة أو العقدة سوف تصبح أونفاستينيد.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان لخياطة عضلات البطن مثل أن يتم إغلاق حواف الجرح تماما إغلاق، ولكن دون أن تسبب تبييض للعضلات. يجب أن تكون عقده ضيق حيث أنها لا يمكن أن أونفاستينيد.
  20. إغلاق طبقة الجلد بخيوط قابلة للامتصاص (غرزة توقف بسيطة، الجراح في عقده، كما هو الحال في الخطوة 4.19). تنطبق على كمية صغيرة من الأنسجة لاصقة لختم الجرح. تطبيق لاصق الأنسجة على عقده لمنع أونفاستينينج. استخدام ميكروبيبيتي لإزالة أي مادة لاصقة الأنسجة المحيطة بالجرح الذي يمكن أن يستنشق قبل ميكروبيبيتي.
  21. انخفاض مستويات إيسوفلوراني إلى 0.5-1.5%. بمجرد لاصق الأنسجة الجاف (اختبار بلمس قفاز بمادة لاصقة) وإزالة من isoflurane والسماح للإناث لاستعادة وحدة في قفص حارة. إدارة البوبرينورفين إينترابيريتونيلي في 0.03 ملغ/كغ باستخدام حقنه 1 مل مع 26 ز، ½ "إبرة.
  22. مواصلة رصد الماوس حتى الماوس هو تعافي تماما ويتصرفون بشكل طبيعي (أي الاستمالة أو استكشاف القفص، الأكل أو الشرب). بمجرد استرداد، مكان الإناث مرة أخرى في قفص مع الذكور.
    ملاحظة: إذا ما اتبعت جميع الخطوات، الماوس عادة تستعيد الوعي داخل 2 دقيقة والبدء فورا في التحرك حول القفص، لا دلائل على عدم الراحة.
  23. إذا كان الماوس يسلك علامات عدم الراحة (مثل متحدب الموقف، وافرازات البورفيرين)33، إدارة والايبوبروفين في 0.1 مغ/مل في إمدادات المياه. في حالة وجود العديد من الدلائل من عدم الراحة، أو إذا الانزعاج استمرت لأكثر من 4 ح رغم الإدارة والايبوبروفين، euthanize فورا الماوس بالدولة القائمة بحقنه قاتلة داخل الكيتامين (240 ملغ/كغ)-إكسيلازيني (48 ملغ/كغ)- كوكتيل acepromazine (1.85 مغ/كغ) باستخدام حقنه 1 مل مع 26 ز، ½ "إبرة، واتبع بشكل ثانوي معتمدة من القتل الرحيم33.
  24. زيادة بقاء الأجنة اليكتروبوراتيد بعد الولادة، تبقى القفص في هدوء عقد الغرفة، خال من الضوضاء والاهتزازات. إثراء البيئة مع كوخاً البلاستيك ومواد التعشيش والمكملات الغذائية مثل عباد الشمس (انظر قائمة المواد). لا تتحرك أو اضطراب القفص، لا سيما خلال 3 أيام الأولى بعد الولادة.

5-إعداد نسيجية للفحص المجهري الأسفار

ملاحظة: هذا البروتوكول علم الأنسجة هو الأمثل لإعداد الأنسجة من الحيوانات أقدم من يوم الولادة (ع) 13 التي كانت اليكتروبوراتيد في الرحم. إعداد الأنسجة من الحيوانات بعد الولادة الأصغر سنا (P0-P13)، يوصي باتباع جميع الخطوات (بما في ذلك نضح ترانسكارديال)، على الرغم من أن المخ ينبغي أن تكون جزءا لا يتجزأ من أجار قبل إعداد المقاطع (الخطوة 5، 9). حتى يمكن إعداد الأنسجة من الأجنة في غضون 1-2 أيام بعد انهانسر، استخدام أساليب الموصوفة سابقا18،20.

  1. إعداد حل بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين).
    ملاحظة: من الضروري إعداد جديدة منهاج عمل بيجين وخلال يوم واحد للتجربة.
