جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

ملخص

أورجانويدس الدماغي تمثل نظام نموذج جديد للتحقيق المبكر الدماغ البشري التنمية في المختبر. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لكفاءة توليد الظهرية متجانسة من نوع فوريبرين أورجانويدس من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، بما في ذلك الخطوات الحاسمة في توصيف والتحقق من الصحة.

الملخص

يتم توسيع عاليا قشرة البشرية ومعارض بنية معقدة مع مجالات وظيفية محددة، توفير وظيفة المخ أعلى، مثل الإدراك. الجهود الرامية إلى دراسة التنمية البشرية قشرة الدماغ حدت من توافر أنظمة نموذجية. ترجمة النتائج من دراسات القوارض إلى نظام الإنسان مقيد باختلاف الأنواع والدراسات المتعلقة بالانسجة البشرية الأولية تتعرقل بسبب عدم توافر الأنسجة، فضلا عن الشواغل الأخلاقية. وتشمل التطورات الأخيرة في تكنولوجيا الخلايا الجذعية (PSC) pluripotent البشري توليد ثلاثي الأبعاد (3D) التنظيم الذاتي أورجانوتيبيك ثقافة النظم التي تحاكي إلى بعض مدى الدماغ الإنسان-خاصة بتنمية، في المختبر. حاليا، تتوفر البروتوكولات المختلفة لجيل كامل الدماغ أو المخ-المنطقة أورجانويدس محددة. الطريقة لتوليد متجانسة واستنساخه من نوع فوريبرين أورجانويدس من فعل PSC (اللجنة التوجيهية)، الذي وضعنا سابقا، ووصف هنا، يجمع بين القدرة الجوهرية من PSC تنظيم ذاتي مع التمايز الموجهة نحو النسب نيوروكتوديرمال الأمامي ومصفوفة التضمين لدعم تشكيل نيوروبيثيليوم المستمر. وبشكل أكثر تحديداً، ويشمل هذا البروتوكول: (1) توليد المجاميع اللجنة التوجيهية، بما في ذلك تحويل المستعمرات اللجنة التوجيهية إلى ثقافة المتلاقية أحادي الطبقة؛ (2) تحريض نيوروكتوديرم الأمامي؛ (3) تضمين المجاميع نيوروكتوديرمال في سقالة مصفوفة؛ (4) توليد أورجانويدس فوريبرين-نوع من المجاميع نيوروكتوديرمال؛ (5) التثبيت والتحقق من نوع فوريبرين أورجانويدس. على هذا النحو، يوفر هذا البروتوكول نظام يسهل تطبيقها لتوليد الأنسجة القشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية الموحدة واستنساخه الهياكل في المختبر.

المقدمة

الدماغ البشري هو وضوح أحد الأجهزة الأكثر تعقيداً، وهي مسؤولة عن جميع قدرات الإنسان الفكرية. وبالتالي، فهم أعمق لنمو الدماغ الخاصة بالإنسان شرط أساسي لفهم قدرات الإنسان المعرفية. تقليديا، كالحيوانات المحورة وراثيا إلى الكائنات نموذج لدراسة تطور الدماغ. وقدمت هذه النماذج الأساسية ثاقبة المبادئ لنمو الدماغ. ونحن نعلم الآن أن سمة مشتركة لتنمية الدماغ في جميع الثدييات هي الرقصات دقيقة من انتشار السلف والخلايا العصبية الهجرة. ومع ذلك، هناك الاختلافات الهيكلية الهامة بين أدمغة الكائنات نموذج، مثل القوارض والبشر، ولا سيما في اللحاء الجديد. هي الآليات الرئيسية التي تم اقتراحها للمساهمة في تطور الرئيسيات القشرية زيادة انتشار الخلايا الجذعية والسلف وكذلك توليد خلايا إطلاق شعاعي الخارجي (أورجكس)، التي تم العثور عليها إلا نادراً جداً في القوارض^{1 ،،}من²³.

وتشمل أساليب لنموذج التنمية البشرية قشرة الدماغ توليد الخلايا المستمدة من PSC السلف تيلينسيفاليك وقشرة الدماغ إسقاط الخلايا العصبية كثقافات أحادي الطبقة. هذه موحدة التمايز البروتوكولين تكرار جوانب معينة من التنمية البشرية القشرية مثل الترتيب الزمني النمطية من الخلايا القشرية⁴. أنها، مع ذلك، تقصر عندما يتعلق الأمر خلاصة للعمليات الإنمائية من organogenesis مثل الزخرفة المكانية و morphogenesis. التطورات الأخيرة في بيولوجيا الخلايا الجذعية أدت إلى إنشاء ثقافات أورجانويد 3D من شركات الأمن الخاصة، التي هي ثورة البحوث التي يجريها في المختبر أورجانوجينيسيس البشرية. الاستفادة من القدرة الأمنية لتنظيم نفسها في هياكل أورجانوتيبيك، أورجانويدس المختلفة، التي تعكس الخصائص الهيكلية والوظيفية الرئيسية للأجهزة بما في ذلك الكلي والأمعاء والعين والدماغ قد أنشئت⁵. تتضمن هذه أورجانويدس متعددة المخططات الخلوية الخاصة بالجهاز، وتجميع وتنظيم مكانياً مشابهة جداً للأجهزة النامي في فيفو^5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، تشكيل خلية وعلاقة النسب ودراسات شبكة الجينات باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كشفت أن أورجانويدس المخ البشري الخص إخلاص الجوانب الرئيسية للتنمية البشرية اللحاء الجديد الجنين مثل برامج التعبير الجيني ^{7 , 8}-عيب رئيسي واحد، التي حالت دون تطبيقها واسعاً حتى الآن، كان، مع ذلك، اختلافات دفعة إلى دفعة كبيرة وعدم تجانس أورجانويد إلى أورجانويد⁹.

