يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية

13.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56739

⸱

أبريل 2, 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، هلام ثنائي الأبعاد التفريد (2DE) مقترنة بالطيف الكتلي (مللي ثانية) لفصل وتحديد البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية، الذي يعرض نمط 2DE جيدة واستنساخه. ولوحظت العديد من البروتينات في كل بقعة 2DE عند تحليل البروتين السرطان معقدة باستخدام MS حساسية عالية.

الملخص

الورم الحميد الغدة النخامية البشرية (السلطة الفلسطينية) هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور تحت المهاد-النخامية-استهداف الجهاز، ويمكن أن تصنف السلطة الفلسطينية أما سريرياً وظيفي أو غير وظيفي (FPA و NFPA). ومن الصعب NFPA لمرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب بالكاد رفع مستوى الهرمونات في الدم بالمقارنة مع FPA. هدفنا طويل الأجل لاستخدام أساليب البروتيوميات لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح الآليات الجزيئية السلطة الفلسطينية والاعتراف بعلامات التشخيص، تشخيصية فعالة والأهداف العلاجية. هلام ثنائي الأبعاد فعالة التفريد (2DE) مقترنة بأساليب الطيف الكتلي (مللي ثانية) وعرضت هنا لتحليل البشرية بروتيوميس السلطة الفلسطينية، بما في ذلك إعداد العينات، التفريد جل 2D، التصور البروتين، وتحليل الصور، في جل الهضم التربسين وهضميد بصمة الشامل (تحلان) جنبا إلى جنب كتلة قياس الطيف الكتلي (MS/MS). هلام ثنائي الأبعاد التفريد الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين الكتلي تحلان (2DE--استخدام MS تحلان)، 2DE--استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد أو مرض التصلب العصبي المتعدد، والفصل اللوني السائل 2DE (LC) MS/MS الإجراءات التي طبقت بنجاح في تحليل البروتين NFPA. مع استخدام مطياف كتلة حساسية عالية، حددت العديد من البروتينات باستخدام أسلوب 2DE-LC-MS/MS في جل 2D كل بقعة في تحليل الأنسجة السلطة الفلسطينية معقدة تحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين البشري في السلطة الفلسطينية.

المقدمة

السلطة الفلسطينية هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور الجهاز تحت المهاد-النخامية-المستهدفة، التي تلعب أدواراً هامة في نظام الغدد الصماء الإنسان. وتشمل السلطة الفلسطينية سريرياً وظيفية ولا يعمل نظام تقييم الأداء (FPA و NFPA)1،2. NFPA أمر صعب في مرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب مستويات الهرمون مرتفعة قليلاً فقط (مثلاً، LH و FSH) في الدم بالمقارنة مع FPA، الذي شهد زيادة كبيرة في مستويات الهرمونات المقابلة في الدم3،4 ،5. توضيح الآليات الجزيئية واكتشاف المؤشرات الحيوية فعالة له أهمية سريرية هامة في التشخيص والعلاج، والتكهن من NFPA. هو هدفنا طويل الأجل تطوير واستخدام أساليب البروتين لدراسة NFPA لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح آلياته الجزيئية، والاعتراف بالأهداف العلاجية الفعالة، فضلا عن علامات التشخيص وتنبؤاتها. 2-دي مقترنة بمرض التصلب العصبي المتعدد الأساليب قد استخدمت على نطاق واسع في برنامجنا البحوث طويلة الأجل فيما يتعلق بالإنسان السلطة الفلسطينية البروتين1،2،،من67، بما في ذلك إنشاء مرجع البروتين خرائط3،8، تحليل البروتين الأثران عن ملامح9،10،11،12،13، المتغيرات هرمون14 ،15، التعديلات بوستترانسلاشونال مثل الفسفرة14 وتيروزين نترته16،،من1718، واختلاف البروتين الغازية نسبة إلى موسع نفباس19، وإلى عدم تجانس البروتين NFPA الأنواع الفرعية13، مما أدى إلى اكتشاف عدة شبكات المسار الهام (خلل mitochondrial والتقلبات دورة الخلية، والأكسدة، وإشارات MAPK شذوذ النظام) التي يتم تغييرها في NFPA13،،من1920.

2DE يفصل البروتينات وفقا isoelectric نقطة (pI) (تركز isoelectric، الضمنية) والوزن الجزيئي (عن طريق الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23-هذا أسلوب فصل الكلاسيكي ومشتركة في ميدان البروتيوميات، منذ الأخذ بمفاهيم البروتين والبروتينات في 199524. مرض التصلب العصبي المتعدد هو الأسلوب حاسمة لمعرفة الهوية البروتينات المفصولة 2DE، بما في ذلك استراتيجيات تحلان و MS/MS. التطور السريع جداً لمرض التصلب العصبي المتعدد الصكوك، لا سيما في الجوانب للكشف عن حساسية والقرار، في تركيبة مع تحسين نظام LC، يحسن إلى حد كبير هوية البروتينات وفرة منخفضة أو منخفضة للغاية في البروتين إلى أقصى حد ممكن تغطية البروتين. كما أنه يتحدى مفاهيمنا التقليدية واحدة فقط أو اثنين من البروتينات موجودة في 2D هلام موضعي في تحليل البروتين الأنسجة البشرية المعقدة، ويوفر فرصة للتعرف على البروتينات متعددة في 2D هلام موضعي في تحليل الأنسجة البشرية المعقدة البروتين، وتحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين NFPA.

هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة من 2DE--استخدام MS تحلان، 2DE--استخدام MS/MS، و 2DE-LC-MS/MS التي استخدمت بنجاح في تحليل البروتين NFPA البشرية. البروتوكولات وتشمل إعداد العينات، البعد الأول (isoelectric التركيز، الضمنية)، البعد الثاني (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، تصور بروتينات (تلطيخ الفضة وتلطيخ أخذ الأزرق)، صورة التحليل في 2D هلام، التربسين في جل الهضم، تنقية الببتيدات تريبتيك وتحلان، MS/MS، وقاعدة بيانات الحارقة3،8،،من2526. وعلاوة على ذلك، يترجم هذا البروتوكول بسهولة لتحليل بروتيوميس الأنسجة البشرية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية إكسيانجيا المستشفى الطبية الأخلاقيات اللجنة الجامعة الجنوبية المركزية، الصين. يجب أن تلبس قبعة رأس وقفازات للإجراءات التجريبية بأكملها لتفادي التلوث الكيراتين من الجلد والشعر8.

1-إعداد العينات

  1. جمع السلطة الفلسطينية الأنسجة (0.2-0.5 ملغ) من قسم الجراحة العصبية. تجميد فورا في النتروجين السائل، ومن ثم نقل إلى-80 درجة مئوية لتخزين.
  2. إضافة 2 مل من 0.9% كلوريد الصوديوم في المياه المقطرة (ddH2س). استخدام هذا الحل لخفة غسل الدم من سطح النسيج (3 x).
    ملاحظة: ddH2س مع موصلية 18.2 MΩ/سم تستخدم في جميع أنحاء البروتوكول. يتم فقدان بعض تيسويمايت عند غسل قبالة الدم من الأنسجة سطح الأرض.
  3. إضافة وحدة تخزين (10 مل؛ 4 درجة مئوية) من الحل الذي يحتوي على حمض الخليك م 2 و 0.1% (v/v) β-ميركابتوثانول لكل 0.5-0.6 غرام أنسجة، ومجانسة (1 دقيقة، 13,000 في الدقيقة، 4 درجة مئوية، 10 x) مع الخالطون أنسجة، sonicate هوموجيناتي ل 20 ق، ليوفيليزي ، وتخزينها في −80 درجة مئوية.
  4. قياس محتوى البروتين المجففة بالتبريد، والاعتداء مجموعة من عينات المتجانس باستخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي).
    ملاحظة: اتفاق التعاون الأساسي الكمي ليس القياس الكمي مطلق، وسوف تتغير النتيجة المقاسة مع فني مختلف وعامل تجريبي. وينبغي استخدام معيار نموذج تركيز ثابت لتجارب مختلفة. ولذلك، سيتم تحديد المبلغ النهائي تحميل من البروتينات لكل جل 2D مع صورة قرار حسن الملطخة بالفضة أو أخذ الملون في التجارب المصممة مسبقاً.
    1. إضافة حوالي 300 ميكروغرام من العينة المتجانس المجففة بالتبريد إلى مجلد واحد (282 ميليلتر) لاستخراج البروتين المخزن المؤقت (م 8 اليوريا والفصول 4 في المائة)، تليها الدائمة ح 2، سونيكاتينج في حمام مائي لمدة 5 دقائق، بالتناوب ح 1، سونيكاتينج مرة أخرى في حمام الماء لمدة 5 دقائق ، مرة أخرى بالتناوب ح 1، وسينتريفوجينج في 15,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
    2. إعداد الحلول القياسية جيش صرب البوسنة مع تركيزات كما ذكر: 0، 25، 125، 250، 500، 750، 1,500، 2,000 ميكروغرام/مل مع معيار قانون سرية المصارف التجارية (2 مغ/مل).
    3. كاشف "مزيج اتفاق التعاون الأساسي" A و B (A:B = 50: 1) كاتفاق التعاون الأساسي العامل الحل قبل استخدامها.
    4. إضافة 0.1 مل من العينة أو الحل القياسية لمل 2 من اتفاق التعاون الأساسي العامل الحل في [ميكروفوج] أنابيب، متبوعاً بالاختلاط وتفرخ ثم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أخيرا تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقياس A562 نانومتر قيمة نقلت.
    5. حساب خط الخطي القياسية (A562 نانومتر مقابل تركيز جيش صرب البوسنة) الحصول معادلة انحدار لحساب البروتين عينة المحتوى مع قيمة562nm .
  5. استخدام 150 ميكروغرام من البروتين يعادل العينة المجففة بالتبريد للفضة تلطيخ أو 500 ميكروغرام من البروتين لأخذ تلطيخ، لدرجة حموضة pH المعطل تداولها 18 سم قطاع (IPG) تدرج 3-10 غير الخطية (NL).
    ملاحظة: قطاع IPG الجافة 0.5 مم سميكة و 3 ملم على نطاق، مع أطوال مختلفة بما في ذلك 7، 11، 13، 18، و 24 سم ونطاقات pH المختلفة بما في ذلك درجة الحموضة 4-5، 4-7 و 6-9 و 3-10 أما تدرج درجة حموضة الخطية أو غير الخطية. يجب احتواء المخزن المؤقت المستخدم IPG27،قطاع28.
  6. 1.6.Add 250 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت (م 7 اليوريا، وال م 2، 4% (w/v) الفصول، 100 مم DTT (إضافة قبل الاستخدام)، 0.5% v/v فارماليتي (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق).
  7. يبقى الحل أقل من 30 درجة مئوية، تليها فورتيكسينج لمدة 5 دقائق، سونيكاتينج لمدة 5 دقائق، والتناوب لمدة 50 دقيقة.
  8. إضافة 110 ميليلتر الإماهة المخزن المؤقت (م 7 اليوريا، وال م 2، 4% (w/v) الفصول، 60 ملم DTT (إضافة قبل الاستخدام)، 0.5% v/v IPG المخزن المؤقت (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق). Sonicate لمدة 5 دقائق. ثم قم بتدوير العينة لمدة 50 دقيقة، ودوامه لمدة 5 دقائق، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15,000 س ز.
  9. جمع المادة طافية (350 ميليلتر) ك حل عينة البروتين8.