    تنبيه: بارافورمالدهيد سامة وينبغي التعامل معها في غطاء دخان مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    1. جعل مل 50% 4 منهاج عمل بيجين وتسخين المياه مل 40 إلى 60 درجة مئوية. إضافة 2 ز منهاج عمل بيجين أثناء التحريك بقضيب الزجاج قضيب أو إثارة. إضافة 10 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم 10 م كل 2 دقيقة حتى يذوب منهاج عمل بيجين.
    2. إضافة 5 مل من 10 x PBS وإيجاد حل لوحدة تخزين نهائي من 50 مل مع الماء.
    3. بعد الحل إلى 50 مل، ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 حسب الحاجة بحل HCl. السماح م 10 لتبريد وتخزين في 4 درجات مئوية.
  2. Euthanize الماوس مع حقن داخل الكيتامين (240 ملغ/كغ)-إكسيلازيني (48 ملغ/كغ)-استخدام المحاقن 1 مل مع 26 ز، ½ "إبرة acepromazine (1.85 مغ/كغ) كوكتيل. ترانسكارديالي نتخلل PBS المثلج x 1 مل 10 أو 20، تليها 25 أو 40 مل الطازجة، والمثلج 4% منهاج العمل17. استخدام وحدات التخزين السفلي لوحدات التخزين أعلى للفئران كبار وصغار الفئران (P0-P13) بعد الولادة (P14 وأعلاه).
  3. فورا بعد نضح، قطع رأس الذبيحة الفأر بين العظام القفوية وفقرة C1 مع مقص كبير وقشر بعيداً وتجاهل معظم الجلد المحيطة بالجمجمة باستخدام مقص آيريس، لا سيما الجلد الأمامية المحيطة والجداري قذالي العظام. الاحتفاظ بالجمجمة والدماغ سليمة.
  4. وضع الجمجمة والدماغ في 10 مل 4% منهاج العمل في أنبوب 50 مل مخروطية عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية ما بعد إصلاح الأنسجة. ثم قم بإضافة 30 مل س 1 برنامج تلفزيوني للأنبوبة المخروطية تمييع الحل إلى 1% منهاج عمل بيجين للتخزين في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدام أنبوب مخروطي منفصل لكل من الجمجمة والدماغ لفترة ما بعد أن تكون ثابتة. عدم احتضان الدماغ الذي سيبدأ في 1% منهاج العمل لمدة تزيد على أسبوعين، أو الأسفار تتلاشى.
  5. مكان الدماغ والجمجمة على سطح مستو مع واحد-رقائق المهمة مناديل مبلل مع 1 x PBS. استخدام زوج من ملاقط (انظر قائمة المواد) لإزالة أي المتبقية من الجلد أو الأغشية المحيطة بالجمجمة.
  6. استخدام الملقط، قم أولاً بإزالة عظم قذالي، ثم بعناية إزالة العظام الجداري، تتحرك الملاقط وبعيدا من سطح الدماغ. بعناية إزالة أي السحايا لمنع الأضرار بالقشرة.
  7. آسفين ظهر الملاقط تحت على طول الجمجمة بقطع أي أعصاب المخ، وإزالة الدماغ.
  8. لصغار العقول (P0-P13) بعد الولادة
    1. جعل 25 مل أجار 4% بتدفئة PBS 1 x 25 مل إلى 80 درجة مئوية. إثارة وحل أجار ز 1 مع شريط التحريك أو قضيب زجاج).
    2. بارد الحل إلى 35 درجة مئوية بينما تستمر في إثارة. وضع الدماغ في حاوية صغيرة (مثل الحد الأقصى لأنبوب مخروطي 50 مل)، ومن أجل حل أجار على الدماغ. تسمح أجار تتصلب.