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنظام ثقافة أورجانويد نوع فوريبرين بسيطة وموحدة. الميزة الرئيسية لهذا النظام أنه كفاءة وتكاثر يولد المستمدة من PSC أورجانويدس الهوية تيلينسيفاليك الظهرية حصرية تقريبا. البروتوكول يستند إلى الأساليب المستخدمة في لدينا تقارير الخلية الأخيرة ورقة¹⁰. أنه يجمع بين قدرات التنظيم الذاتي إيبسكس التعريفي انتقائية من نيوروبيثيليوم القشرية، ويمكن أن تولد قوة الثقافات متجانسة من أوائل الأنسجة تيلينسيفاليك الظهرية في غضون 3 أسابيع. البروتوكول يستند إلى الإشارات سمد المبلغ عنها سابقا واستراتيجية تثبيط Wnt أن أدلة التفريق بين PSC نحو^11،النسب نيوروكتوديرمال الأمامي¹² في تركيبة مع مصفوفة التضمين، الذي وتعزز تشكيل هياكل نيوروبيثيليال الكبيرة والمستمرة¹³. أننا استخدمت بنجاح الأسلوب المبين في مختلف بنود اللجنة التوجيهية، مع العديد من الحيوانات المستنسخة للفرد. ونحن تبين أن هذا النظام مناسب للتطبيقات المتلقين للمعلومات التي يتم التجانس وإمكانية تكرار نتائج ذات أهمية كبيرة مثل مرض النمذجة. عند تطبيق البروتوكول على إيبسكس المستمدة من المرضى الذين يعانون تشوهات القشرية شديدة، تمكنا من الخص بصمات المرضية للمرض في المختبر وتحديد آليات جزيئية جديدة مما أدى إلى المظهرية تغيير¹⁰. ونحن نقترح أن البروتوكول وصف أورجانويد يمكن استخدامها لسد الفجوة بين الثقافات المستمدة من PSC أحادي الطبقة القشرية الاختزالية والدراسات في فيفو ، وأنه يمثل نظام موثوقة ومستقرة على أساس خلية نموذج لمحاكاة مبكرا التنمية البشرية القشرية في الصحة والمرض خارج جسم الإنسان.

البروتوكول

1-جيل مجاميع اللجنة التوجيهية

1. جيل ثقافات أحادي الطبقة خلية واحدة من مستعمرات [ايبسك]
   1. إعداد لوحة 6-كذلك استخراج (BME) مغلفة غشاء الطابق السفلي. ذوبان الجليد BME على الجليد في 4 درجات مئوية عن ح 2-3، وتمييع مع F12 المتوسطة ايجل تعديل الباردة دولبيكو (دميم-F12؛ 01:50 إضعاف) وتغطي اللوحة مع 1 مل/جيدا للحل BME المخفف، وتخزين اللوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   2. نضح المتوسطة ويغسل المستعمرات اللجنة التوجيهية سليمة من الآبار 2 على الأقل من صفيحة 6-جيدا مع 0.5 مم يدتا في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين قبل أن تفرخ المستعمرات مع الإيثيلين 0.5 ملم حمض (يدتا) في برنامج تلفزيوني لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). نضح حل يدتا وفصل المستعمرات بلطف بغسلها قبالة الجزء السفلي من الطبق مع 5 مل متوسطة دميم-F12. جمع لهم في أنبوب 15 مل وبيليه لهم بالطرد المركزي (4 دقيقة في س 1,200 ز في RT).
      ملاحظة: إيبسكس برمجتها من الخلايا الليفية المتاحة تجارياً تم استخدامها بنجاح¹⁰.
   3. نضح المادة طافية واحتضان المستعمرات اللجنة التوجيهية مع 500 ميليلتر من كاشف تفكك خلية لمدة 6 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   4. بيبيت تعليق الخلية عدة مرات برفق لأعلى وأسفل مع ماصة 1 مل اقتحام الخلايا المفردة كتل الخلايا المتبقية.
   5. إضافة 4 مل من دميم-F12 إلى تعليق خلية تمييع الكاشف الانفصال من الخلية.
   6. تدور الخلايا لأسفل في س 1,200 ز لمدة 4 دقائق في الرايت
   7. ريسوسبيند الخلايا في 2 مل من اللجنة التوجيهية المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكرومتر الخلايا Y-27632 والبذور في بئر واحدة للوحة 6-جيدا BME المغلفة.
      ملاحظة: استخدام المتوسط اللجنة التوجيهية المحددة في الجدول للمواد الثقافات اللجنة التوجيهية أحادي الطبقة خلية واحدة.
   8. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة مع اللجنة التوجيهية الطازجة المتوسطة تفتقر إلى Y-27632. من هذه النقطة، ما زالت الثقافة الخلايا، تغيير في المتوسط كل يوم حتى إيبسكس على روافد 100%. اعتماداً على خط الخلية وكونفلوينسي من الآبار الانطلاق، هذا سوف يستغرق ما بين 2-4 أيام.
   9. مرور المتلاقية مرة واحدة، إيبسكس. نضح المتوسطة وتطبيق 500 ميليلتر من كاشف الانفصال من الخلية في الخلايا.
   10. احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. روك بلطف لوحة لفصل الخلايا.
   11. تغسل الخلايا من البئر باستخدام 2 مل من دميم-F12 وجمعها في أنبوب 15 مل. إضافة دميم-F12 لإجمالي حجم 5 مل.
   12. وتدور أسفل الخلايا في س 1,200 ز لمدة 4 دقائق في الرايت نضح المادة طافية.
   13. بذور الخلايا في اللجنة التوجيهية المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكرومتر المغلفة Y-27632 في 1:2 بنسبة 1:4 على BME لوحة 6-جيدا (2 مل/البئر متوسطة).
   14. لا تزال ثقافة الخلايا لمدة 2-5 أيام، وتغيير اللجنة التوجيهية المتوسطة تفتقر إلى Y-27632 كل يوم. إيبسكس مرور المتلاقية مرة واحدة، (الخطوات 1.1.4-1.1.8).
       ملاحظة: الثقافة إيبسكس للممرات 2 على الأقل كأحادي الطبقة في الأجلين المتوسط واللجنة التوجيهية المحددة في الجدول للمواد قبل استخدامها لتوليد المجاميع اللجنة التوجيهية للسماح للخلايا لتتكيف مع الظروف الثقافة.
2. استخدام أحادي الطبقة اللجنة التوجيهية الثقافات عندما تكون روافد 70-90% لجيل المجاميع اللجنة التوجيهية.
   ملاحظة: اللجنة التوجيهية التي تتكيف مع الظروف الثقافة كما الخلايا المفردة أقل عرضه للتأكيد على أن يؤدي إلى موت الخلية أثناء إجراء الانفصال والتجميع. أحادي الطبقة اللجنة التوجيهية الثقافات تحتاج إلى عرض مورفولوجيا pluripotent نموذجية مع أي دليل على التفريق. اختبار الثقافات على أساس منتظم للتلوث مفطورة. تعمل فقط مع ثقافات خالية مفطورة اللجنة التوجيهية.
   1. نضح المتوسطة الثقافة من بئر واحدة للوحة 6-جيدا وتطبيق 500 ميليلتر من كاشف الانفصال من الخلية في الخلايا.
   2. احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. روك بلطف لوحة لفصل الخلايا.
   3. يغسل خلايا من البئر باستخدام 2 مل من دميم-F12 وجمعها في أنبوب 15 مل. إضافة دميم-F12 لإجمالي حجم 10 مل.
   4. لعد الخلايا، تأخذ 25 ميليلتر من تعليق خلية ومزجها مع 25 ميليلتر من تريبان الأزرق تمييز الخلايا الميتة. عد الخلايا الحية باستخدام غرفة لعد الأصوات.
   5. جمع ما يكفي من خلايا (خلايا 4,500 في اللجنة التوجيهية التجميعية) من تعليق خلية في أنبوب 15 مل.
   6. وتدور أسفل الخلايا في س 1,200 ز لمدة 4 دقائق في الرايت نضح المادة طافية.
   7. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة تخزين مناسبة للجنة التوجيهية المتوسطة وتستكمل مع 50 ميكرون Y-27632 للحصول على خلايا حية 4,500 الواحد 150 ميليلتر.
      ملاحظة: استخدام تركيزات عالية من Y-27632 (50 ميكرومتر) أمر حاسم لبقاء إيبسكس.
   8. لوحة 150 ميليلتر في كل جيدا من منخفضة-مرفق 96-جيدا U-أسفل لوحة ووضعه في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: عند إنشاء اللجنة التوجيهية المجاميع، نعتبر أن أورجانويدس على الأقل 6 ضرورية لمراقبة الجودة في يوم 20 (انظر القسم 5).

2-تحريض نيوروكتوديرم الأمامي

1. ترصد عن كثب تغيرات مورفولوجية المجاميع اللجنة التوجيهية كل يوم تحت المجهر زراعة الأنسجة باستخدام 4 X أو X 10 قوة العدسة. الاحتفال في يوم 1، الخلية المجاميع مع حدود واضحة. ما زالت الثقافة اللجنة التوجيهية المجاميع في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون₂.
   ملاحظة: عدد معين من الخلايا الميت/حسنا أمر طبيعي ولن تؤثر على الجيل أورجانويد.
2. تغذية المجاميع اللجنة التوجيهية بدءاً من يوم 2 ومستمرة مع كل يوم بلطف يسفط حوالي 2/3 المتوسط دون إزعاج المجاميع الخلية في الجزء السفلي. إضافة ميليلتر 100 إضافية للجنة التوجيهية المتوسطة تفتقر إلى Y-27632.
   ملاحظة: في غضون 4-6 أيام سيتم المجاميع خلية 350-450 ميكرون في القطر ويحمل حواف ناعمة.
3. في هذه المرحلة، المجاميع تجمع الخلية مع قطع 100 ميليلتر ماصة تلميح إلى صحن منخفض-مرفق 6 سم (بحد أقصى 20 المجاميع/طبق) في المتوسط التعريفي القشرية التي تحتوي على دميم-F12 مع N2 الملحق (1: 200)، الملحق B27 (1: 100)، والسكر (0.2 مغ/مل)، دوري الأدينوزين الادينوسين (مخيم؛ 0.15 ميكروغرام/مل)، والأحماض الأمينية 0.5% غير ضروري (نا)، 1% ل-alanyl-L-الجلوتامين، الهيبارين (10 ميكروغرام/مل)، ومركبات LDN-193189 (180 نانومتر)، A83-01 (500 نانومتر)، ومثبط Wnt استجابة-1 (IWR-1) (10 ميكروغرام/مل). تغذية المجاميع الخلية عن طريق تغيير المتوسطة القشرية التعريفي 3 أيام بعد نقلها إلى الطبق 6-سم.
4. تراقب عن كثب التغييرات الشكلية خلال الاستقراء القشرية تحت المجهر زراعة الأنسجة باستخدام عدسة سلطة X 4.
   ملاحظة: بعد 4-5 أيام في المتوسط التعريفي القشرية، ينبغي أن تبدأ حواف الخلية الأرقام الإجمالية سطع على السطح، مما يشير إلى التمايز نيوروكتوديرمال. في هذه المرحلة، تبرز المنظمة شعاعي من ظهارة بسيودوستراتيفيد. انتقل إلى القسم 3 لتضمين المجاميع الخلية في مصفوفة BME.

3-تضمين نيوروكتوديرمال المجاميع في سقالة مصفوفة

1. ذوبان الجليد BME على الجليد في 4 درجات مئوية عن 2-3 h. الكوة BME غير مخفف بكميات كافية.
2. إعداد ورقة بارافين بلاستيك فيلم لعملية الدمج. قص البارافين البلاستيك الفيلم باستخدام مقص العقيمة في 4 سم × 4 سم كبيرة القطع، ووضع قطعة من البلاستيك البارافين الفيلم أكثر علبة فارغة 100 ميليلتر نصيحة 100 ميليلتر نصائح، والضغط مع إصبع القفاز بحيث يتم إنشاء الدمامل الصغيرة في ورقة البارافين البلاستيك فيلم (دي 1 مبلى/خلية الإجمالية المطلوبة). تنظيف الفيلم البارافين البلاستيك مع الإيثانول 70% ويتهددها ذلك مع الأشعة فوق البنفسجية (الطاقة: 15 واط، والطول الموجي: 435 نانومتر) تحت مقاعد البدلاء معقمة مغلقة لمدة 30 دقيقة.
3. نقل تجميع كل خلية بنقرة واحدة ورقة الفيلم البارافين البلاستيك باستخدام تلميح قطع 100 ميليلتر مع 1.5-2 ملم في القطر. في حالة أن الخلية اثنين المجاميع تنصهر فيها، ولا تفصل بينهما ولكن نقلها معا بنقرة واحدة.
4. بلطف نضح المتوسط المحيطة بالمجاميع الخلية باستخدام تقطيعه 100 ميليلتر ماصة تلميح.
   ملاحظة: كن حذراً لا لامتصاص الركام الخلية إلى معلومات سرية، كما أن هذا سيضر المجاميع.
5. إضافة 40 ميليلتر من BME غير مخفف لتجميع كل خلية.
6. موقف إسقاط كل خلية التجميعية في منتصف BME استخدام ماصة ميليلتر تقطيعه 100 نصيحة.
   ملاحظة: كن حذراً جداً عدم إلحاق الأذى نيوروبيثيليوم النامية مع طرف ماصة.
7. نقل ورقة الفيلم البارافين البلاستيك باستخدام الملقط العقيمة إلى 10 سم طبق بيتري (أو آخر طبق ثقافة الخلية كافية) وضع الطبق في الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة للسماح BME على ترسيخ بعناية.
8. وفي الوقت نفسه، تحضير طبق منخفضة-مرفق 6 سم يحتوي على 5 مل متوسطة التعريفي القشرية.
9. بعد البلمرة BME، إزالة قطرات تحتوي على مجاميع الخلايا من ورقة البارافين البلاستيك الفيلم. تشغيل الفيلم البارافين البلاستيك عبر استخدام الملقط العقيمة والضغط بلطف المجاميع الخلية إلى إمالة قليلاً (حوالي 30 °) صحن منخفض-مرفق 6 سم حتى القطرات تسقط الورقة الفيلم البارافين البلاستيك. نقل أقصى قدر من 16 خلية المجاميع إلى طبق 6 سم واحد.
10. مواصلة لاحتضان المجاميع الخلية عند 37 درجة مئوية.

4-جيل أورجانويدس فوريبرين-نوع من المجاميع نيوروكتوديرمال

1. يوم واحد بعد تضمينها في مصفوفة BME، مكان أطباق الثقافة أورجانويد على شاكر ثقافة خلية هزاز مع زاوية إمالة 5 º وفي الدقيقة 14، مثبتة في حاضنة ثقافة خلية.
2. رصد أورجانويدس كل يوم. تطوير هياكل تشبه حلقة نيوروبيثيليال متجانسة تدريجيا بعد تضمينها في مصفوفة BME.
3. عند رؤية هياكل حلقة نيوروبيثيليال، تغيير المتوسط إلى متوسط التمايز أورجانويد التي تحتوي على دميم-F12 مع N2 الملحق (1: 200)، B27 الملحق (1: 100)، والسكر (0.2 مغ/مل)، معسكر (0.15 ميكروغرام/مل)، 0.5% نيا، 1% ل-alanyl-L-الجلوتامين، الأنسولين (2.5 ميكروغرام/مل)
4. استبدال متوسطة التمايز أورجانويد كل 3-4 أيام حتى يتم التوصل إلى النقطة الزمنية التمايز المرجوة. قم بإصلاح أورجانويدس (انظر القسم 5).
   ملاحظة: في بعض الأحيان، قد يحمل النسيج براعم أنسجة شفافة بصريا دون هياكل حلقة. على الرغم من أن هذه ليست مثالية، وهذا لا يؤثر على تطوير هياكل القشرية. يمكن مثقف في أورجانويدس في أورجانويد التمايز المتوسطة لمدة 40 يوما. للثقافة تمديد فترات (40-100 يوم) متوسطة التمايز أورجانويد يمكن أن تستكمل مع 01:50 BME زيادة تعقيد الأنسجة ومع بدنف وجدنف للسماح للخلايا العصبية البقاء على قيد الحياة ونضوج^14،من¹⁵.

5-التثبيت والتحقق من فوريبراين من نوع أورجانويدس

1. للتحقق من الصحة، جمع أورجانويدس 6 في يوم 20. استخدام أورجانويدس 3 لعزل مرناً وتحاليل PCR. نقل أورجانويدس 3 إضافية للوحة 24-كذلك يتضمن برنامج تلفزيوني استخدام تلميح ماصة قطع 1 مل مع فتح من 3-3.5 مم للتثبيت وتحليلات immunocytochemical متسلسلة.
2. أغسل أورجانويدس مرتين من قبل يسفط في برنامج تلفزيوني بعناية والاستعاضة عنه ببرنامج تلفزيوني جديد باستخدام ماصة 5 مل. إصلاح أورجانويدس لمدة 15 دقيقة في البرد 4% بارافورمالدهيد (PFA) (الرقم الهيدروجيني 7.4).
   تنبيه: حذار أن منهاج العمل مسرطن بشري معروف. ويجب أن يتم كل العمل في غطاء الأبخرة كيميائية ارتداء القفازات النتريل. ينصح بارتداء نظارات الأمان. والفورمالديهايد يمكن أن يسبب ضررا لا يمكن إصلاحه للقرنية.
3. نضح منهاج عمل بيجين بعناية واغسل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
4. استبدال برنامج تلفزيوني بمحلول سكروز 30% (wt/المجلد، المستندة إلى برنامج تلفزيوني) وتخزين العينات في 4 درجات مئوية للسماح أورجانويدس ليذوي. ويمكن تخزين أورجانويدس لمدة تصل إلى 7 أيام حتى مزيد من المعالجة.
5. قبل يوم واحد بعد التثبيت، وصمة عار أورجانويدس المجففة بإضافة تريبان الأزرق في حوالي الساعة 01:50 لمدة 10 دقيقة للسماح للتصور من أورجانويدس أثناء إجراء كريوسيكتيونينج.
6. إعداد متوسطة التضمين التي تحتوي على السكروز 10%، 7.5 ٪ الجيلاتين wt/المجلد في برنامج تلفزيوني، والحارة إلى 75 درجة مئوية حتى تصبح سائلة.
7. يستعاض عن 30% من محلول السكروز بتضمين المتوسطة ونقل لوحة 24-جيدا على لوحة تدفئة (60 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة حجته في أورجانويدس.
8. تغطية الجزء السفلي من قوالب التضمين مع طبقة من تضمين وسائل الإعلام ووضعها على الجليد بلمرة.
9. نقل أورجانويدس من لوحة 24-جيدا إلى تضمين قوالب التي تحتوي على المتوسط التضمين مبلمرة، إضافة المتوسطة تضمين إضافية في الأعلى بحيث أورجانويدس مغطاة، ووضع القالب بسرعة في جليد جاف إيثانول 100% تجميد (حمام يجب أن تكون درجة الحرارة بين-30 إلى-50 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة على الأقل الصدمة-تجميد.
10. ضع القالب مع الملقط على الثلج الجاف مؤقتاً وأما مخزن لهم الشروع في-80 درجة مئوية، أو مباشرة مع كريوسيكتيونينج.
11. أورجانويدس كريوسيكشن في 20 ميكرون سمك وجمع المقاطع على شرائح المجهر، والحفاظ على تتبع ترتيب المقاطع على الشرائح (امتصاص متسلسلة). يسمح بوجود مقاطع الجافة على الشرائح لعدة ساعات، قبل تخزينها في-80 درجة مئوية، أو القيام مباشرة immunocytochemical تلطيخ.

النتائج

بروتوكول أورجانويد موحدة من نوع forebrain الموصوفة هنا عادة ما يولد الثقافات أورجانويد عالية متجانسة تقريبا حصرا الظهرية الهوية القشرية من إيبسكس البشرية في غضون 20 يوما زراعة (بروتوكول المبينة في الشكل 1 A). ينصح بإجراء عدة خطوات مراقبة الجودة أثناء الوقت من البروتوكول، والمعرفة هنا ك: 'انتقال' (مواصلة عملية التمايز) و 'المحظورة' (الثقافات دون المستوى الأمثل، فمن المستحسن إنهاء الدفعة) (الرقم 1 ). من المستصوب أيضا توثيق كل خطوة من خطوات مراقبة الجودة أيضا بأخذ الصور والملاحظات.

الخطوة الأولى الحاسمة في توليد فوريبراين من نوع أورجانويدس أن تبدأ مع الثقافات اللجنة التوجيهية عالية الجودة. من المهم أن إيبسكس لا تحتوي على كسور أكبر من الخلايا المتمايزة. فقط استخدام الثقافات اللجنة التوجيهية التي تقدم كأحادي الطبقة متجانسة من خلايا غير متمايزة في السكان الانطلاق (الأرقام 1،، ج). وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان أن تبدأ مع عدد الخلايا المعطاة للجنة التوجيهية التجميع. ينبغي إجراء أول عملية تفتيش مفصلة للمجاميع اللجنة التوجيهية في اليوم 2. في هذه المرحلة، المجاميع ينبغي شكلت براعم الخلية المدمجة مع حواف ناعمة ('انتقال') بينما ينبغي أن تكون المجاميع الظهور غير النظامية أو المجاميع مع تجاويف المهملة ('المحظورة') (الأرقام 1، ه). ينبغي أن تجري مراقبة الجودة والخطوة التالية في يوم 10 من البروتوكول. في هذه النقطة الزمنية، المجاميع الخلية يجب أن تظهر الأنسجة ناعمة وشفافة بصريا على السطح الخارجي يمثل الاستقراء نيوروكتوديرم ('انتقال') بينما تشير إلى عدم وجود مثل هذه الأنسجة التعريفي العصبية دون المستوى الأمثل ('المحظورة') (الأرقام 1F، ز ). فقط تلك المجاميع التي تظهر على سطح شفاف (الشكل 1و) ينبغي أن تكون جزءا لا يتجزأ في مصفوفة BME. وبمجرد تضمين، ستضع أورجانويدس القشرية هياكل تشبه حلقة نيوروبيثيليال المستمر، الذي سوف يتوسع بسرعة. تحليل كفاءة التعريفي القشرية في يوم 15 ويوم 20 بالتحقيق في ما إذا كان أورجانويدس المتقدمة الأديم الظاهر العصبي مستقطب كما هو موضح في الشكل 1ح، ي ('انتقال'). في حالة أن أورجانويدس لم تتطور هذه البراعم نيوروبيثيليال ('المحظورة' كما هو موضح في الشكل 1الأول، ك)، حاسمة بمراجعة مراقبة جودة تنفيذ خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. عندما عقب أحكام البروتوكول، ودفعات أورجانويد موحدة جداً سوف يتم إنشاء (الأرقام 2 أ، ب)، التي سوف تظهر ≥ 90% من التجانس في الاستقطاب تشكيل الأديم الظاهر العصبي داخل وعبر دفعات (الشكل 2-ج). خطأ شائع يؤدي إلى كفاءة متغير تكوين الأديم الظاهر العصبي مستقطب لزيادة عدد خلية البداية لتجميع اللجنة التوجيهية، أو الثقافات ذات النوعية المتدنية لتبدأ اللجنة التوجيهية مثل مفطورة الملوثة الثقافات أو الثقافات التي تحتوي على التمييز بين الخلايا.

ينبغي أن تجري عملية مفصلة التحقق من هوية الظهرية تيلينسيفاليك أورجانويدس الذي تم إنشاؤه في يوم 20. تحقيقا لهذه الغاية، ينبغي إصلاح أورجانويدس 3 والمستخدمة لتحليل الفلورة. الحلقات نيوروبيثيليال الطبقية (الشكل 3أ) التعبير عن علامة الخلايا الجذعية العصبية Sox2 (الشكل 3ب ود)، علامات forebrain Pax6 و Otx2 (3 أرقام، هاء)، وعلامة القشرية الظهرية Emx1 (الشكل 3 F). هذه الحلقات القشرية تتميز كذلك تعريب قمي ن-كادهيرين وزوى--1 (الأرقام 3، ح)، منطقة البطين إطلاق شعاعي الخلية (فرجك)-مشتقة من ميكروتوبولي، التي تمتد من قمي إلى الجانب القاعدي (هياكل الشكل 3 وأنا)، ويقع قمي تقسيم الخلايا التي وصمة عار إيجابية فيمنتين فوسفوريلاتيد (ففيمنتين، الرقم 3ي). موت الخلية قد تكون موجودة داخل هياكل أورجانويد. المبرمج وسط طبيعي ولا يؤثر على تنمية الأنسجة القشرية. بالإضافة إلى ذلك، أورجانويدس 3 ينبغي أن تستخدمها لتقييم تجانس بروتوكول تحليل التعبير الجيني. إظهار أورجانويدس فوريبرين من نوع التعبير عن علامات forebrain الظهرية (FoxG1، Otx2، Emx1)، بينما التعبير عن midbrain (FoxA2، Pax5) وعلامات هيندبرين (HoxB2، HoxA4، HoxB4، HoxB6) لا يمكن كشفها (الشكل 3ك).

يمكن استخدام مجموعات أورجانويدس مراقبة الجودة لمختلف التطبيقات مثل التحليلات للطائرة شعبة من الخلايا الدبقية شعاعي قمي. تحقيقا لهذه الغاية، فإننا نقترح إجراء تلطيخ مزدوجة باستخدام الأجسام المضادة ضد فيمنتين ف و Tpx2 (الشكل 3ي). ففيمنتين هو فوسفوريلاتيد من CDK1 أثناء الانقسام ويقع في النواة، مما يسجل جميع الأنوية في المرحلة الانقسامية¹⁶. Tpx2 هو بروتين microtubule المرتبطة التي يمكن تصور المغزل التفتلي والعمليات قمي خلال الهجرة النووية إينتيركينيتيك^17،18. باستخدام هذه العلامات، ثلاثة جوانب لشعبة فرجك يمكن من حيث المبدأ تحليلها: (ط) ما إذا كانت الخلية شعبة يأخذ مكان في الجانب قمي، (الثاني) ما إذا كانت الطائرة شعبة عمودي محاذاة (انقسام الخلايا المتماثلة تشير إلى)، (أفقي أو مائل تشير إلى انقسام الخلية غير المتناظر) microtubule تنظيم مراكز عما إذا كان تشكيل عادة إلى السطح قمي، و (ثالثا).

أورجانويدس يمكن أن تكون متباينة أيضا في هياكل المنظمة وطبقية الأنسجة القشرية أكثر تعقيداً. تتألف منطقة البطين (VZ)-، ومنطقة سوبفينتريكولار الداخلي والخارجي (SVZ)، فضلا عن لوحة القشرية (CP)-مثل منطقة الهياكل القشرية داخل اليوم 35 ± 2 أورجانويدس. داخل VZ وسفز الداخلي والخارجي، يمكن تحديد فرجكس وفروعه الوسيطة (IPs) وخلايا تذكرنا أورجكس. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة تشكيل الأولية لحاء الطبقات في منطقة مثل CP مع الخلايا العصبية القشرية العميقة التعبير عن Tbr1 و Ctip2 داخل والخلايا العصبية القشرية العليا معربا عن Satb2، فضلا عن الإعراب عن رلين الخلايا في المناطق الخارجية¹⁰.

الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي لبروتوكول أورجانويد والتوضيح 'انتقال' ومعايير 'المحظورة'. (أ) نظرة عامة التخطيطي للبروتوكول. CI المتوسطة: المتوسطة القشرية التعريفي؛ مؤتمر نزع السلاح: التمايز القشرية متوسطة. (ب–ج) صورة أمثل 90% اللجنة التوجيهية المتلاقية أحادي الطبقة ثقافة (ب) وثقافة اللجنة التوجيهية غير مناسبة نستعرض التمايز (ج). (د–ه) تجميع اللجنة التوجيهية أمثل في حجم وكثافة الخلايا، ومظهر سطح (د) وهما الخلية 'المحظورة' مجاميع العارضة أما خلية قطع غيار تجاويف (ه، مجموع العلوي) أو عدم انتظام حواف (ه، مجموع أقل) مدة يومين وبعد تجميع الخلية. (و–ز) إزالة المجاميع الخلية العارضة شفافة وناعمة الحواف (F) ومجاميع الخلية التي تفتقر إلى بصري (ز). الخط الأصفر هو تصور مجال الاهتمام. (ح–ك) أورجانويد أمثل مع حلقات نيوروبيثيليال المستمر (ح، ي) وأورجانويد التي أخفقت في وضع إشعاعيا نظم نيوروكتوديرم (أنا، ك) تصويرها في يوم 15 واليوم 20، على التوالي. مقياس الحانات، ج ب 500 ميكرومتر؛ د-ك 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : التجانس وإمكانية تكرار نتائج بروتوكول أورجانويد من نوع فوريبرين- (–منأب) صور مشرقة الحقل الممثل أورجانويدس من دفعة واحدة في اليوم 15 (A) ويوم 26 (ب). (ج) إجراء تحليلات كمية من أورجانويدس في يوم 20. تم قياس كمية أورجانويدس الذي عرض على السطح الخارجي نيوروبيثيليوم، يمكن التعرف عليها في مشرق الميدان الأنسجة سطحية بصريا واضحة مع حدود واضحة وأدلة عن البنية الخلوية شعاعي (n = 3 كل سطر اللجنة التوجيهية مع أورجانويدس على الأقل 16 الواحدة التجربة). مقياس الحانات وألف-باء: 500 ميكرومتر. أشرطة الخطأ ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : التحقق من فوريبرين من نوع أورجانويدس في يوم 20- (أ–ي) وصف إيمونوسيتوتشيميكال أورجانويدس. تنظيم أورجانويدس في نيوروبيثيليال متعددة الحلقات (A, كونتيرستينيد مع DAPI). طبقات خلايا التنظيم داخل إكسبريس الحلقات نيوروبيثيليال علامة الخلايا الجذعية العصبية Sox2 (ب، د)، علامات forebrain Pax6 (ج، د) و Otx2 (E)، فضلا عن علامة forebrain الظهرية Emx1 (F). الهياكل القشرية حلقة عرضت حزام مفرق ملتصقة غرامة الجانب قمي على الأكثر مع تراكم N-كادهيرين (ز) والبروتين أوككلودينس زونا 1 (زوي-1؛ ح)-ميكروتوبولي "رجكس البطين" تمديد الشبكات (الملون أسيتيلاتيد α-tubulin، ميلان-الحوض) من قمي إلى الجانب القاعدي من بنيات حلقة (أنا). تقع الخلايا المتكاثرة معربا عن ففيمنتين (ففيم) على سطح قمي. ملطخة مغزل الانقسامية التي Tpx2. الممثل أعلى تكبير الصورة من رأسي وطائرة شعبة أفقية تظهر على اليمين (ي). (ك) RT-PCR تحليل لعوامل النسخ الخاصة بكل منطقة في يوم 20 من مجموعتين من مجموعات مستقلة من أورجانويدس المستمدة من الخطوط التوجيهية المختلفة 2. إف ب: مراقبة المخ الجنين؛ AB: مراقبة المخ الكبار. مقياس الحانات، ميكرون 200 ألف-دال؛ ﻫ-الأول 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حانمه	تمييع
Sox2	1-300
Pax6	1-500
Otx2	1-500
Emx1	1-50
ن-كادهيرين	1-500
زوي-1	1-100
ففيمنتين	1-1000
Tpx2	1-500
أسيتيلاتيد α-tubulin	1-500
Alexa488 المضادة لمرض التصلب العصبي المتعدد	1-1000
Alexa488 المضادة للميزانية العادية	1-1000
Alexa555 المضادة لمرض التصلب العصبي المتعدد	1-1000
Alexa555 المضادة للميزانية العادية	1-1000

الجدول 1: الأجسام المضادة لمراقبة الجودة من أورجانويدس في يوم 20.

التمهيدي	التسلسل
Otx2 إلى الأمام	تجكاجججتكتكتجتجات
Otx2 عكس	أججتكاجاجكاتجاككا
FoxG1 إلى الأمام	كككتكككاتتكتجتاكجتت
FoxG1 عكس	كتجكجكتكتاجاجات
Emx1 إلى الأمام	أجاكجكاجتجاجتجتج
Emx1 عكس	كاجكاجكاجكتكتكك
FoxA2 إلى الأمام	ككاككاككاككككاكاااتج
FoxA2 عكس	تجكاكاككجتكتككككااجت
Pax5 إلى الأمام	أجاتجككجكتجاتجاجتاك
Pax5 عكس	تجاجاجتجاتكاجكتج
HoxB2 إلى الأمام	تتاجككجتكجكتاجاج
HoxB2 عكس	كجاتاجكتجاجاكاجاج
HoxA4 إلى الأمام	تكاجكاااتجكككتكتكت
HoxA4 عكس	تاجككاجكتككاكاجتكت
HoxB4 إلى الأمام	أكاكككجكتاكااتجاج
HoxB4 عكس	جكاكجااجاتجاججاجاج
HoxB6 إلى الأمام	جاكتجاجاجكجاكتكاك
HoxB6 عكس	كتججاتكاججاجتكتكا
18s إلى الأمام	تككتجاككجكجكاج
عكس 18s	جككجكاتكجككجتكج

الجدول 2: تسلسل التمهيدي لتعريف التعبير الجيني والتمهيدي.

المناقشة

أورجانويدس المخ تمثل أداة قوية لدراسة الدماغ البشري التنمية في المختبر كما أنها توفر خلفية الأنواع ذات الصلة وترتيب الخلايا في سياق أنسجة ثلاثية الأبعاد المعقدة. ومع ذلك، هي سد الفجوة بين نماذج حيوانية غير البشرية وتقنيات استزراع خلية أحادي الطبقة ثنائي الأبعاد البشرية الاختزالية. ومع ذلك، التطبيقات الخاصة بهم تتعرقل بسبب نقص في إمكانية تكرار نتائج⁹. قمنا بتطوير بروتوكول أورجانويد من نوع فوريبرين، الذي يتغلب على تقلب عينة إلى عينة كبيرة من خلال الجمع بين قدرات التنظيم الذاتي للجنة التوجيهية الانقياد للزخرفة العوامل. على وجه التحديد، وجمعت إيبسكس لتعزيز التنظيم الذاتي، وبعد ذلك تحول دون TGF-ß/سمد إشارات إلى تعزيز التمايز اللحاء الظهرية بتعريض الثقافات للسجناء (LDN-193189) و TGF-β في النوع الأول من مثبطات مستقبلات (A83-01). بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق مركب يعوق مسار Wnt (IWR) لمنع بوستيريوريزيشن. خلافا للبروتوكولات أورجانويد الدماغي 'الجوهرية'¹⁹، التي تستند إلى التجميع الذاتي دون رقابة خارجية مما أدى إلى أورجانويدس الدماغ غير متجانسة بل ونستعرض الاختلافات دفعة كبيرة (تقاس بالكفاءات الاستقطاب الأديم الظاهر العصبي تشكيل¹⁵)، ينشئ البروتوكول الموصوفة هنا تكاثر متجانسة محددة فوريبراين أورجانويدس من إيبسكس البشرية.

يمكن أن تستخدم هذه أورجانويدس من نوع فوريبرين لمجموعة متنوعة من التطبيقات مثل الدراسات النمائية، دراسات تطورية بما في ذلك الدراسات وظيفة الجينات، المرض النمذجة، وربما الأغراض العلاجية واختبار المخدرات. بيد أن البروتوكول الأكثر ملاءمة لدراسة جوانب التنمية البشرية القشرية المبكر. على سبيل المثال أننا استخدمنا أورجانويدس من نوع فوريبرين لدراسة الجوانب الخاصة بالإنسان للسلوك فرجك. وبشكل أكثر تحديداً، كانت موجهة التغييرات الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بشكل حاد من ليسينسيفالي، تشوهات القشرية بشرية تميزت غياب قريب طي القشرية،. يمكن أن تكون على غرار جوانب معينة فقط من هذا المرض في الفئران كما الدماغ الماوس بطبيعة الحال ليسينسيفاليك. عند تطبيق نظام أورجانويد ليسينسيفالي إيبسكس المستمدة من المريض، يمكننا موثوق الخص الجوانب الخاصة بالإنسان للمرض وتحديد الآليات الكامنة. وبشكل أكثر تحديداً، يمكن أن نظهر أن أورجانويدس المستمدة من المريض تظهر انخفاضا كبيرا في حجم الناجمة عن التحول من متماثل لانقسام الخلية غير متماثل من فرجكس. رمز التبديل هذا كان مرتبطاً بتغييرات في تنظيم شبكة microtubule فرجكس، وحدوث اضطراب في الهندسة المعمارية لمكانة VZ وغيرت التعبير عن جزيئات التصاق الخلايا، مما يؤدي إلى تنشيط البصر من N-كادهيرين/بيتا-كاتينين مما يشير إلى المحور¹⁰. ملاحظة: اقترح بيتا-كاتينين-تعتمد على تنظيم أوضاع شعبة فرجك أن يكون الإنسان على حدة كما overexpression من بيتا-كاتينين في الفئران يؤدي إلى التوسع في قشرة عرضية والقشرية في وقت لاحق للطي²⁰. وهكذا، تبرز البيانات المتوفرة لدينا أن النظام أورجانويد من نوع فوريبرين ويمثل أداة واعدة لدراسة الجوانب الخاصة بالإنسان للتنمية القشرية المبكر في المختبربطريقة قابلة للقياس.

تحديا رئيسيا في المستقبل الحفاظ على تجانس أورجانويدس عبر فترات ممتدة من الوقت بغية تحقيق تعمل الخلايا العصبية أكثر نضجاً. وهذا قد يتحقق بواحد أو أكثر من الإجراءات التالية: السقالات تطبيق العائمة استزراع أورجانويدس في نظام مفاعل حيوي¹⁴،¹⁵، المكمل متوسطة التمايز مع نمو العصبية، أو عوامل بقاء الخلايا العصبية. وأخيراً، إلى زيادة التحكم في تعقيد الدماغ قد يتحقق بالصمامات أورجانويدس من نوع فوريبراين مع أورجانويدس الدماغي هوية إقليمية مختلفة^،من²¹إلى²².

أخذت معا، يتيح البروتوكول أورجانويد forebrain من نوع المعروضة هنا أداة بسهولة التطبيق ويمكن الاعتماد عليها لتوليد الهياكل القشرية المبكر في المختبر. يعطي البروتوكول يثير الأنسجة القشرية المبكر جداً متجانسة عبر الخطوط التوجيهية المتعددة، ويمكن أن تستخدم لتوليد موثوق الأنسجة القشرية الخاصة بالفرد. وهكذا، هذا النظام مناسبة خاصة للتطبيقات التي تتطلب درجة عالية من التجانس وإمكانية تكرار نتائج مثل النمذجة المرض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
A83-01	StemGent	130-106-274	500 نانومتر
B27 مكمل	جيبكو	17504-044	1 إلى 100
مستخلص الغشاء القاعدي (مثل Geltrex)	Gibco	A14132-02
أحادي الفوسفات الأدينوزين الدوري (cAMP)	سيجما ألدريتش	A9501	0.15 & جم / مل
كاشف تفكك الخلايا (TrypLE Express)	غرفة عد 12605028
مثل فوكس روزنتال	كارل هيشت	40449001
د-جلوكوز	كارل روث	HN06.3	0.2 مجم / مل
DMEM-F12 L-Glutamin	Gibco
(Tissue-Tek Cryomold)	ساكورا فينيتيك	4565
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك	سيجما ألدريتش	E6511	0.5 ملم & nbsp ؛
الجيلانتين	سيجما ألدريتش	G1890
الهيبارين	سيجما ألدريتش	H3149-25KU	10 ميكروغرام / مل
مثبط استجابة WNT (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug / mL
الأنسولين	Sigma-Aldrich	91077C	2.5 & micro ؛ جم / مل
IPSC متوسط للثقافات أحادية الطبقة (Pluripro)	أنظمة توجيه الخلايا	MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax)	Gibco	35050038	1٪
منخفض الالتصاق 6 سم لوحات	Labomedic	2081646L
ألواح منخفضة الالتصاق 10 سم	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 نانومتر
N2 مكمل	غذائي جيبكو	17502-048	1 إلى 200
أحماض أمينية غير أساسية	جيبكو	11140035	0.50٪
بارافورمالدهيد	سيجما ألدريتش	P6148	4.00٪
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	جيبكو	14190144
فيلم بارافين بلاستيكي (بارافيلم) العلامة	التجارية GMBH + CO KG	701606
مثبط ROCK Y-27632	أنظمة توجيه الخلايا	SM02-100	5 & micro ؛ م أو 50 & M
السكروز	Sigma-Aldrich	S7903
أنابيب 15 مل	Corning Life Sciences	734-0451
شرائح المجهر مثل Superfrost Plus Microscope	Slides Thermo Scientific	4951PLUS4
زراعة الأنسجة 6 لوحة بئر	Falcon	734-0019
زراعة الأنسجة 24 لوحة بئر	Falcon	734-0949
Trypan Blue stain	Gibco	15250-061
لوحة معطف دهني بئر 96 بئر A-U96	Amsbio	AMS.51011610
الأجسام
Sox2	R & أنظمة D	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R & D Systems	ab9566
Emx1	Sigma	HPA006421
N-cadherin	BD	610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentin	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetylated &alpha & -tubulin	NEB / CS	5335
Alexa488 مكافحة مللي ثانية	Invitrogen	A11001
Alexa488 مضاد rb	Invitrogen	A11008
Alexa555 مضاد مللي ثانية	Invitrogen	A21424
Alexa555 مضاد لروبوليدة	الروبوت Invitrogen	A21429