مقالة منهجية

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

6.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56728

⸱

مارس 30, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Colby College

في هذه المقالة

ملخص

ويرد بروتوكولا محسنة لقياس التعبير الجيني عابرة من ثوابت مراسل في الخلايا الارون الشعير بعد قصف الجسيمات. مزيج الحبوب الآلي طحن مع فحوصات إنزيم لوحة 96-جيدا يوفر إنتاجية عالية لهذا الإجراء.

الملخص

الطبقة الارون الحبوب الشعير نظام نموذجا هاما للتعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات. في الخلايا الارون، الجينات المطلوبة للإنبات أو يتم تنشيط التنمية الشتلات في وقت مبكر من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). يمكن استجوابهم آليات GA وأبا إشارات بإدخال ثوابت الجينات مراسل الارون الخلايا عن طريق القصف الجسيمات، مع تعبير عابر الناتجة تقاس باستخدام فحوصات إنزيم. وضع بروتوكول تحسين يقال أن جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس الحبوب وفحوصات إنزيم، السماح بإنتاجية أكبر بكثير من الأساليب القائمة. تجانس عينات الحبوب يجري استخدام الخالطون نسيج الآلي، وفحوصات غوس (β-جلوكورونيداسي) وتنفذ باستخدام نظام لوحة 96-جيدا. نتائج تمثيلية باستخدام البروتوكول تشير إلى أن النشاط phospholipase د قد تلعب دوراً مهما في تنشيط الجينات HVA1 برابطة المحامين الأمريكية، من خلال عامل النسخ TaABF1.

المقدمة

طبقة الارون الشعير نظام نموذجي راسخة لدراسة التعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات1. على وجه الخصوص، يتم تنشيط عدد من الجينات المطلوبة للإنبات أو الشتلات المبكرة من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). تتشابك GA وأبا إشارات المسارات، كما تحول دون التعبير عن بعض الجينات تنشيط الجمعية العامة برابطة المحامين الأمريكية، والعكس بالعكس1.

استراتيجية قيمة لفهم دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا قد تم الأخذ بنيات الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابر للمراسل بنيات تسمح بذلك من الأثر على التعبير الجيني المتلقين للمعلومات تحديد. يسمح استخدام الجينات مراسل مثل غوس (β-جلوكورونيداسي) أو لوسيفراس قياس الكمية وحساسة للتعبير الجيني على وجه التحديد داخل الخلايا التي حصلت في بناء المستجيب. على سبيل المثال، أنشأت الأخذ ببناء المستجيب ترميز عامل النسخ5،TaABF16 أن الجينات التي يسببها أبا مثل HVA1 هي الناجمة عن TaABF1، بينما الجينات التي يسببها GA مثل Amy32b يتم قمعها. قد استخدمت القصف الجسيمات كاستراتيجية تجريبية بمختبرات متعددة للتحقيق في الجوانب المتنوعة لإشارات GA/أبا. مثل هذا العمل قد أدى إلى تحديد عناصر المروج هامة لتفعيل المستحثة ألجأ2 والجينات التي يسببها أبا3، وإلى اكتشاف بروتين مؤنزم4 وعوامل النسخ5 التي تنظم التعبير عن هذه الجينات.

القائمة بروتوكولات2،3،4،5،6 لقصف الجسيمات وقياس اللاحقة للتعبير الجيني عابرة هي تماما العمل المكثف، كما قصفت كل مجموعة هو تجانس بالكاد من الحبوب باليد بقذائف الهاون والمدقة وتجري فحوصات إنزيم على حدة. تقارير هذه المخطوطة هو بروتوكول تحسين جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس وفحوصات جوس للسماح بإنتاجية أكبر بكثير، السماح لعدد أكبر من العلاجات لفحصها بالتجربة نفسها، و/أو إدراج replicates أكثر لكل معاملة للحصول على المزيد من النتائج إحصائيا قويا. وتظهر نتائج تمثيلية للتعبير عن نيات مراسل HVA1 و Amy32b ، وينظم على عامل النسخ TaABF1 وكذلك الجمعية العامة، وأبا، والجزيئات التنظيمية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد المستجيب والجينات مراسل بنيات