  9. جعل قطع الاكليلية يدوياً باستخدام شفرة حلاقة حافة واحدة من خلال الدماغ، وحوالي 0.5 مم من روسترال إلى بريجما. جعل آخر قطع الاكليلية من خلال الدماغ حوالي 0.5 مم والذيلية للقشرة البصرية. مكان تجمع غراء cyanoacrylate مع نفس القطر كنهاية روسترال في الدماغ في مركز القرص العينة مبضع تهتز. مكان نهاية روسترال في المخ على رأس مجموعة الغراء، ضمان أن كامل سطح روسترال الأنسجة منضماً إلى القرص العينة باستخدام الغراء.
  10. جبل علبة المخزن المؤقت على تهتز مبضع وآمنة مع رافعة لقط المدمج. إدراج شفرة سكين حامل، وجبل حامل سكين على تهتز مبضع مع المسمار لقط المدمج. تأمين القرص العينة مع الدماغ على علبة المخزن المؤقت باستخدام جهاز لقط المضمنة. تعيين سرعة الإعداد إلى 5.70 (= 0.285 مم/s)، وإعداد التردد إلى 5.33 (53.3 هرتز).
  11. ملء الدائرة على مستوى الدماغ مع برنامج تلفزيوني 1 x وأقل بليد في برنامج تلفزيوني. البدء باتخاذ 100 ميكرومتر المقاطع الاكليلية من خلال الأنسجة.
  12. إذا كان لا تحتاج إلى مزيد من المعالجة، مثل 4 ' أو تلطيخ النووية 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو إيمونوهيستوتشيميستري.
    1. استخدام الرسام مقلوب ما يرام لنقل المقاطع مباشرة من مبضع الاهتزاز إلى شريحة مجهر، تركيب أبواب 4-6 على كل شريحة.
    2. السماح بالمقاطع لتجف بفتل الحل بعيداً مع الرسام مقلوب غرامة، مثل أن شرائح المخ لم يعد الانجراف على الشرائح.
    3. ثم، ضع قطره واحدة من مونتانت (انظر قائمة المواد) في كل قسم على الشريحة.
    4. بلطف تكمن ساترة 24 x 50 مم على أعلى، وكفالة 1) أي فقاعات الهواء لا تقم بتحريك النموذج في الفروع، 2) الفروع، ومونتانت 3) يغطي بالكامل منطقة بين الشرائح وساترة. السماح مونتانت علاج ح 24-48 على الأقل.
  13. لوصمة عار الأنوية مع DAPI للفحص النسيجي من عن القشرية
    1. استخدام الرسام مقلوب ما يرام لنقل كل قسم في حل (انظر قائمة المواد) المخفف تحتوي على 10 ميكروغرام/مل DAPI في برنامج تلفزيوني 1 x من الأسهم الحل (20 ملغ/مل DAPI في الماء).
    2. احتضان في حل DAPI لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدام الرسام مقلوب ما يرام إلى نقل قسم من حل DAPI إلى 1 x PBS واحتضان في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل القسم الثاني أكثر من مرة لبرنامج تلفزيوني جديد x 1 لكل 5 دقائق. ثم استخدام فرشاة الطلاء غرامة مقلوب، نقل المقطع إلى شريحة مجهر، اتبع الخطوات 5.11.2-5.11.4، والشروع في الخطوة 5، 13.
  14. الحرارة طبق بيتري زجاج الذي يتضمن فالاب (أجزاء متساوية الفازلين واللانولين والبارافين) على لوحة الساخن في تحديد درجة حرارة منخفضة حتى ذابت تماما. يتعرض ختم حواف شرائح بالفرشاة على فالاب ذاب.