2-ثنائي الأبعاد جل التفريد

  1. الضمنية (البعد الأول): تنفيذ الضمنية على نظام التركيز isoelectric كما هو موضح أدناه.
    1. إضافة 350 ميليلتر من الحل عينة البروتين في فتحه صاحب قطاع IPG 18 سم.
    2. وضعت 18 سم IPG قطاع جل جانب-لأسفل على الحل عينة البروتين (تجنب فقاعات).
    3. إضافة 3-4 مل الزيوت المعدنية لتغطية قطاع IPG.
    4. تجميع حامل قطاع IPG في سيستيمويث التركيز isoelectric نهاية مدببة على اللوحة الخلفية (+) ونهاية مربعة على اللوح الأمامي (−).
    5. ترطيب بين عشية وضحاها (ح ~ 18 في درجة حرارة الغرفة).
    6. تعيين معلمات الضمنية: الحد الأقصى الحالي 30 µA كل قطاع، 20 درجة مئوية؛ 250 الخامس، ح 1، 125 Vh، وخطوة والاحتجاز؛ 1,000 الخامس، ح 1، 500 Vh، التدرج؛ 8,000 V, 1 ح، 4,000 Vh، التدرج؛ 8,000 الخامس، ح 4، 32,000 Vh، وخطوة والاحتجاز؛ و 500 الخامس، ح 0.5، 250 Vh، والخطوة وعقد. فلتشغيل إلى إجمالي وقت ح 7.5 و 36,875 Vh.
    7. بعد الانبعاث، تأخذ بها كل قطاع IPG وإزالة الزيوت المعدنية الإضافية مع منشفة ورقية غير قابلة للذوبان. الآن التفاف القطاع في ورقة من البلاستيك، وتخزينها في −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تنظيف مع صاحب إيبجستريب تنظيف الحل حامل إيبجستريب وماء مقطر.
  2. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (البعد الثاني): أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في "نظام التفريد الخلية عمودياً"
    ملاحظة: يجب أن يكون كل حجم جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 255 × 190 × 1 مم.
    1. استخدام الناعم جل متعددة لتحويل 12% الصفحة حل المواد الهلامية. لصب 12% والهلام الصفحة، قم بالخطوات التالية.
      1. إضافة مل 270 من ddH2س، 150 مل 1.5 مل 180 من 40% (w/v) الاكريلاميد/بيساكريلاميدي الأسهم الحل م تريس-HCl (pH 8.8)، (فيها، 40% w/v الاكريلاميد و 1.38% w/v N، N '-ميثيلينيبيساكريلاميدي)، 3 مل من فوق كبريتات الأمونيوم 10%، و 150 ميليلتر من تيميد جعل الهلام الحل في كوب. المزيج بلطف وتجنب الفقاعات.
      2. صب جل الحل برفق في قاعة الإرسال المتعدد حتى ارتفاع جل المتوقعة (19 سم).
      3. فور إضافة حوالي 3 مل ddH2س على كل جل حل لتغطية المواد الهلامية. السماح للهلام بلمرة لحوالي 1 ساعة.
    2. إعداد ل 20 من المخزن المؤقت التفريد (25 مم تريس، الغليسيرين 192 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%). ملء الخزان المخزن المؤقت وحدة الفصل الكهربي مع هذا المخزن المؤقت.
    3. إخراج شرائط IPG مركزة من الثلاجة، وحجته الشرائط لمدة 10 دقائق من الهز برفق في 4 مل من تقليل المخزن المؤقت للتوازن (375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، اليوريا م 6، 2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، الجلسرين 20% (v/v)، 2% w/v DTT (إضافة قبل الاستخدام) ، وتعقب بروموفينول الأزرق).
    4. حجته لمدة 10 دقائق بلطف هزاز شرائط IPG انخفاض في المخزن المؤقت للتوازن الألكلة مل 4 (375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، اليوريا م 6، 2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، الجلسرين 20% (v/v)، إيودواسيتاميدي 2.5% w/v (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق).
    5. خلال التوازن هلام، تفكيك قاعة الإرسال المتعدد، وتأخذ بها كاسيت جل حل استعداد. شطف x 3 مع ddH2إزالة O. ddH الزائدة2س مع منشفة ورقية غير قابلة للذوبان، ووضع ستاندير هلام.
    6. شطف شرائط IPG متوازن مع المخزن المؤقت للتفريد، وإزالة السائل الزائد على سطح قطاع IPG بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان.
    7. وضع قطاع IPG على حل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام، وترك الجانب البلاستيك في قطاع IPG الاتصال بلوحة الزجاج أطول ونهاية أشار إلى اليسار.
    8. صب 3-4 مل من الساخنة 1% [اغروس] في الحزب الديمقراطي الصربي التفريد المخزن المؤقت (~ 80 درجة مئوية) بسرعة لختم قطاع IPG على رأس كل جل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ووضعت على الجانب العلوي من قطاع IPG وصولاً إلى الجزء العلوي من لوحة زجاج أقصر دون فقاعات ثم بلمرة لمدة 10 دقائق.
    9. إدراج كاسيت جل تجميعها رأسياً بين الحشايا البلاستيكية في النظام الكهربائي العمودي. وضع الجزء العلوي من الجل مع قطاع IPG بجوار الكاثود (−).
    10. ضبط مستوى المخزن المؤقت التفريد أن تزج في الكاسيت هلام.
    11. الاتصال وتعيين "وحدة" الإمداد/مراقبة السلطة في وضع الجهد المستمر، وتشغيل 200 الخامس لحوالي 370 دقيقة بينما رصد الصبغة.
    12. بعد تشغيل، تأخذ بها كاسيت جل من نظام التفريد، وإزالة الجل بلطف من الكاسيت هلام، تجنب تمزق الهلام، متبوعاً تلطيخ 2DE فصل البروتينات.
  3. تلوين فصل 2DE البروتينات
    1. تلوين الفضة
      1. نقل بلطف الهلام مع اثنين من الأيدي في علبة تحتوي على 250 مل من محلول التثبيت (الميثانول 50% (v/v) وحامض الخليك 5% (v/v))، وتهز برفق للهلام لمدة 20 دقيقة.
      2. تجاهل الحل وإضافة 250 مل ميثانول 50% (v/v) في العلبة وهزه برفق لمدة 10 دقائق.
      3. تجاهل الميثانول وإضافة 250 مل من ddH2س في الدرج. تهز بلطف لمدة 10 دقائق.
      4. بلطف يهز هلام لمدة 1 دقيقة في 250 مل من المخزن المؤقت للتوعية تتضمن ثيوكبريتات الصوديوم 0.02% (w/v)، وتجاهل السائل.
      5. بلطف يهز الهلام في 250 مل من ddH2س لمدة 1 دقيقة (كرر مرة أخرى). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      6. بلطف يهز هلام لمدة 20 دقيقة في حل رد فعل الفضي 250 مل (نترات الفضة 0.1% (w/v) مع 200 ميليلتر 37% (v/v) فورمالدهايد أضيف قبل الاستخدام).
      7. بلطف يهز الهلام في 250 مل من ddH2س لمدة 1 دقيقة (كرر مرة أخرى). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      8. اهتزاز هلام برفق في حل تطوير 250 مل (يضاف كربونات الصوديوم 3% (w/v) مع 100 ميليلتر 37% (v/v) فورمالدهايد قبل الاستخدام) حتى يتم الحصول على كثافة المرجوة لتلطيخ (عادة من 1-3 دقيقة)، ثم تجاهل السائل.
      9. بلطف يهز هلام لمدة 10 دقائق في 250 مل وقف الحل (حامض الخليك 5% (v/v)) وتجاهل السائل.
      10. بلطف يهز لمدة 5 دقائق في 250 مل من ddH2س وتجاهل السائل.
      11. ضع الجل في 250 مل تخزين حل والغليسيرول 8.8 في المائة عند 4 درجة مئوية.
    2. أخذ صبغة زرقاء رائعة
      1. إعداد أخذ تلطيخ الحل بتذويب أخذ الرائعة الأزرق G250 ز 0.3 وسلفات الأمونيوم ز 25، وحامض الفوسفوريك 25 مل في ddH2س ويصل إلى إجمالي حجم 200 مل. قبل الشروع في الاستخدام، إضافة الميثانول 50 مل.
      2. إضافة 250 مل أخذ تلطيخ حل للجل وهزه برفق في درجة حرارة الغرفة حتى واضحة تظهر بقع البروتين (~ 2-4 ح). تجاهل السائل.
      3. إضافة 250 مل من ddH2س ويهز ببطء لمدة 5 دقائق، ثم مرتين أكثر. تجاهل السائل.
      4. إضافة 250 مل من محلول ديستينينج (20% (v/v) الإيثانول) واهتز ببطء حتى يصبح عديم اللون تقريبا لون الخلفية، وتجاهل السائل.
      5. استبدال مع الحل ديستينينج جديدة عند القديم واحد هو الحصول على الظلام، وتجاهل السائل.
      6. إضافة 250 مل من ddH2س ويهز ببطء للحد الأدنى 5 تجاهل السائل.
      7. إضافة 250 مل من تخزين الحل (والغليسيرول 8.8 في المائة)، والحفاظ على 4 درجة مئوية.
  4. تحليل الصور التفريد هلام ثنائي الأبعاد
    1. رقمنة الهلام الملون مع الماسح ضوئي مسطح.
    2. إدخال الصورة في نظام تحليل الصور جل 2D.
    3. كشف وتحديد كل بقعة استخدام برمجيات تحليل صورة 2D جل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    4. تتطابق مع البقع بين مختلف المواد الهلامية.

3-تحديد البروتينات المفصولة 2DE مع مرض التصلب العصبي المتعدد

  1. إعداد مزيج الببتيد تريبتيك
    ملاحظة: ينبغي استخدام أنابيب سيليكونيزيد أو الاحتفاظ بها منخفضة وماصة نصائح لتجنب أي خسارة في البروتينات أو الببتيدات.
    1. فضة-هلام ديستينينج
      1. المكوس هلام البقع إلى 1.5 مل siliconized الأنبوبة، وتغسل في 500 ميليلتر ddH2س 6 مرات.
      2. وضع هلام غسلها في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد جديدة، وتخطر عليه إلى العديد من القطع الصغيرة (0.5-1 ملم3).
      3. ديستين قطعة جل في 20 ميليلتر من الحل ديستينينج الذي يمزج جزء من سيانيد البوتاسيوم 30 ملم وجزء من ثيوكبريتات الصوديوم 100 ملم (1:1) قبل استخدامها للسماح للون البنى تختفي (عادة 1-2 دقيقة). تجاهل السائل.
      4. تغسل القطع هلام مع 20 ميليلتر من ddH2س 5-6 مرات للسماح اللون الأصفر تختفي. تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      5. إضافة 20 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 200 ملم إلى القطع هلام، والبقاء ليغسل 20 دقيقة جل القطع مع ddH2س (20 ميليلتر، 1 مرة). تجاهل السائل.
      6. يذوي القطع هلام مع 30 ميليلتر الاسيتو الانيتريل مرتين على الأقل للسماح للقطع جل تتحول أبيض معتم، والفراغ-أجهزة الطرد المركزي الجافة لمدة 30 دقيقة.
    2. أخذ جل الأزرق الرائعة ديستينينج
      1. قص البقع جل في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد وتغسل مع 500 ميليلتر ddH2س 3 مرات على الأقل.
      2. وضع هلام غسلها في أنبوب siliconized 1.5 مل جديدة، وتخطر عليه إلى عدة قطع (0.5-1 ملم3) مع تلميح ماصة.
      3. ديستين الهلام في 50-100 ميليلتر ديستينينج الحل (1:1 v/v ميكس 200 ملم NH4HCO3 مع الاسيتو الانيتريل) تبعاً لحجم هلام، واحتضان في 37 درجة مئوية في حمام مائي. كرر وإضافة حل ديستاينينج جديدة حتى يختفي اللون (~ 1 ح). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      4. تغسل القطع جل مرة واحدة مع 20 ميليلتر ddH2o.
      5. يذوي القطع جل في 100 ميليلتر الاسيتو الانيتريل (مرتين على الأقل) للسماح للقطع جل تحويل معتم الأبيض.
      6. الفراغ الجافة لمدة 30 دقيقة.
    3. في جل التربسين هضم البروتينات في القطع هلام المجففة
      1. حل 20 ميكروغرام (833 pmol) من مسحوق التربسين المجففة بالتبريد في 100 ميليلتر من حمض الخليك 50 مم.
      2. تمييع 20 ميليلتر لحل التربسين (200 نانوغرام/ميليلتر) إلى 16 نانوغرام/ميليلتر مع ميليلتر 230 من بيكربونات الأمونيوم 50 مم.
      3. إضافة 20-30 ميليلتر (0.32 0.48 ميكروغرام) من الحل التربسين المخفف لكل أنبوبة تحتوي على قطع هلام المجففة. احتضانها ح 18-20 في 37 درجة مئوية في حمام الماء. واسمحوا أن الحل الوقوف عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. الطرد المركزي في الحل برفق سنكيت س. 10 في حمام مائي لمدة 5-6 دقائق عند 30 درجة مئوية وثم الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة.
      5. جمع المادة طافية يحتوي على خليط الببتيد تريبتيك إلى أنبوب siliconized 0.5 مل.
    4. تنقية خليط الببتيد تريبتيك مع C18 microcolumn.
      1. تغسل كل عمود C18 مع الاسيتو الانيتريل (10 ميليلتر، 5 مرات)، ومن ثم مع 50% الاسيتو الانيتريل (10 ميليلتر، 5 مرات).
      2. حجته مع حمض الخليك تريفلورو 0.1% (تفا) (10 ميليلتر، 5 مرات).
      3. "الماصة؛" العينة صعودا ونزولاً عن طريق عمود C18 مستعدة ل 15 مرة.
      4. تغسل العينة 2 x 10 ميليلتر 0.1% تفا.
        ملاحظة: يتم الاحتفاظ الببتيدات تريبتيك المنقاة في عمود C18.
      5. إضافة وحدة تخزين (6 ميليلتر) الحل (85% v/v acetonitrile/0.1% حمض الفورميك v/v) في أنبوب نظيف 0.5 مل سيليكونيزيد، "الماصة؛" هذا الحل بلطف وبطء صعودا وهبوطاً من خلال الخرز الببتيد-C18 ل x 10 ليغسل الببتيدات السندات إلى الحل، أيردري ، ومخزن (−20 درجة مئوية) لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد
    1. تحليل استخدام--مايكروسوفت "تحلان"
      1. إضافة 4 ميليلتر من 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v تفا لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي. تحميل 2 ميليلتر حله الببتيد تريبتيك الخليط على صفيحة استخدام وعلى الفور إضافة 2 ميليلتر من حل حمض а-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) يحتوي على 10 جرام/لتر في الاسيتو الانيتريل 500 مل/لتر 1 مل/لتر تفا، ثم أيردري.
      2. تحميل لوحة استخدام خليط الببتيد تريبتيك مع مطياف شامل استخدام MS.
        ملاحظة: يتم تعيين المعلمات الصك كوضع عاكس مع 20 كيلوفولت التعجيل بالجهد والأقطاب الإيجابية وتأخير ns 160 استخراج الوقت. وتكتسب كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع 200 طلقات الليزر مع طائفة من m/z 1,000 إلى 4,000 بعد المعايرة الخارجية مع الببتيد القياسية الجماهيري.
      3. استخدام برمجيات طيف-معالجة مرض التصلب العصبي المتعدد لمعالجة كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك تصحيح خط الأساس، وإزالة الضوضاء (5%)، وذروة ديسوتوبينج.
      4. تصحيح قائمة أسلحة من كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع إزالة تلويث الجماهير من التربسين ومصفوفة وكراتين والملوثات الأخرى غير معروف بالتوازي مع التجارب جل فارغة.
      5. إدخال قائمة الشامل المصوبة إلى بروتين على أساس تحلان البحث عن برنامج لتحديد البروتينات في قاعدة البروتين بروت السويسرية مع معلمات البحث التالية، بما في ذلك نوع البحث تحلان، البشرية، التربسين مع 1 كحد أقصى وغاب الانقسام، وثابت سيستين كارباميدوميثيل، الميثيونين متغير الأكسدة، مونويسوتوبيك، الببتيد التسامح الشامل 50 جزء من المليون، تهمة الببتيد الدولة (1 +)، وإشارة إلى الضوضاء (S/N) 5.0.
      6. تحديد البروتينات مع عشرات البروتين يعتد به إحصائيا، وفيها نقاط البروتين =-10 × log(p), حيث p هو احتمال أن المباراة الملاحظ حدث عشوائي.
    2. تحليل استخدام-MS/MS
      1. إضافة 4 ميليلتر من 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v تفا لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي. رصدت على استخدام 384-جيدا-طبق كل خليط الببتيد تريبتيك المنقي (0.5 ميليلتر)، رصدت فورا 0.5 ميليلتر من مصفوفة شكا المشبعة بنسبة 50% acetonitrile/0.1% تفا على رأس العينة الببتيد، وثم تجفف في الهواء.
      2. اسمحوا MS/MS استخدام-TOF-TOF يمكن إدارتها تلقائياً، استخدام طلقات الليزر 100 للحصول على واحد MS1 الطيف، و 6 تراكم تكرار MS1 الأطياف إلى واحد من الطيف MS1 الاصطناعية.
      3. تعيين 4 السلائف أكثر كثافة الأيونات من كل الطيف MS1 الاصطناعية لتحليل MS/MS. تكرار استخدام الليزر 100 طلقة لكل أيون السلائف اكتساب أحد MS/MS الطيف، وتتراكم 4 MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف إلى واحد من الطيف MS/MS الاصطناعية.
      4. استخدام البيانات MS/MS الاصطناعية للبحث عن البروتينات عن طريق بروتين MS/MS-تعتمد البحث عن البرامج مع المعلمات بما في ذلك "البحث عن أيون" MS/MS، قاعدة بشرية بروت السويسرية، التربسين بحد أقصى 1 الانقسام وغاب، كارباميدوميثيل الثابتة (ج)، ومتغير أكسدة (M)، وقيمة جماعية مونويسوتوبيك، الببتيد التسامح الشامل ± 100 جزء من المليون، وبلغة التسامح ± 0.7 الشامل دا.
      5. تحديد بروتين مع احتمال معتدا به إحصائيا استناداً إلى نقاط موس، ونقاط الأيونات =-10 × Log(P), حيث p هو احتمال أن المباراة الملاحظ حدث عشوائي.
    3. تحليل LC-ESI-MS/MS
      1. إضافة ميليلتر 6 من 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v حمض الفورميك لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي.
      2. استخدام نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) مقرونا تاين اليكتروسبراي (ESI) على الإنترنت--كتلة MS/MS مطياف مع برنامج إدارة الحصول على بيانات MS/MS لإدارة العملية برمتها.
      3. استخدام عمود C18 فخ (300 ميكرون الهوية × 5 مم الطول)، وعكس المرحلة C18 عمود (معرف x 15 سم طول 75 ميكرون) مع تدرج انفصال في المذيبات 98 ٪ (0.1% حمض الفورميك) والمذيبات 2% ب (0.1% حمض الفورميك في الاسيتو الانيتريل 100 ٪) لمدة 2 دقيقة ، 2 إلى 40 ٪ مذيب ب 45 دقيقة، والمذيبات ب من 40% إلى 95% لمدة 5 دقائق ومذيب 95% ب 10 دقيقة (ما مجموعة 65 دقيقة في 300 nL/دقيقة).
      4. تعيين وضع أيون إيجابية ووضع البيانات تعتمد على المسح التلقائي لاكتساب مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف، وتعيين التفكك الناجمة عن تصادم (CID) لتجزئة أيون.
      5. تعيين كل عملية مسح مرض التصلب العصبي المتعدد إلى مجموعة كتلة من m/z 350-1,800 مع قرار 100000 في m/z 400. إجراء الفحص للايونات معظم مكثفة 7 في مسح مرض التصلب العصبي المتعدد.
      6. البروتين استخدام MS/MS-على أساس البحث عن البرنامج الأول للبحث في قاعدة البيانات للتعرف على البروتينات.
        1. حدد قاعدة بيانات البروتين البشري.
        2. حدد التربسين مع واحد يسمح للانقسام وغاب عن الموقع.
        3. مجموعة الببتيد التسامح (± 10 جزء في المليون)، تفتيت أيون التسامح (±0.8 Da)، الببتيد كارباميدوميثيليشن المسؤول (2 + و 3 + و 4 +)، ثابتة في سيستين، والأكسدة متغير في الميثيونين.
        4. تعيين معدلات اكتشاف كاذبة (FDR) < 1%، وفقط من الببتيدات مع رتبة 1 مقبولة.
        5. تحديد البروتين مع PSM≥1 (النظام: العدد الإجمالي لتسلسل الببتيد التي تم تحديدها (النظام) للبروتين، بما في ذلك تلك المحددة redundantly) واثنين على الأقل من الببتيدات فريدة من نوعها للبروتين.
      7. أيضا، استخدام MS/MS-أساس البروتين برمجيات البحث الثاني للبحث في قاعدة البيانات للتعرف على البروتينات.
        1. تحويل ملف MS الخام إلى ملف.mgf.
        2. تحديد قاعدة بيانات البروتين البشري (uniprothuman_20161031.fasta التي تحتوي على تسلسلات 70940 وبقايا 23897047).
        3. حدد الهضم التربسين بحد أقصى 2 الانشقاقات الضائعة.
        4. تعيين ثابت كارباميدوميثيل (ج)، ديميداتيد متغير (NQ) وأكسدة (M)، السلائف أيون التسامح الشامل 10 أجزاء من المليون، ابنه أيون التسامح الشامل 0.8 دا، وذروة مونويسوتوبيك.
        5. تحديد البروتينات مع عتبة أهمية 0.05 و 2 على الأقل من الببتيدات فريدة من نوعها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

1. 2DE--استخدام MS تحلان: مع الإجراء التجريبي المبين أعلاه، تم استخراج ما مجموعة 150 ميكروغرام البروتينات من الأنسجة NFPA FSH-أعرب عن (أنثى، 50 عاماً، ACTH (-)، وهرمون النمو (-)، PRL (-)، وناحية اليسار (-)، FSH (+)، والهرمون (-)) وصفت مع 18 سم قطاع IPG (NL الأس الهيدروجيني 3-10) وهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تنسيق كبير، ثم تصور مع تلطيخ الفضة. حصلنا على نمط هلام 2DE الجيدة واستنساخه من NFPA أنسجة البروتين (الشكل 1)، مع م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

2DE، إلى جانب أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد بما في ذلك تحلان 2DE MS و 2DE--MS/MS، وقد استخدمت بنجاح في برنامجنا الطويل الأجل--استخدام البروتينات لدراسة البشرية NFPA البروتين الاختلافات والتباينات الشبكة الجزيئية للكشف عن الآليات الجزيئية و اكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة نفباس. 2DE المستندة البروتيوميات مقارنة مع إمكانية تكرار نتائج جيدة تلعب دوراً هاما في تحديد هوية NFPA البروتين الاختلافات9،،من1011،،من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.

شكر وتقدير

هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ)، والمنح من الصين "863" خطة المشروع (رقم المنحة 2014AA020610-1 إلى XZ) وأموال مستشفى إكسيانجيا "المواهب مقدمة" (XZ)، وفي هونان مؤسسة العلوم الطبيعية المقاطعات في الصين (رقم المنحة 14JJ7008 إلى XZ). الكتاب أيضا تعترف بالمساهمة العلمية للدكتور دومينيك م. ديسيديريو في مركز العلوم الصحية في جامعة تينيسي. X.Z. باستمرار نمواً وتستخدم أساليب 2DE--مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين الورم الحميد في الغدة النخامية بدءاً من عام 2001 وتصور المفهوم للمخطوطة الحالية وكتب وتنقيح المخطوط، تنسيق العمل ذات الصلة وكان مسؤولاً عن الدعم المالي والعمل المناظرة. وشارك Y.L. في مراجعة المخطوطة. وأي إتش شاركت في مجموعة من المراجع، ومراجعة المخطوطة. ووافق جميع المؤلفين المخطوط النهائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Ettan IPGphor 3 نظام التركيز المتساوي الكهربيGE Healthcare
إيتان DALTsix العجلات متعددة الهلامAmersham Pharmacia Biotech ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةنظام الرحلان الكهربائي العمودي
حامل شريط AmershamPharmacia Biotech ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
Ettan DALTsix العجلات متعددة الهلامAmersham Pharmacia Biotech ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةMultigel Caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, فوستر سيتي,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS مطياف الكتلة
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, الولايات المتحدة الأمريكيةESI-MS / MS مطياف الكتلة
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, Denmarkنظام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء
PepMap C18 عمود المصيدة  300 مو ؛ م معرف & مرات; طول 5 مم شركة ديونيكس ، سانيفيل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
RP C18 العمود75 & م معرف ، طول 15 سم ؛ Dionex Corp., Sunnyvale, CA, الولايات المتحدة الأمريكية
KimWipeKimvipe منشفة ورقية غير قابلة للذوبان
Watterمصنوعة من PURELAB أداة
Polytron Model P710 / 35 الخالطBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  هرقل ، كاليفورنيا2D هلام تحليل الصور البرمجيات
SEQUEST   ؛Thermo Proteome Discoverer 1.3 (الإصدار رقم 1.3.0.339)
DataExplore (الإصدار 4.0.0.0) البرمجياتلمعالجة الطيف
التميمةالبحث عن البروتين القائم على PMF    
التميمة/ MS المستندة إلى البروتين البرمجيات
Proteome Discoverer البرمجيات v.1.3 بيتاThermo Scientific
Xcalibur البرمجيات v.2.1MS / MS البيانات المكتسبة برنامج إدارة  
إصدار Uniprot 201410.1_HUMAN.fastaقاعدة بيانات البروتين البشري
SEQUEST (الإصدار رقم 1.3.0.339) برنامج البحث عن البروتين القائم على MS / MS I
MASCOT (الإصدار 2.3.02)  برنامج البحث عن البروتين القائم على MS / MS II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit   ؛Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo  فيشر سيانتيفك23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
أمونيوم بيرسولفاتAMRESCOM133
TrypsinPromega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكيةV5111
IPG عازلة درجة الحموضة 3-10 ، NLGE Healthcare17-6000-87
شريط جاف Immobiline درجة الحموضة 3-10NL ، 18 سمGE Healthcare17-1235-01
فليكس MS برامج برنامج برنامج MS

المراجع

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SDS PAGE
هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.