ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
محواري النقل والنقل إينترافلاجيلار (ايفت) ضرورية ل morphogenesis إكسون واهداب والدالة. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين من المحركات الجزيئية التي تنظم أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء، على التوالي. هذه المحركات تستخدم شبكات microtubule كالقضبان. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج قوية لدراسة النقل محواري وايفت في فيفو. هنا، أود أن أصف بروتوكول لمراقبة النقل محواري وايفت في المعيشة C. ايليجانس. يمكن تصور البضائع المشحونة بعلامات البضائع البروتينات باستخدام البروتينات الفلورية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). C. ايليجانس يتسم بالشفافية ويمكن التعبير عن البروتينات البضائع معلم بروتينات فلورية خضراء في خلايا معينة تحت المروجين خلية على حدة. يمكن أن تكون ثابتة الديدان الحية التي ميكروبيدس على 10% [اغروس] هلام دون قتل أو أنيسثيتيزينج الديدان. في ظل هذه الظروف، حركة نقل البضائع مباشرة يلاحظ في محاور عصبية واهداب المعيشة C. ايليجانس دون تشريح. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة أي جزيء البضائع في أي من الخلايا عن طريق تعديل بروتينات المستهدفة و/أو الخلايا يتم التعبير عنها في. هي المصانة البروتينات الأساسية مثل المحركات الجزيئية ومحول البروتينات التي تشارك في نقل محواري وايفت في C. ايليجانس. بالمقارنة مع غيرها من الكائنات نموذج، يمكن الحصول على طفرات وصيانتها بسهولة أكبر في C. ايليجانس. يمكن دمج هذا الأسلوب مع مختلف C. ايليجانس طفرات لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت.
المقدمة
تصوير الخلية الحية أداة أساسية لتحليل النقل داخل الخلايا. في بيولوجيا الخلايا العصبية، تحليلات للنقل محواري مع تصوير الخلية الحية ضرورية لفهم العصبية الدالة و morphogenesis1. عيوب في النقل محواري تكمن وراء عدة اضطرابات الأعصاب2. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين القيام بالنقل محواري أنتيروجراديلي وريتروجراديلي، على التوالي1،2.
أهداب هي آخر حجرة الخلوية التي هي الشبكة ميكروتوبولي وآلية الاتجار المتقدمة جداً3. يتم ترجمة البروتين التوليف إليه لا بأهداب، مما يعني أنه يتعين نقل البروتينات الهدبية من السيتوبلازم إلى....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-"إعداد نموذج"
سلالة- توليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس الاهتمام باستخدام منهجيات المعدلة وراثيا 18. وبدلاً من ذلك، الحصول على سلالات ملائمة من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك). لتصور النقل محواري السلائف حويصلة متشابك، استخدم خط المعدلة وراثيا wyIs251 [بميج-13::gfp::rab-3] 7. لمراقبة ايفت، الحصول على mnIs17 [osm-6::gfp] خط المعدلة وراثيا 19. وتستخدم هذه السلالات في هذا البروتوكول-
ملاحظة: أما الصفيف اكستراتشروموسومال، ودمج الجينوم، أو حتى بروتينات فلورية خضراء تدق في الأشغال. لتقليل الإشارات الخلفية، استخدم المروجين خلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
النقل محواري في الخلايا العصبية DA9
استخدام خط wyIs251 ، أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء محواري GFP::RAB-3 يمكن في نفس الوقت تسجيل في العصبون DA9. متوسط سرعة anterograde والنقل إلى الوراء في إكسون الظهرية الدانية من العصبية DA9 هو حوالي 1.8 و 2.6 ميكرومتر/s، على التوالي22. عدد حويصلات تتحرك عن 0.03 و 0.018 الواحدة ميكرومترات إكسون كل ثانية. وهكذا، لمراقبة s 30 من 10 ميكرومترات من إكسون DA9 باستخدام عدسة 100 x، أحد إيجاد حوالي 9 و 5 تتحرك .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التقادم فيما يتعلق بالأساليب القائمة
الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لمراقبة الأحداث سريعة مثل النقل محواري وايفت. وهكذا، الأولوية لتجميد أكثر من حضانة أطول. بينما تمكنا من مراقبة الاتجار الأحداث لمدة 20 دقيقة على الأقل دون اضطراب كبير، هذا الأسلوب قد لا تكون دائماً مناسبة لمراقبة الأحداث بطيئة تتطلب الملاحظات أطول، مثل إكسون استطالة والهجرة الخلية. ملاحظات أطول، يحتاج المرء تحسين الظروف بتخفيض النسبة المئوية [اغروس] (زيادة الماء لتجنب تجفيف وتقليل الضغوط التي يحتمل أن يسببأيضرر). وبدلاً من ذل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
شكر وتقدير
عميق شكرا مقدم البلاغ الدكتور أساكو Sugimoto (جامعة توهوكو) لمناقشة مفيدة لها. وكان wyIs251 هدية سخية من الدكتورة كانغ شين (جامعة ستانفورد). قدم mnIs17 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). أيد هذا العمل دايتشي سانكيو مؤسسة، مؤسسة علوم المخ ومؤسسة نايتو ومنحة كاكينهي JSPS #17 ح 05010 و #16 ح 06536.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| زجاج منزلق (76 × 26 مم) | ماتسونامي | S1111 | |
| غطاء زجاجي (22 × 40 مم) | ماتسونامي | C024401 | |
| أغاروز | واكو | 318-01195 | |
| ميكروبيدات بوليستيل 0.1 ميكرون | Polysciences | # 00876 | |
| كتلة حرارية | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| المجهر | أوليمبوس | IX-71 | مجهر واسع |
| الغزل قرص الماسح | الضوئي يوكوجاوا | CSU-X1 | الغزل قرص الماسح الضوئي متحد البؤر |
| كاميرا CCD الرقمية | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 كاميرا CCD degital |
| عدسة موضوعية (x100 ، NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur (5 بوصة) أنبوب | زجاجي IWAKI | IK-PAS-5P | |
| (قطر 1.5 سم × 10.5 سم) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251< / em> | مختبر كانغ شين | N / A | |
| OTL11: mnIs17< / em> | المرجع 27 ، 29 | N / A | SP2101 تم عكسه مع النوع البري لمدة 6 مرات |
| مجهر ستيريو | كارل زايس | 435064-9000-000 | STEMI 508 ؛ |
| وحدة إضاءة المرآة | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| سلك بلاتيني (0.2 مم) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| طبق بلاستيكي 60 مم | Falcon | # 351007 | |
| فيجي | N / A | N / A | |
| وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ؛ | 1.7٪ (وزن / حجم) الاغاروز ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.25٪ (وزن / حجم) بيبتون ، 1 ملي كالسيطريد الكالسيوم 2 ، 5 مجم / مل كوليسترول ، 25 ملي كيلو ثاني 2PO4 ، 1 ملي ملي مجم SO4 ؛ |
المراجع
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N En....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