  15. لفحص fluorescence في الأنسجة، استخدام الخفيفة الميكروسكوب أو المجهر [كنفوكل] (انظر قائمة المواد) وتعيين عامل تصفية كافية للعرض في فلوروفوري (مثلاً DAPI: الإثارة 325-375 نيوتن متر، وانبعاث 435-485 نانومتر؛ التجارة والنقل: الإثارة 450-490 نانومتر، وانبعاث 500-550 نيوتن متر)17. يمكن أن تؤخذ الصور [كنفوكل] مع المنخفضة (4 X، الفتحة العددية، غ = 0.20)، متوسطة-(20 س، غ = 0.75)، وعالية الطاقة (60 س، غ = 1.40) الأهداف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الواحد بناء التجارة والنقل. لجنة المساواة العرقية (انظر قائمة المواد) كان اليكتروبوراتيد في E15.5 وتصور في P14. اعتماداً على تركيز بنية وحجم الحقن، نتيجة متفرق أو كثيفة ويمكن الحصول على22،26. على سبيل المثال، حقن ميليلتر 1 2 ملغ/مل التجارة والنقل. نتائج لجنة المساواة العرقية إلى توزيع متفرق للخلايا المسماة، البعض منها يمكن أن يكون مشرقاً (الشكل 1A)، وطبقة محلية في الثاني/الثالث (ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم لك هنا، مزيج انهانسر في الرحم مع recombinase لجنة المساواة العرقية في الفئران فلوكسيد لتوليد أنسجة المخ الفسيفساء. ميزة هذا النهج هو أن خط ماوس جديدة لا تحتاج إلى إنشاء كل مرة يتم فيها استهداف نوع فرعي خلوية مختلفة: يمكن استخدامها في الرحم انهانسر لاستهداف ضادات الخلايا العصبية، والخلايا العصبية المثبطة، أو إطلاق اعتماداً على الوقت وموقع انهانسر16،15،،من1719،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدعم السخي "جيمس ماديسون جامعة قسم علم الأحياء"، و "جيمس ماديسون جامعة الخفيفة الميكروسكوب" و "مرفق التصوير". الدكتور مارك L. جابرييل لمن المفيد تقديم المشورة بشأن إعداد الشباب الأنسجة بعد الولادة، والدكتور جاستن جورج براون وشنها لام كوري للتنسيق سخية من الفضاء والمواد الجراحية. بتمويل هذا البحث في جزء من "منحة بحثية تعاونية" 4-خامسا، شراكة تعاونية للمضي قدما في كومنولث فرجينيا (G.S.V.)، ومن "فيرجينيا أكاديمية للعلوم الصغيرة المشروع منحة بحثية" (G.S.V.). تم دعما سخيا من هبات "بيتي جو المحبة بتلر" 58 لمنحه البحوث الجامعية (ل K.M.B.)، ومنحة أبحاث صيف فاريل (إلى K.M.B.)، وجيمس ماديسون الجامعة الثانية القرن منحة دراسية (ل K.M.B.)، جيمس جامعة ماديسون الذكرى المئوية للمنح الدراسية (ل C.J.H.) وعلى منحة دراسية جامعة جيمس ماديسون لوسي روبنسون بحث 30 تذكارية (إلى Z.L.H.)، وكلية جامعة جيمس ماديسون للعلوم والرياضيات كلية منحة المساعدة (إلى G.S.V.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C57BL / 6J الفئرانمختبر جاكسون# 000664انظر "1. إعداد الماوس" (الخطوة 1.1 ، "الفئران من النوع البري") GFP
. Cre متجه فارغAddGene# 20781انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.1 "بناء الحمض النووي الفردي الذي يرمز ل Cre recombinase بالإضافة إلى علامة الفلورسنت"). الحزب الجمهوري الأجنبي. كان ناقلات Cre الفارغة هدية من تايلر جاكس.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (المستعر الأعظم)AddGene# 69138انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.1 نظام "المستعر الأعظم") و http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) كانت هدية من Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (المستعر الأعظم)AddGene# 69136انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.1 نظام "المستعر الأعظم") و http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (المستعر الأعظم) كانت هدية من تاكوجي إيواساتو.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (المستعر الأعظم)AddGene# 85006انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.1 نظام "المستعر الأعظم") و http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) كانت هدية من Takuji Iwasato.
