يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تشريح وثقافة Explant موريني Allantois للتحليل في المختبر للحجز الانتويك

7.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56712

⸱

يناير 13, 2018

 ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, 2Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

في هذه المقالة

ملخص

يصف لنا فحص في المختبر لنموذج مرفق تشوريوالانتويك، الخطوة الأولى في تكوين المشيمة. البروتوكول يوضح ثقافة تشريح و explant مورين اللانتويديس على إنتغرين α4β1 المعطل تداولها. يتم تقييم مرفق allantois مجهريا في نقاط زمنية محددة سلفا.

الملخص

المشيمة أمر ضروري لنمو وتطور أجنة الثدييات. ولهذا السبب، العديد من التعديلات الوراثية والشتائم البيئية كما يحتمل أن تخل التنمية المشيمة أو وظيفة يمكن أن يسبب فقدان الحمل المبكر في الفئران والبشر. ومع ذلك، تفتقر إلى فحوصات بسيطة في المختبر الشاشة للآثار المحتملة على تكوين المشيمة. هنا، نحن نركز على النمذجة الخطوة الأولى والحاسمة في تكوين المشيمة، والذي يتألف من إرفاق اللانتويس للمشيمة. يصف لنا طريقة لتقييم سرعة إلحاق explants الانتويك في إنتغرين α4β1 المعطل تداولها، هو بمثابة ركيزة كوريو mimetic. ويمكن هذا النهج في المختبر تقييم نوعي للمرفق وينتشر سلوك explants allantois متعددة في نقاط زمنية مختلفة على التوالي. وقد يمكن استخدام البروتوكول للتحقيق في تأثير الطفرات الماوس المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة التي تم ربطها إلى مضاعفات الحمل أو فقدان الجنين على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.

المقدمة

المشيمة أمر لا غنى عنه للنمو الجنينية والتنمية في بيئة الرحم. وهو يشكل واجهة للأكسجين المستقلب وتبادل المغذيات بين الجنين والأم الدورة الدموية، وأيضا وظائف كجهاز الغدد الصماء والمناعية. أي إهانة الذاتية أو الخارجية التي يعوق التنمية المشيمة يؤدي إلى تأخر النمو داخل الرحم، وفقدان الجنين، أو مضاعفات الحمل، في الفئران والبشر1. في حين لا يزال عدد الطفرات الماوس المستهدفة التي تسبب فسيولوجيا المشيمة غير طبيعي لزيادة2، مع الأنماط الجينية 219 المدرجة حاليا على الموقع الشبكي للمعلوماتية الجينوم الماوس (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/ MP:0010038)، العديد من هذه تعمل ليست مفهومة جيدا من وجهة نظر آليا. بالإضافة إلى التعديلات الوراثية، المخدرات جزيء صغير، والأجسام المضادة، السموم، مسببات الأمراض، والايضات الزائدة، أو مختلف العوامل البيئية قد تؤثر على وضع المشيمة والدالة3،،من45 , 6 , 7-بعد، بسيطة في المختبر فحوصات أن نموذج الخطوات الحاسمة في تطور المشيمة شحيحة.

التنمية المشيمية مورين هو بدأت في وقت مبكر ميدجيستيشن، عندما اللانتويس (سلف الإنمائية الحبل السري) ينبثق من نهاية الخلفي للجنين برعم أن ينمو نحو المشيمة8. التوسط تشوريواديسيفي الخلايا في الطبقة الخارجية من المهد الانتويك المرفق ونشر اللانتويس على سطح المشيمة (تشوريوالانتويك "الانصهار"). يطوي المشيمة فيما بعد إلى الزوائد التي ينمو المفرج اللانتويس شكل المتاهة، الطبقة المشيمية الداخلية حيث يتم تبادل المواد الغذائية والأكسجين بين دم الأم عن كثب محاذياً الكبدية والأوعية الجنينية9 ،10.

إرفاق اللانتويس للمشيمة هو الخطوة الأولى والحاسمة في تشكيل المتاهة، والعيوب في هذه العملية من بين الأسباب الأكثر شيوعاً للفتك الجنينية في ميدجيستيشن1. على الرغم من أن عددا من طفرات الماوس قد وصف مرفق تشوريوالانتويك فشل تحدث10، حيث يسرد قاعدة يتجاوزون حاليا 108 طفرات الماوس التي تتميز بها الشاذ الانصهار تشوريوالانتويك (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824)، التفاعل بين الخلايا بين الخلية والأوعية الدموية التصاق جزيء-1 (VCAM-1، أعرب عن ميسوديرم الانتويك) وانتغرين α4β1 (المعبر عنها في mesothelium المشيمة، المستمدة من اكسترامبريونيك mesoderm) يبدو أنه لا غنى عنه للحجز تشوريوالانتويك والانصهار11،،من1213. المناعي تلطيخ جبل كل البرية من نوع الأجنة قد أظهرت أعرب VCAM-1 داخل ثلثي القاصي من ساق الانتويك في اليوم تقريبا الجنينية (ه) 7.513 (المرحلة سميط 1-4)، وأن التعبير عن ما زال مرتفعا أثناء الحجز تشوريوالانتويك-والانصهار11،12. عادة يتم الكشف عن فشل مرفق الانتويك للمشيمة بتحاليل نسيجية من براعم الرحم. ومع ذلك، أحجام allantois متغير فسيولوجيا عاليا في بين وحتى داخل ليتر من نفس المرحلة الإنمائية14، وفقط إرفاق allantois للمشيمة عندما قد بلغ حجم كافية لجعل الاتصال الجسدي. يعكس هذا التغير الطبيعي، مرفق تشوريوالانتويك يأخذ مكان في وقت ما بين ~ ه 8.0 و E 9.0 في الرحم، وتقييم موثوق بها إحصائيا لهذه العملية عن طريق الأنسجة فتعتمد على تحليل عدد كبير من كونسيبتوسيس للحصول على عينات كافية في المرحلة التنموية المناسبة.

هنا، يمكننا وصف أسلوب تقييم مرفق الانتويك خارج الرحم أقل اعتماداً على حجم اللانتويس. نظهر تشريح الأجنة الماوس وما اللانتويديس من يشكل الفئران الحوامل ~ 8 أيام ما بعد كويتوم (dpc؛ dpc 0.5 يعين الكشف عن المكونات المهبلي)، وثقافة اللاحقة من اللانتويس اكسبلانتس في α4β1 المعطل تداولها إينتيجرينس. هذا الأسلوب يتيح إجراء تقييم سريع الفنية المرفق وينتشر سلوك متعددة allantois explants بالتوازي وعند نقاط زمنية متتالية مختلفة. يمكن استخدام البروتوكول إلى الشاشة لآثار الطفرات المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأقر تربية الماوس اونترفرانكين ريجيرونج، وأجريت جميع التحاليل طبقاً للقوانين المعمول بها في كل من ألمانيا والاتحاد الأوروبي، والأنظمة المتعلقة برعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1-طلاء Microtiter لوحات مع إنتغرين α4β1 للثقافة Explant Allantois الرحم السابقين

  1. إعادة تشكيل إنتغرين α4β1 مورين المجففة بالتبريد في 200 ميكروغرام/مل في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). تمييع لتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل في حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني. ماصة 20 ميليلتر/بئر الحل إنتغرين α4β1 المخفف إلى العدد المطلوب من الآبار للوحة ميكروتيتير (allantois 1/جيد).
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء عند طلاء آبار لوحة ميكروتيتير.
  2. احتضان لوحات ميكروتيتير لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية بوضعها في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد.
  3. عناية نضح المادة طافية مع ماصة. استخدام الشفط لطيف وانحدر اللوحة تجنب لمس أسفل جيدا مع طرف ماصة. غسل الآبار مرتين بإضافة 50 ميليلتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) الثقافة المتوسطة مثل النسر المتوسطة تعديل (دميم 's دولبيكو)، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
  4. الخطوة الحاسمة: كتلة مواقع الربط مجاناً عن طريق إضافة من 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) 50 ميليلتر/جيدا/دميم واحتضانها ل ≥ 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية عن طريق وضع لوحات microtiter في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد.
    ملاحظة: يمكنك إرفاق Allantois explants الأسطح المختلفة حضور المصل. ولذلك، يتحتم على منع المواقع غير محددة ملزمة، بعد طلاء explant الآبار مع إنتغرين، وقبل إضافة allantois تشريح للثقافة في المحتوية على مصل المتوسطة (راجع الخطوة 4، 4).
  5. إبقاء الآبار المغلفة في عرقلة الحل في 37 درجة مئوية حتى حاجة في الخطوة 4، 4.

2-الرحم تسلخ من ماوس حوامل في Dpc 8

ملاحظة: تقليل معدلات الحمل إيجابية كاذبة بالوزن مكسب التمييز15.

  1. التضحية الماوس بخلع عنق الرحم. تطهير المعطف في منطقة البطن برش عليه مع الإيثانول 70% (v/v).
    ملاحظة: ارتداء قفازات عند التعامل مع الفئران. القتل الرحيم بخلع عنق الرحم دون المسكنات يمنع التلوث الكيميائي allantois، التي قد تتداخل مع مرفق اللانتويس.
  2. فتح الجلد البطن بإجراء شق صغير في خط الوسط مع المقص. استخدام أصابع القفاز للاحتفاظ بأعلى وأسفل الشق الجلد، وسحب الجلد بعيداً صوب الصدر وذيل الماوس.
  3. فهم الصفاق بالملقط. ناحية أخرى، جعل شق على شكل V من الأمامي نحو الخلفي باستخدام مقص ونقل الأنسجة بعيداً لفضح تجويف البطن. استخدام الملقط دفع الأمعاء إلى جانب واحد من أجل الوصول إلى الرحم.
  4. قم بتحديد موقع قرنان الرحم. عقد عنق الرحم (الجزء والذيلية) مع الملقط وقطع الأربطة مع مقص جيد. ثم فصل كل ابواق الرحم بجب أوفيدوكتس مع المقص.
  5. استخدام الملقط لنقل الرحم إلى 10 سم معقمة تحتوي على طبق العقيمة، درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني. إزالة الأنسجة الدهنية، والأوعية والأعصاب المحيطة بقرون الرحم مع الملقط غرامة و/أو المقص (الشكل 1A).

3. تشريح الجنين

ملاحظة: الخطوات التالية تحت ستيريوميكروسكوبي مجهزة بمجموعة تكبير 8:1.

  1. فصل الأجنة بقطع ما بين المواقع غرس مع المقص. فهم بطانة الرحم العضلية براعم الرحم مع الملقط وتسحبه بعيداً لفضح أوروبية (الشكل 1B).
  2. استخدام الملقط، نقل براعم الرحم إلى طبق 10 سم جديدة تتضمن العقيمة، "الرايت برنامج تلفزيوني".
  3. إصلاح أوروبية حول الجنين مع نصائح الملقط.
  4. جعل شق الجانب ميسوميتريال المضادة لاوروبية مع غرامة الملقط (الشكل 1)، وقشر أوروبية بعيداً مع الملقط لفضح الجنين (الشكل 1).
    ملاحظة: القطب ميسوميتريال من أوروبية هو فاسكولاريزيد جداً ويمكن أن تكون أوسع في قاعدتها من الجزء ميسوميتريال المضادة، التي تحتوي على الجنين ويظهر اشحب.
  5. تشريح الجنين بالملقط (الشكل 1E، F).
  6. باستخدام ملعقة صغيرة-، نقل الجنين إلى قطره PBS العقيمة الواردة في صحن معقم 3.5 سم.
  7. نقل الجنين إلى قطره جديدة من برنامج تلفزيوني في نفس الطبق 3.5 سم باستخدام ملعقة صغيرة-، وتشريح الجنين من كيس ألمح باستخدام الملقط (الشكل 1، ح).
  8. بشكل اختياري، إذا لزم الأمر (مثلاً، للتنميط بتفاعل البوليميراز المتسلسل)، نقل كيس ألمح في أنبوب عقيم يسفط مع ~ 5 ميليلتر PBS في تلميح ماصة فوهة كبيرة 200 ميليلتر. مخزن في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: الأم الأنسجة (أي، كيس الصفار الجدارية بما في ذلك الغشاء رايشرت والمخروط اكتوبلاسينتال) التي قد تلوث كيس الصفار الإعداد يؤدي إلى نتائج خاطئة التنميط. إزالة هذه الأنسجة أسهل قبل تشريح الجنين من كيس ألمح.

4-allantois التشريح والثقافة الرحم السابقين في إنتغرين α4β1 المعطل تداولها

  1. قص اللانتويس من موقع الإدراج القاعدية في نهاية مؤخرة الجنين باستخدام الملقط غرامة (الشكل 1 ح).
  2. بشكل اختياري، إذا كان التدريج التنموية المطلوبة، عد أزواج سميط للجنين بالفحص البصري باستخدام مجهر مجهزة مع مرحلة التباين البصريات و 5 × 10 × الهدف.
    ملاحظة: يمكن أن تمدد الجنين بالملقط لتسهيل عد سميط. مرفق تشوريوالانتويك والانصهار يحدث بين ه 8.0 و E 9.0 في الأجنة مع أزواج سميط 6 ≥. ويبدأ تحول في الأجنة مع أزواج سميط 6-8.
  3. ماصة 40 ميكروليتر/بئر دميم وتستكمل مع المصل البقري الجنين 10% (v/v)، ولام الجلوتامين، والمضادات الحيوية في العدد المطلوب من الآبار لوحة microtiter المغلفة مسبقاً (انظر الفرع 1).
  4. جمع allantois العائمة التي يسفط مع ~ 5 ميليلتر PBS إلى فوهة كبيرة من طرف ماصة 200 ميليلتر. نقل allantois 1/جيدا.
  5. احتضان اللانتويديس بوضع لوحات microtiter في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO2) على سبيل المثال، 6 و 12 و 24 ساعة. من أجل منع التدخل مع مرفق allantois، لا تقم بتحريك لوحات ميكروتيتير بين هذه النقاط الزمنية.
  6. في كل مرة نقطة، نقاط مرفق اللانتويس (مثلاً، لا allantois العائمة/مرفق allantois المرفقة جزئيا أو كلياً؛ تماما انتشار allantois) استخدام مجهر مجهزة بمرحلة التباين أو فرق التدخل التباين البصريات و 5 × أو 10 × الهدف (الشكل 2).
    ملاحظة: تظهر أمثلة تمثيلية اللانتويديس طازجة معزولة وتعلق تماما في الشكل 2. خارج الرحم، تعلق طرف القاصي اللانتويديس المعزولة من الفئران C57BL/6J wildtype ضمن ح 4-6 (هذا هو المشار إليها كمرفق جزئية allantois)، ومرفق كامل من اللانتويس كاملة ويتحقق داخل ~ ح 12 من الثقافة. ح 18-24، explant قد سويت بالأرض ويفترض شكل دائري (المشار إليها على أكمل وجه انتشار allantois) مع9،CD31-إيجابية ضفيرة وعائية16.

5-توكيدي تلطيخ من اللانتويس اكسبلانتيد ل CD31 ماركر خلية غشائي

  1. نضح وسيلة الثقافة تماما انتشار explants وإصلاح الخلايا بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 4% (w/v) بارافورمالدهيد/برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: بارافورمالدهيد السامة. ارتداء قفازات ونظارات واقية لتجنب الاتصال بالعين والجلد.
  2. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت، ثم نضح المادة طافية. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
  3. بيرميبيليزي الخلايا ومنع المواقع غير محددة ملزمة بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 0.1% (v/v) مصل الماعز العادي X-100/0.1% تريتون (w/v) BSA/10% (v/v) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في غسل الرايت مرتين بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
    ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً بين عشية وضحاها في هذه المرحلة.
  4. وصمة عار في الخلايا بإضافة 20 ميليلتر/جيدا من الأجسام المضادة CD31 المضادة الأساسي المخفف 01:50 في 0.1% (w/v) جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
  5. الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بإضافة 20 ميليلتر/جيدا من الماعز الثانوي المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة الفئران المخفف 1: 200 في 0.1% (w/v) جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 1 في حماية الرايت microtiter لوحات من الضوء بالالتفاف في رقائق الألومنيوم أو بواسطة وضع في غرفة مظلمة. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
  6. تضمين الخلايا بإضافة 20 ميليلتر/البئر متوسطة المتصاعدة. احتضانها ل ~ ح 1 على RT حتى قد وطدت المتوسطة المتصاعدة. تخزين لوحات microtiter RT أو 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  7. صورة ضفيرة الأوعية الدموية اللانتويس اكسبلانتس تحت مجهر fluorescence مجهزة × 5 أو 10 × الهدف ومرشحات مناسبة الأسفار.
    ملاحظة: تظهر الصور التمثيلية لضفيرة الأوعية الدموية CD31 إيجابية من اللانتويس انتشار تماما في الشكل 3. علامات أخرى لضفيرة الأوعية الدموية، مثل الأجسام المضادة الموجهة ضد فلك-1، أنطوني، التعادل-1 أو 2 التعادل يمكن استخدامها ك جيدا16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذا البروتوكول وصف أسلوب لعزل و explant اللانتويديس مورين السابقين فيفو، وتفاصيل التقييم النوعي لمرفق allantois إنتغرين α4β1، وهي عملية حاسمة خلال في فيفو تشوريوالانتويك الانصهار. تدل نتائج الممثل هو مبين في الشكل 1 ألف–ح الخطوات المتعاقبة من العزلة allantois بدءاً من الرحم الحامل. تتم إزالة الأنسجة الأم التي تحيط بقرون الرحم، مثل الأنسجة الدهنية والسفن (الشكل 1A)، ويتم تشريح ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حضور المصل، ومصدر غنى لجزيئات لاصقة المؤيدة المصفوفة خارج الخلية مثل فيبرونيكتين، سوف نعلق allantois explants سهولة إلى مختلف من البلاستيك، الزجاج، أو تصفية السطوح9،16. وهكذا، إذا يهدف تحليل أجرى للتحقيق على وجه التحديد أثر التعديل الوراثي أو أي معاملة أخرى في مرفق allantois معطلة α4β1، أنها حاسمة لمنع مواقع الربط غير محددة (مثلاً، مع المصل البقري ألبومين) بعد طلاء السطوح مع إنتغرين وقبل تفرخ مع المحتوية على مصل وسائط الإعلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل SFB688 الأوقيانوغرافية ألماني (إلى جي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C57BL / 6J الفئران من النوع البريمختبر جاكسونرقم الأسهم:  000664
70٪ (حجم / حجم) ملقط الإيثانولVWR International930031006
النمط القياسيأدوات العلوم الدقيقة11000-12ملقط يستخدم لفتح تجويف البطن.
ملقط تشريح دقيقأدوات العلومالدقيقة 11254-20Dumont # 5 علم الأحياء الطبي مع طرف ناعم وحاد. 
مقص ناعم أدوات العلوم الدقيقة14094-11شفرات مستقيمة.
مقص الربيع أدوات العلومالدقيقة 15012-12مقص زنبركي نويز بشفرات 14 مم لتشريح براعم الرحم.
ميكروسبونكارل روثAT18.1ملعقة 5 مم.
لوحات ميكروتيترibidi81501نستخدم شرائح تكوين الأوعية الدموية المعقمة غير المطلية (الحجم الداخلي 50 & L) مع سطح كاره للماء لا يتم معالجته بزراعة الأنسجة لتقليل non-&# 945; 4&# 946; 1-ملزمة بوساطة للبلاستيك.
طبق 10 سمNunc150350أطباق زراعة الأنسجة المعقمة.
طبق 3.5 سمNunc150288أطباق زراعة الأنسجة المعقمة.
أطراف ماصة الفتحة الكبيرة BiozymVT0140Xأطراف ماصة منخفضة الربط ، 200 ميكرو لتر.
α 4&# 946; 1 إنتجرينR& D Systems6054-A4Murine &# 945; 4&# 946; 1 إنتجرين يتم التعبير عنه وتنقيحه بشكل مؤتلف من خط خلايا مبيض الهامستر الصيني.
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS)سيجما ألدريتشD8537بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>.
دولبيكو s النسر المعدل المتوسط (DMEM)PAN BiotechP04-03600تحتوي التركيبة على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم و 3.7 جم / لتر من NaHCO3< / sub> ولكن لا يحتوي على L-glutamine ، والذي يضاف بشكل منفصل.
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو (ثيرموفيشر العلمي)15140-122100 × (10,000 وحدة / مل بنسلين و 10,000 ميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين) محلول مخزون.  تحضير وتخزين الحصص عند -20 درجة ؛ C لتجنب التجميد / الذوبان.
L-GlutaminePAN BiotechP04-80100100 × (200 ملم) محلول مخزون. تحضير وتخزين الحصص عند -20 درجة ؛ C لتجنب التجميد / الذوبان.
مصل الأبقار الجنينية BiochromS 0115نستخدم FBS المعطلة بالحرارة (يتم تسخينه إلى 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة مع الخلط لتعطيل المكملة).
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma AldrichA7030نستخدم الألبومين الخالي من البروتياز والأحماض الدهنية. قم بإعداد محلول 0.1٪ (وزن / حجم) في DMEM. تصفية معقمة للمحلول من خلال مرشح ثقافة الخلايا القابل للتصرف مع 0.22 & micro ؛ م حجم المسام والغشاء المرتبط بالبروتين المنخفض ، وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
para< / em>-FormaldehydeCarl Roth0335.2لعمل محلول الفورمالديهايد في PBS ، قم بوزن para< / em>-مسحوق الفورمالديهايد في غطاء جيد التهوية ، وأضفه إلى PBS المسخن مسبقا إلى حوالي 60 درجة ؛ C في دورق على طبق تحريك. أضف 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط حتى يختفي المحلول. دع المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بالتصفية من خلال حقنة مرشح 0.22 مم. اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف إلى حوالي 6.9 ، واضبط على مستوى الصوت النهائي باستخدام PBS. نحن نأخذ المحلول ونجمده ، ولكن يمكن أيضا تخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة أربعة أسابيع تقريبا.
Triton X-100Sigma AldrichX100استخدم أطراف ماصة ذات فتحة عريضة للتعامل مع Triton X-100 غير المخفف.
مصل الماعز العاديSigma AldrichG9023لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في تحليلات التألق المناعي.
&# 945;-CD31 الأجسام المضادةBD Biosciences550274الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفئران المنقاة المضادة للفئران ، استنساخ MEC 13.3.
الأجسام المضادة للماعز الثانوية المضادة للفئرانThermo FisherA-11006الماعز المضادة للفئران IgG (سلاسل ثقيلة وخفيفة) ، ممتصة متقاطعة ، تحمل علامة الفلورسنت الفلورية Alexa Fluor 488. من الممكن أيضا استخدام ملصقات الفلورسنت الأخرى.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381وسط تركيب للكيمياء الخلوية. ميغاواط ~ 31,000
لابوفيرت   ؛LeitzLabovert مجهر تباين الطور المقلوب مزود بهدف 4 × و 10 × لعد أزواج الجسيدات. مجاهر تباين الطور الأخرى (مثل تلك التي تستخدم بشكل روتيني في زراعة الأنسجة) مناسبة أيضا.  
M80Leica MicrosystemsM80مجهر مجسم مع نطاق تكبير 8: 1 (ينتج عنه تكبير بين 7.5 × و 60 ×) لتشريح الأجنة والآلانتويس.
DM4000BDM4000B Leica Microsystemsللأنسجة مع إضاءة LED. نحن نستخدم أهداف HCX PL FLUOTAR 5 x / 0.15 و HC PL FLUOTAR 10 x / 0.30. يمكن استخدام المجاهر الأخرى المجهزة بتباين الطور والبصريات الفلورية لتسجيل مرفق آلانتويس.
كاميرا رقميةJVCKY-F75U3-CCD كاميرا التقاط رقمية متصلة بمجهر DM4000B LED. نستخدم برنامج Diskus (Hilgers) لتشغيل كل من المجهر والكاميرا.
المجهر متحد البؤرLeica MicrosystemsSP5مجهر متحد البؤر للتصوير عالي الدقة للبطانة في الضفيرة الوعائية لمستخلصات آلانتويس. تم التقاط صور التألق المناعي بهدف 40 ×.
قطر محلول نظام مجهر

المراجع

  1. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
  2. Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160(2016).
  3. Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
  4. Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
  5. Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
  6. Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
  7. Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
  8. Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
  9. Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
  10. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
  11. Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
  12. Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
  13. Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
  14. Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
  15. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
  16. Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
  17. Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
  18. Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
  19. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تشريح السقاءإنتيغرين ألفا 4 بيتا 1جنين الفأرتكوين المشيمةمجهر تباين الأطوارصبغ CD31التثبيت بالبارافورمالدهيدالغسل بمحلول PBS
تشريح وثقافة Explant موريني Allantois للتحليل في المختبر للحجز الانتويك
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.