  1. بناء المستجيب بنيات التي توظف مروج تأسيسي (مثل الذرة أوبيكويتين، يو بي أي) إلى التعبير بالسيارة من إطار المطلوب قراءة مفتوحة. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على UBI::TaABF1 إلى محرك قوي التعبير التأسيسي من TaABF15.
  2. بناء بني مراسل التي تشمل المروج التي يتمثل نشاطها إلى قياس ووضع المراحل الأولى من إطار القراءة المفتوحة، مثل غوس. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على HVA1::GUS لقياس التعبير من HVA1 المروج2،5.
  3. بناء بنية رقابة داخلية (مثل يو بي أي::لوسيفراس).
  4. استخدام عمود ربط والسليكا البروتوكول (انظر الجدول للمواد)، وإعداد بلازميد عالية الجودة لكل من بنيات الجينات المطلوبة. استخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد)، بدقة قياس تركيز كل إعداد بلازميد.

2-إعداد الحبوب الشعير للقصف

  1. قم بإعداد جدول بيانات (انظر الشكل 1 على سبيل مثال) تشير إلى البلازميدات التي سيتم قصف والعلاجات المناسبة هرمون، والمعلومات الأخرى ذات الصلة لكل من المعاملة التي ستكون جزءا من هذه التجربة.
  2. استخدام قطع مجلس وشفرة حلاقة عقيمة، قطع الأجنة من الحبوب من الشعير هيمالايا (40 لكل معاملة المدرجة في هذه التجربة). استبعاد الحبوب التي أصغر بكثير من متوسط أو مشوه.
  3. ضع جميع الحبوب امبريولس في أنبوب 50 مل. إضافة 40 مل من المياه والصخور لمدة 10 دقائق.
  4. صب الماء بعناية (لتجنب فقدان الحبوب) وإضافة 40 مل التبييض 10%. روك لمدة 20 دقيقة.
  5. من أجل الخروج التبييض وإضافة 40 مل الماء المعقم. روك لمدة 5 دقائق. كرر هذا يغسل الماء المعقم أربع مرات أكثر.
  6. إضافة 40 مل من "محلول الشرب" (20 مم سوكسيناتي الصوديوم، وكلوريد الكالسيوم 20 مم، pH 5.0) و 40 ميكروليتر من الكلورامفينيكول الحل الأسهم (10 ملغ/مل).
  7. نقل معظم "الحل الشرب" (مع الكلورامفينيكول) من الأنبوب إلى "لوحة الفيرميكوليت" (انظر الجدول للمواد). ثم نقل الحبوب على سطح الورق تصفية الرطب في "لوحة الفيرميكوليت". انتشرت الحبوب بشكل متساو. أغرقت صب في الحل إيمبيبينج ما يكفي للحفاظ الحبوب جزئيا (ولكن ليس تماما). ضع غطاء على رأس "لوحة الفيرميكوليت".
  8. احتضان الحبوب امبريولس عند 24 درجة مئوية لحوالي 48 ساعة مع إضاءة الفلورسنت. إضافة "حل الشرب" إضافية حسب الضرورة.
  9. فتح طبق بيتري بلاستيك 90 ملم وصب 20 مل من "حل الشرب" في الطبق نفسه و 20 مل في غطاء مقلوب. إضافة 20 ميكروليتر الكلورامفينيكول (10 مغ/مل) لكل منهما. تعقيم اثنين من أزواج من الملقط نقطة غرامة بغمس لهم في الكحول.
  10. وضع عدد قليل من الحبوب امبريولس في غطاء طبق بيتري. بلطف باستخدام الملقط، إزالة المعطف البذور (شفاف) من كل الحبوب. أثناء إزالة المعطف البذور من الجانب السلس من الحبوب، لا تضر الخلايا (الارون) الأساسية. نقل الحبوب مقشرة على طبق بتري يحتوي على "الشرب الحل".
  11. بعد تقشير البذور معطف من جميع الحبوب، إعادتها إلى "لوحة الفيرميكوليت". احتضان الحبوب امبريولس مقشرة عند 24 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
  12. قبل استخدام الحبوب للقصف، إزالة الرطوبة السطحية التي تهتز لها بين أوراق التصفية في طبق بتري.

3-إعداد بلازميد الحمض النووي للقصف

  1. قم بتسمية أنبوب 1.5 مل لكل معاملة التي سيتم تضمينها في تجربة القصف. لكل أنبوبة إضافة 2.5 ميكروغرام من يو بي أي::لوسيفراس الرقابة الداخلية بلازميد، 2.5 ميكروغرام بلازميد مراسل غوس ، والمبلغ المطلوب (عادة 0.025 ميكروغرام إلى 2.5 ميكروغرام) من بلازميد المستجيب. إضافة المياه تحقيق الحجم الإجمالي إلى 5 ميليلتر.
  2. إعداد 1.6 ميكرون الذهب ميكروكاريرس (انظر الجدول للمواد) التالية نشرت البروتوكولات6.
  3. لكل معاملة، إضافة 50 ميليلتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ في أنبوب 1.5 مل تحتوي على الحمض النووي بلازميد. معطف ميكروكاريرس مع بلازميد الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة للبروتوكولات6.
  4. في الخطوة الأخيرة، عندما يتم تعليق في 48 100% ميليلتر الإيثانول، بيبيت 8 ميكروليتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ على كل من ماكروكاريرس خمسة ميكروكاريرس المغلفة بلازميد والسماح لهم بالهواء الجاف.

4-الجسيمات القصف من الحبوب الشعير امبريولس

  1. قم بإعداد الجهاز القصف الجسيمات (انظر الجدول للمواد)6.
  2. ضع قرص تمزق هذه المبادرة 1550 إلى الحد الأقصى الاحتفاظ وجبل على الصك.
  3. ضع ماكروكارير التي تحتوي على تركيبة بلازميد المطلوب (جنبا إلى جنب مع شاشة توقف) إلى الجمعية العامة إطلاق ميكروكارير. إدراج الجمعية في الفتحة أعلى دائرة القصف. تعيين المسافة بين تمزق القرص الاحتفاظ بغطاء وغطاء غطاء ماكروكارير على مسافة قياسية (6 ملم)، ووضع دعم شاشة التوقف في الموقف الوسط (قياسي)، مما يسمح لمسافة سفر ماكروكارير 11 مم (الشكل 2A).
  4. ترتيب الحبوب امبريولس 8 في نمط شعاعي ضيق (مع نهايات أرق مشيراً إلى الداخل) في دائرة تصفية ورق الذي يتم مسجلة أسفل مسطحة لغطاء طبق بيتري 90 مم (انظر الشكل 2).
  5. ضع الطبق مع الحبوب إلى غرفة عمليات القصف، على مسافة 6 سم من شاشة التوقف.
  6. إخلاء قاعة القصف إلى 95 كيلوباسكال وثم قصف العينة.
  7. بعد الإفراج عن الفراغ، نقل الحبوب قصفت على طبق بيتري مسمى 60 ملم تحتوي على 4 مل من "محلول الشرب" يحتوي على 1 ملغ/مل كلورامفينيكول.
  8. كرر حتى تم إكمال كافة عمليات القصف. احتضان (على منصة تهز 100 لفة في الدقيقة) عند 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

5-استخراج البروتين للذوبان من الحبوب قصفت

  1. استخدام الملقط، إزالة الحبوب قصفت 8 من طبق بيتري 60 ملم ولطخة لهم الجافة على منشفة ورقية. تقسيم الحبوب إلى أنبوبين مل 2.0 المسمى (الحبوب 4 كل أنبوب) كل منها يحتوي على 800 ميكروليتر "طحن المخزن المؤقت" (100 مم نا فوسفات الهيدروجيني 7.2، 5 مم DTT، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، والغليسيرول 20 ٪) وحبه 5 مم من فولاذ المقاوم للصدأ. كرر هذه العملية لكل من الحبوب قصفت.
  2. ضع (تصل إلى 48) 2.0 مل أنابيب إلى رفوف اثنين من الخالطون حبة (انظر الجدول للمواد). تحميل الرفوف على الخالطون.
  3. هز العينات في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
  4. إزالة الرفوف الخالطون من الخالطون ووضعها على الجليد (5 دقائق) لإعادة تبريد العينات.
  5. جبل الرفوف مرة أخرى على الخالطون-في الاتجاه المعاكس. هز العينات مرة أخرى في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
  6. بارد رفوف على الجليد، ثم كرر "الخطوات 5، 3" إلى 5.5. هذا وسوف تضيف ما يصل إلى ما مجموعة 12 دقيقة من الهز.
  7. الطرد المركزي مقتطفات الحبوب في س 16,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  8. فورا بعد الطرد المركزي، صب supernatants واضحة في مجموعة ثانية من أنابيب ميكروسينتريفوجي. إعطاء كل أنبوب دوامة سريعة. تخزين الأنابيب على الجليد.
  9. بعد نقل المادة طافية، استرداد الخرز الصلب من الكريات حيث يمكن غسلها وإعادة استخدامها.

6-قياس النشاط لوسيفراس من مقتطفات الحبوب

  1. لكل أنبوبة من استخراج الحبوب تكون جزيئي، إعداد أنبوب اختبار زجاج 12 مم × 75 مم تحتوي على 200 ميكروليتر من "خليط الإنزيم لوسيفراس" (45 ملم تريس كبريتات الأس الهيدروجيني 7.7، 15 مم مجكل2، 20 مم DTT، 1.5 مم يدتا، لوسيفرين 1 مم، ATP 1 مم).
  2. إضافة 100 ميكروليتر من استخراج الحبوب أول أنبوب الفحص الأولى. الدوامة بسرعة مزيج جيد. فورا وضع الأنبوبة في حامل أنبوب لومينوميتير وأغلق الباب. عند الانتهاء من القياس، إزالة الأنبوب من لومينوميتير – ترك الباب مفتوحاً لموضع الأنبوب القادم.
  3. كرر هذه العملية حتى تم قياس جميع العينات.

7-قياس النشاط جوس من مقتطفات الحبوب

  1. إضافة 200 ميكروليتر من "المخزن المؤقت للمقايسة غوس" (50 مم نا الفوسفات الرقم الهيدروجيني 7.2، 2.5 ملم 4-ميثيلومبيليفيريل-د-بالجلوكويورونويد، 10 مم DTT، 2 مم يدتا، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 20% ميثانول، أزيد الصوديوم 0.02 في المائة) لكل بئر من صفيحة جيدا 96.
  2. استخراج مكان 50 ميكروليتر من كل الحبوب في المقابلة أيضا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. ختم الجزء العلوي مع ختم الفيلم.
  3. احتضان 96 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 ساعة.
  4. الطرد المركزي 96 لوحة جيدا في س 4,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ووضعه على الجليد.
  5. إضافة 250 ميكروليتر من 0.2 م Na2CO3 لكل بئر من لوحة سوداء 96 جيدا.
  6. إضافة ميكروليتر 6.25 كل خليط المقايسة جوس سينتريفوجيد في المقابل جيدا (التي تحتوي على 0.2 م Na2CO3) الأسود 96 لوحة جيدا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. وتشمل الآبار مع ميكروليتر 6.25 10 ميكرومترات و 40 ميكرومتر ميكرومترات 100 4-ميثيلومبيليفيروني كمعايير.
  7. ضع اللوحة السوداء في فلوروميتير لوحة وقراءة الأسفار ميثيلومبيليفيروني. أخذ القراءات في الطول موجي إثارة 360 نيوتن متر، والطول موجي انبعاثات من 460 نانومتر. تعيين كسب الصك أن ميكروليتر 6.25 تتضمن أيضا من 40 ميكرومتر 4-ميثيلومبيليفيروني و 250 ميكروليتر من 0.2 م Na2CO3 يعطي قراءة 1000 وحدة الأسفار.

8-بيانات التحليل

  1. أدخل القيم لوسيفراس وفحوصات غوس في جدول بيانات. استبعاد من النظر في أي نموذج بقراءة لوسيفراس لأقل من 20,000 التﻷلؤ النسبية وحدات s-1، كما يشير هذا إلى أن بنيات الجينات لم تسلم بنجاح إلى الخلايا الارون.
  2. لكل الحبوب قصفت بنجاح استخراج (الذين يمثلون مجموعة من الحبوب امبريولس أربعة)، حساب التعبير غوس مسواة من البيانات الخام غوس ولوسيفراس على النحو التالي: تطبيع غوس = [(غوس التعبير-غوس فارغة) x (2,000,000)]/(لوسيفراس التعبير – لوسيفراس فارغ).
    ملاحظة: هذا طبيعتها مقدار نشاط غوس إلى ما قد لوحظت في قصف الذي أعطى قراءة لوسيفراس 2,000,000.
  3. تقرير المستوى النسبي للتعبير عن بناء مراسل خاص حضور المستجيب بنيات أو علاجات الهرمون يتم اختباره عن طريق مقارنة بمستوى التعبير في الغياب المستجيبة أو الهرمونات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لإدخال أي بناء اختبار الجينات في الخلايا الارون الحبوب الشعير. ثم قد يكون مستوى التعبير عن الجين اختبار قياس ملائم (الشكل 2). البروتوكول إنتاجية أعلى الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من كفاءة طحن البذور والخطوات إنزيم المقايسة. وقد استخدمت هذه الطريقة لتقييم قدرة5،TaABF1 عامل النسخ6 على تنشيط التعبير عن الجينات التي يسببها أبا HVA17. في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بنيات إدخال الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابرة من بنيات مراسل استراتيجية قيمة لتشريح دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا والجين ينظم هرمون الناتجة التعبير.
ومع ذلك، هي البروتوكولات القائمة لإجراء مثل هذه التجارب في الشعير الارون الخلايا2،3،،من45،6 جداً كثيفة العمالة. كل مجموعة من قصف بالكاد الحبوب يجب أن تكون ناحية تجانس بقذائ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون غريسون بتلر ومارغريت باريت للمساعدة في القيام التجارب وستون جودي لإسداء المشورة بشأن التجانس الحبوب هانوم لين لإسداء المشورة بشأن فلوروميتري. هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (0443676 المعهد المصرفي)، "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم المنحة P20GM0103423، والمنح المقدمة من كلية كولبي شعبة العلوم الطبيعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة البلازميد Maxiprep من GeneEluteSigmaNA0310-1KT
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجيةNanodropND-1000
حبوب الشعير في الهيمالايا//مجموعة متنوعة من الشعير عديم الهيكل (تخزينها في الظلام عند 4 درجات ؛ ج)
سكسينات الصوديومSigmaS2378لشرب محلول
كلوريد الكالسيوم (ثنائي هيدرات) كاشففيشرC79-500لمحلول شرب
محلول شرب محلي الصنع/20 ملي مولار سكسينات الصوديوم ، 20 ملي كلوريد الكالسيوم ، درجة الحموضة 5.0. تعقيم عن طريق التعقيم قبل الاستخدام.
كلورامفينيكولسيجماC0378قم بإعداد محلول مخزون 10 مجم / مل في 70٪ إيثانول.
يستخدمNC0430369 الفيرميكوليتفيشرلألواح الفيرميكوليت.
دوائر ورق الترشيح (90 مم)Whatman1001 090تستخدم للفيرميكوليت ولتحضير الحبوب قبل القصف
ألواح الفيرميكوليتمحلية الصنع/أضف 50 مل من الفيرميكوليت إلى طبق بتري زجاجي. ضع دائرة ورقية مقاس 90 مم فوق الفيرميكوليت. الأوتوكلاف.
ملقط (مدبب ناعم)فيشر13-812-42يستخدم لإزالة طبقة البذور من حبوب الشعير.
ملقط (نقطة دقيقة جدا)فيشر12-000-122يستخدم لإزالة طبقة البذور من حبوب الشعير.
ناقلات الذهب الصغيرة (1.6 & mu; م)BioRad1652264
الناقلات الكبيرةBioRad1652335
كلوريد الكالسيوم (ثنائي هيدرات)فيشرC79-500قم بإعداد محلول مخزون 2.5 متر وتخزين 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية.
سبيرميدينسيجماS0266تحضير محلول مخزون 100 ملي وتخزين 500 مو ؛ L aliquots عند -20 درجة ؛ C (استخدم في غضون 2 أشهر).
أقراص التمزق (1550 رطل لكل بوصة مربعة)شاشاتإيقاف 1652331
BioRad1652336
حاملي الناقل الكبيرBioRad
BioRadPDS-1000 / He
أحادي هيدرات فوسفات الصوديومSigmaS9638لدرجة حموضة فوسفات الصوديوم 1M 7.2
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةSigmaS9763كاشف ل 1M فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.2
1M فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.2محلي الصنع/امزج 6.9 جم من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدرات مع 7.1 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة. أضف الماء إلى 100 مل. أضف هيدروكسيد الصوديوم للحصول على الرقم الهيدروجيني 7.2.
dithiothrietol (DTT)Sigma43819يذوب في الماء إلى 1 M. يحفظ عند -20 درجة ؛ في 1 مل من الحصص
ليوببتينسيجماL2884يذوب في الماء إلى 10 مجم / مل. يخزن في -20 درجة ؛
C.glycerolSigmaG5516تحضير محلول 50٪ في الماء.
طحن عازلةمحلية الصنع/يجمع بين 10 مل من 1 م فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 500 مو ؛ L من 1 م DTT ، 100 مو ؛ لتر من 10 مجم / مل ليوبيبتين ، و 40 مل من 50٪ جلسرين. أضف الماء إلى 100 مل.
حبات فولاذية غير قابلة للصدأ (5 مم)Qiagen69989
أنابيب 2.0 ملEppendorf22363352يوصى باستخدام هذا النموذج المحدد من الأنبوب مع الخالط.
الخالط الخرزة (TissueLyser)Qiagen85210
أنابيب اختبار زجاجية مقاس 12 مم × 75 ممفيشر
لوسيفيرينGoldbioLUCK-100قم بإعداد محلول مخزون 25 ملي مولار وقم بتخزين 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية.
ATPSigmaA7699إعداد حل مخزون 100 ملي متر وتخزين 250 مو ؛ L aliquots عند -20 درجة ؛  ج.
قاعدةتريس سيجماT1503لدرجة الحموضة 1M Tris Clifate 7.7.
كاشف 258105 حمض الكبريتيكسيجمال 1M كبريتات تريس الرقم الهيدروجيني 7.7.
1M كبريتات تريس درجة الحموضة 7.7محلية الصنع/قم بإذابة 12.1 جم من قاعدة تريس في 100 مل من الماء. اضبط درجة الحموضة على 7.7 باستخدام حمض الكبريتيك.
كلوريد المغنيسيومSigmaM9397يذوب في الماء حتى 2 متر.
لوسيفيراز فحص المخزن المؤقت (LAB)محلي الصنع/الجمع بين 3 مل من 1 M Tris كبريتات الرقم الهيدروجيني 7.7, 500 & mu; L من 2 M كلوريد المغنيسيوم ، 1 مل من 1 M DTT ، و 200 & mu ؛ L من 0.5 م EDTA. أضف الماء إلى 50  مل.
خليط فحص لوسيفيرازمحلي الصنع/يمزج 15 مل من LAB ، 800 مو ؛ L من 25 ملي لوسيفيرين ، 200 مو ؛ L من 100 ملي متر ATP ، و 4 مل من الماء. هذا يجعل خليط الفحص كافيا (20   مل) ل 100 فحوصات لوسيفيراز.
مقياس الإضاءة (سيريوس)بيرتولد/
4-ميثيل أومبيليليبريل- بيتا ؛ -D-جلوكورونيد (MUG)GoldbioMUG1يذوب في DMSO إلى 100 ملليمتر.
أزيد الصوديومSigmaS8032قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 2٪ في الماء وتخزين 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية.
96 لوحة بئر (قياسي)فيشر12565501
GUS اختبار عازلةمحلية الصنع/الجمع بين 2.5 مل من MUG ، 5 مل من 1 M فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 400 مو ؛ L من 0.5 M EDTA ، 1 مل من 1 M DTT ، 100 & لتر من 10 مجم / مل ليوبيبتين ، 20 مل من الميثانول ، و 1 مل من أزيد الصوديوم 2٪. أضف الماء إلى 100 مل.
فيلم ختم TempPlateالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2921-1000
96 لوحة بئر (أسود)كوستار3916
كربونات الصوديومسيجماS7795تحضير محلول 200 ملي مولار في الماء.
4-methylumbelliferoneSigmaM1381تحضير 100 & مو ؛ محلول M في الماء. تجميد 1 مل من الحصص عند -20 درجة ؛  ج.
قارئ الألواح الدقيقةBio-TekFLX-800
HP كاشف نظام توصيل الجسيمات BioRad 1652322 كاشفكاشف

المراجع

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GUS 96 D HVA1 TaABF1

مقالات ذات صلة