مجموعة EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen# 12362انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.3 "مجموعة تنقية البلازميد الخالية من السموم الداخلية")
مسحوق Trypan Blue ، درجة الكاشفالحيوي SigmaT6146-5Gانظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "التريبان الأزرق")
كلوريد الصوديوم ، ACS ، 2.5 كجمVWRBDH9286-2.5 كجمانظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "كلوريد الصوديوم")
كلوريد البوتاسيوم ، ACS ، 500 جمVWR# 97061-566انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "KCl")
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ، ReagentPlus ، 100 جمSigma-AldrichS0876-100Gانظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "Na2< / sub>HPO4< / sub>")
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، ReagentPlus ، 100 جمSigma-AldrichP5379-100Gانظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "KH2PO4")
حمض الهيدروكلوريك ، كاشف ACS ، 500 ملFisher ScientificA144-500انظر "2. إعداد الحمض النووي" (الخطوة 2.5 "HCl")
P-97 أداة مجتذبالماصاتالدقيقة P-97انظر "3. إعداد الماصة" (الخطوة 3.1 "مجتذب الشعيرات الدموية الزجاجية") خيوط
بعرض 3.0 ممأداة Sutter FT330Bانظر "3. إعداد الماصة" (الخطوة 3.1 "مجتذب الشعيرات الدموية الزجاجية")
الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار ، 4 "، 1 / 0.75 OD / IDWorld Precision InstrumentsTW100-4انظر "3. إعداد الماصة" (الخطوة 3.1.1 "الشعيرات الدموية الزجاجية")
مناديل مبللة ذات تقنية ناعمة أحادية الطبقة ، 4.5 بوصةPhenixLW-8148انظر "3. إعداد الماصة" (الخطوة 3.2.1 "مسح المهام أحادية الطبقة")؛ يمكن استخدام مناديل أخرى أحادية الطبقة (مثل Kimwipes).
ملقط Graefe ، 7 سم ، مستقيم ، 0.7 مم 1x2 أدوات الدقة العالمية للأسنان# 14140انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "ملقط Graefe")مقص
القزحية ، 11.5 سم ، مستقيم ، 12 عبوةالأدوات الدقيقة العالمية# 503708-12انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "مقص القزحية")ملقط
البعوض هارتمان ، 9 سم ، مستقيم ، 12 عبوةمن أدوات الدقة العالمية# 503728-12انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "ملقط البعوض هارتمان")
الإسفنج غير المنسوج للأغراض العامة ، 2 × 2 بوصة ، 4 طبقاتMedrepexpress# 2204-cانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "إسفنج الشاش غير المنسوج")
ملقط مائل بحلقة ، 10 سم ، مستقيم ، 2.2 مم IDWorld PrecisionInstruments # 503203انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "ملقط الرأس الحلقي")
أطباق بيركس بتري كاملة ، OD & H 100 مم & مرات ؛ 20 ممسيجما ألدريتشCLS3160102-12EAانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "أطباق بتري")صينية
أدوات من النوع المسطح ، من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 13-5 / 8 بوصة × 9-3 / 4 بوصة × 5/8 بوصةأمازونB007SHGAHAانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.1 "صينية الفولاذ المقاوم للصدأ") ملاقط
بلاتينية ، 5 ممBTX# 45-0489انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.3 و 4.16 "أقطاب كهربائية من نوع الملقط")
ECM 830 Foot PedalBTX# 45-0211انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم "(الخطوة 4.3 و 4.17 "دواسة القدم") ECM
830 GeneratorBTX# 45-0052انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.3 "المولد")
نظام تخدير الأيزوفلوران الحيواني الفردي مع صندوق الحثالصغير جهاز هارفارد# 72-6468انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.4 و 4.6 "مخروط الأنف" ، الخطوة 4.4 "غرفة الحث")
مرهم العيونHanna Pharmaceutical Supply Co# 0536108691انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.7 "مرهم العيون البيطري")جل
الفضاء (AIMS)VWR# 95059-640انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.8 "كيس محكم الغلق مملوء بمحلول ملح مفرط التشبع")كريم
جل مزيل الشعر ، تركيبةحساسة Veet# 062200809951انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.9 "كريم إزالة الشعر")
10ul بداية طرف الاحتفاظ المنخفض (960 طرف / عبوة) منتجاتأبحاث فينيكسTSP-10LKITانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.12 "معقمة 10 & micro; طرف الماصة الدقيقة L ")مجموعات
أنابيب الشفاط للماصات الشعرية الدقيقة المعايرةSigma-AldrichA5177انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم "(الخطوة 4.15 "مجموعة أنبوب الشفاط")
خياطة قابلة للامتصاص مضفرة ، 4-0 ، إبرة NFS-2 (FS-2) ، 27 "MedrepexpressMV-J397انظر "4. في التثقيب الكهربائي في الرحم" (الخطوة 4.19 "الغرز القابلة للامتصاص")
" LiquiVet رابيد " لاصق الأنسجةMedrepexpressVG3انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.20 "لاصق الأنسجة")
المحاقن تحت الجلد ، مادة البولي بروبيلين ، طرف قفل لور ، سعة 1.0 ملSigma-AldrichZ551546-100EAانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.21 "حقنة 1 مل")مقياس
إبر حقنة BD Precisionglide 26 ، L 1/2 بوصة.سيجما ألدريتشZ192392-100EAانظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.21 "26G ، ½ ” إبرة ")
Nestlets التعشيش الموادAncareNES3600انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم" (الخطوة 4.24 "مواد التعشيش")
بذور عباد الشمس ، الزيت الأسود ، المعقمBio-ServS5137انظر "4. في التثقيب الكهربائي للرحم "(الخطوة 4.24 "بذور عباد الشمس")
بارافورمالدهيد ، 97٪Alfa AesarA11313انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.1.1 "PFA")
ملاقط اقتصادية # 3 ، 11 سم ، 0.2 × 0.4 مم أطرافالدقةالعالمية # 501976انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.5 "ملاقط")
مسحوق أجارAlfa Aesar# 10752انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.8.1 "أجار")
شفرات حلاقة أحادية الحافة ، # 9 شفرةStanley Tools# 11-515انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.9 "شفرة الحلاقة أحادية الحافة")
قرص العينة S D 50 ممLeica# 14046327404انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.9 "قرص عينة ميكروتوم اهتزازي")تجميع
صينية العازلة SLeica# 1404630132انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.10 "علبة المخزن المؤقت")
VT1000 S VibratomeLeica# 14047235612انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.10 "الميكروتوم الاهتزازي")
شفرات الحلاقة ذات الحوافالمزدوجة PersonnaBP9020انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.10 "الشفرة")
حامل السكين SLeica# 14046230131انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.10 "حامل السكين")
مجموعة فرش مستديرة بمقبض قصير من Studio Elementsمن أمازونB0089KU6XEانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.12.1 "فرشاة الرسم ذات الرؤوس الدقيقة")
Superfrost Plus Slidesخدمات المجهر الإلكتروني# 71869-11انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.12.1 "شريحة المجهر")ProLong
Diamond Antifade Mountant ، 10 ملThermofisherP36970انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.12.3-5.12.4 "mountant")غطاء
زجاجي ، 24 × 50 مم ، رقم 1Phenix Research ProductsMS1415-10انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.12.4 "غطاء")
4 & prime ؛ 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma-AldrichD9542انظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.13.1 "DAPI")
مجهر عمودي للمرحلة الثابتةأوليمبوسBX51WIانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.15 "المجهر الضوئي")
مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزرنيكونTE2000/C2siانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.15 "المجهر متحد البؤر")
4x الهدف ، NA = 0.20خطة نيكون CFI Apo Lambda 4Xانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.15 "هدف الطاقة المنخفضة")
هدف 20x ، NA = 0.75خطة نيكون CFI Apo Lambda 20Xانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.15 "هدف الطاقة المتوسطة")
الهدف 60x ، NA = 1.40نيكون CFI Plan Apo VC 60X النفطانظر "5. علم الأنسجة" (الخطوة 5.15 "هدف عالي الطاقة")
صغيرة من أدوات

المراجع

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة