مقالة منهجية

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

DOI:

10.3791/56784

⸱

ديسمبر 12, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences and Craniofacial Development, New York University College of Dentistry, 2Rheonix, Inc., 3Department of Medicine, New York University Langone School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، يصف لنا تقنية لاكتشاف الببتيدات زيكا تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها مع ريادلي للأمراض المعدية الناشئة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[ميكروارس] هضميد عالي الكثافة السماح الفرز لأكثر من ستة آلاف الببتيدات على شريحة مجهرية معيار واحد. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لاكتشاف المخدرات وتحديد الهدف العلاجي، ووضع التشخيص. نقدم هنا، بروتوكول اكتشاف محددة Zika الفيروسات (زيكف) التشخيص الببتيدات استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. طباعة عينة مصل الإنسان التحقق من صحة للإصابة زيكف كان المحتضنة مع ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على بروتين زيكف كامل ترجمة فريدة من نوعها 3,423 15 من مخلفات الخطي من الأحماض الأمينية (أإ) مع تداخل بقايا 14-aa مكررة. تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة داخل نفس الصفيف، اكتشفنا الببتيدات التي تربط غلوبيولين مناعي M (IgM) والأجسام المضادة "ز الغلوبولين المناعي" (IgG) في مصل الدم. واختيرت هذه الببتيدات لمزيد من التحقق من صحة التجارب. في هذا البروتوكول، يصف لنا الاستراتيجية المتبعة لتصميم ومعالجة وتحليل ميكرواري ببتيد عالي الكثافة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشخيص الفيروس (زيكف) Zika استناداً إلى الأعراض السريرية يمثل تحديا نظراً لأنها تشاطر نواقل، والتوزيع الجغرافي، والأعراض بحمى الضنك وداء شيكونغونيا الإصابة بالفيروس1. نظراً للخطر لنتائج الحمل السلبية في النساء المصابات زيكف أثناء الحمل، من المهم التمييز بين الفيروسات 3. على الرغم من أن اختبارات التشخيص الجزيئي الحالية محددة، أنها مفيدة فقط في الدم أو اللعاب خلال فترة قصيرة نسبيا من الإصابة الحادة2،3. الاختبارات المصلية ضرورية للتشخيص خارج هذه الفترة الأولية من الإصابة4.

تطوير زيكف المقايسة المصلية محددة يمثل تحديا لسببين: أولاً، ليست معروفة حاليا المستضدات Zika يستجيب جهاز المناعة البشري؛ وتسلسل الأحماض الأمينية فلافيفيروسيس الثاني، وحفظت حمل جسم ه. وكان هدفنا لاكتشاف فريد زيكف الببتيدات محددة لاستخدامها في تشخيص. وضعت نهج مختلفة للشاشة الببتيد مكتبات تغطي كامل البروتينات بما في ذلك بالعاثية، البكتيرية، وعرض سطح الخميرة5،،من67،،من89، 10. كان لدينا استراتيجية لاستخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة التي تسمح بالفحوص المصلية سريعة وغير مكلفة في الفائق11،12 ، وبعد ذلك يمكن استخدام الببتيدات التي تم تحديدها لتحسين الحالية المصلية فحوصات للكشف عن الإصابة زيكف.

ويتيح هذا البروتوكول اكتشاف الببتيدات Zika تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة (الشكل 1). وأنتج ميكرواري الببتيد عالي الكثافة باستخدام تكنولوجيا الطباعة الليزر الببتيد. تسلسل البروتين زيكف أسرة تتألف من بقايا الأحماض الأمينية 3,423 استناداً إلى سلالة بولينيزيا الفرنسية (بنك الجينات: KJ776791.2)، تمت طباعته على شريحة زجاج قياسية في كتل من بقايا خطي 15 مع تداخل 14 مخلفات الأحماض الأمينية في تكرار إجمالي 6,846 الببتيد البقع. بالإضافة إلى أسرة Zika بروتين تسلسل الببتيدات، يستخدم ميكرواري هيماغلوتينين إنفلونزا الببتيدات (ها) للضوابط الداخلية.

زيكا التحقق من صحة إيجابية المصل العينة التي تم الحصول عليها من مركز ادسورث (ألباني، نيويورك)، استخدمت لتحديد محددة غلوبيولين مناعي M (IgM) والببتيدات رد الفعل "ز الغلوبولين المناعي" (IgG). بعد حضانة مع العينة بين عشية وضحاها، ميكرواري ملطخة بجسم مترافق fluorochrome ثانوي (IgM المضادة الإنسان أو الإنسان المضادة IgG)، وحلل على ماسح ضوئي ميكرواري. التحديد الكمي لكثافة بقعة والشرح الببتيد أجرى مع برمجيات خاصة المقدمة من نفس الشركة المصنعة ميكرواري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه البيانات هي جزء من دراسة البحوث الجارية في "كلية جامعة نيويورك لطب الأسنان"، وأقرها "مجلس المراجعة المؤسسية" نيويورك جامعة كلية الطب، الكندي # H10-01894. وكانت العينات السريرية المستخدمة في هذه الدراسة المحددة دي العينات المستخدمة سابقا للتشخيص، ومع الإذن من "مركز ادسورث نيويورك الدولة وزارة" الصحة، ألباني، نيويورك.

1-تركيب زيكف الكثافة الببتيد ميكرواري الشريحة في "علبة حضانة" محددة

  1. التعامل مع الشرائح الزجاجية من الحواف باستخدام قفازات خالية من مسحوق. أبعاد الشريحة الزجاجية 75.4 مم من 25.0 مم و 1 مم سميكة. وضع الشريحة في علبة حضانة مع السطح ميكرواري مواجها لأعلى.
  2. ضع الجانب اللامع الختم تواجه هبوطاً على سطح ميكرواري المطبوعة. لضمان وضع جيد، تتداخل الثقوب المسمار الختم والصفيحة القاعدية.
  3. ضع الجزء العلوي من العلبة على الختم لإنشاء دائرة ميكرواري.
  4. تأمين الشريحة في العلبة بتشديد على قدم المساواة الاتجار واحداً تلو الآخر باليد في نمط تناوب بدءاً من أعلى اليسار يليه اليمنى السفلي. ضع غطاء علبة حضانة.

2-كشف التفاعل الخلفية: تلطيخ ميكرواري مع الأجسام المضادة الثانوية

ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (المخازن المؤقتة القياسية وحظر، والأجسام المضادة الثانوية المخفف) في ركن الغرفة ميكرواري.

  1. احتضان ميكرواري مع عازلة قياسية (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 0.05% 20 توين، ودرجة الحموضة 7.4، التي تمت تصفيتها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) (مجموع حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
  2. إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري. تعبئة أصحاب الشريحة فارغة مع شرائح فارغة لمنع كسر الشريحة ميكرواري.
  3. كتلة ميكرواري مع المخزن المؤقت حظر (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) لمدة 60 دقيقة في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
  4. إزالة المخزن المؤقت حظر بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  5. احتضان ميكرواري مع الجسم المضاد الثانوي، الإنسان المضادة IgM fluorochrome مترافق، المخفف 1: 5,000 (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري) في تلطيخ المخزن المؤقت (10% حجب المخزن المؤقت في المخزن المؤقت القياسية) مدة 30 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري في 140 دورة في الدقيقة.
  6. إزالة الأجسام المضادة الثانوية يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  7. أغسل ميكرواري 3 x, 1 دقيقة لكل غسل مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  8. تزج الشريحة 2 x إلى مخزن مؤقت غمس طازجة (1 مم تريس، ودرجة الحموضة 7.4), (إجمالي حجم 200 مل).
  9. الجافة في ميكرواري بعناية، لحوالي 1 دقيقة، قبل يسفط السوائل الزائدة بعناية فائقة من الأعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة. تحليل الشريحة في قارئ ميكرواري الماسح ضوئي.

3-التعرض ميكرواري استضافة المصل

تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة تحت ظروف المختبر السلامة، السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2) بسبب طبيعة عينات المصل المعدية المحتملة. العمل في إطار "الدرجة الثانية" سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC).

  1. إلغاء تنشيط عينة المصل في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 16,000 لمدة 5 دقائق في13من 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (تلطيخ والمخزن المؤقت القياسية والمصل المخفف) في ركن الغرفة ميكرواري.
  2. تمييع عينة المصل في المخزن المؤقت المصبوغة بدءاً بإضعاف (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري) 1:1,000. يبقيه في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. احتضان ميكرواري مع المخزن المؤقت المصبوغة (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري) لمدة 15 دقيقة في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
  4. إزالة المخزن المؤقت المصبوغة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  5. احتضان ميكرواري مع عينة المصل المخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
  6. إزالة عينة المصل المخفف بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  7. أغسل ميكرواري 3 x, 1 دقيقة لكل غسل مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميكروليتر/ميكرواري في RT على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.

4-تلوين مع الأجسام المضادة الثانوية والأجسام المضادة لعنصر التحكم المسمى

ملاحظة: استخدم ماصة إيداع الحلول (المخازن المؤقتة الموحدة والثانوية المخفف وتسمية الأجسام المضادة) في ركن الغرفة ميكرواري.

  1. تضعف جسم الثانوية في المخزن المؤقت المصبوغة.
    ملاحظة: استخدام الإنسان المضادة IgM fluorochrome مترافق جسم أو الإنسان المضادة IgG fluorochrome جسم مترافق في إضعاف 1:5,000 (الحجم الإجمالي ل 2,000 ميليلتر/ميكرواري) في المخزن المؤقت المصبوغة.
  2. ميكس عنصر تحكم تسمية جسم (مكافحة [مونوكلونل]-مترافق fluorochrome هكتار) في إضعاف 1:1,000 (إجمالي حجم 2 000 ميليلتر/ميكرواري) في تلطيخ المخزن المؤقت مع الأجسام المضادة الثانوية تضعف سابقا في تلطيخ المخزن المؤقت.
  3. احتضان مع ميكرواري مدة 30 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة.
  4. إزالة المزيج المخفف الثانوية والأجسام المضادة للتسمية يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.
  5. أغسل x 3 مع المخزن المؤقت القياسية (إجمالي حجم 2,000 ميليلتر/ميكرواري). كل غسل لمدة 1 دقيقة على شاكر مداري 140 لفة في الدقيقة. بعد كل غسل، إزالة المخزن المؤقت القياسية بواسطة يسفط مع ماصة من زاوية الدائرة ميكرواري.

5-ميكرواري المسح الضوئي

  1. تزج الشريحة 2 x إلى المخزن غمس الطازجة (1 مم تريس، درجة الحموضة 7.4) (إجمالي حجم 200 مل).
  2. الجاف في ميكرواري بعناية، حوالي 1 دقيقة، بواسطة يسفط بعناية فائقة من الأعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة.
  3. مسح ميكرواري اتباع التعليمات من الماسح الضوئي. ضع الشريحة على الماسح الضوئي مع السطح المطبوع مواجها لأعلى.
  4. إنشاء مشروع جديد وقم بتحديد منطقة المسح الضوئي. تعيين معلمات الماسح الضوئي ك: القرار: 21 ميكرومتر، كثافة لكل 700 و 800 نانومتر القنوات: 7.0، المسح الجودة: المتوسطة والإزاحة: 0.8.
  5. اقتناء وحفظ الصورة الخام المسح الضوئي كتنسيق ملف TIFF رمادي 16-بت.

6-ميكرواري تحليل استخدام برامج محددة

  1. قم بفتح الصورة الخام (صورة TIFF). فتح ملف الشبكة الصفيف.
  2. محاذاة إلى الشبكة الصفيف لمسح الصورة مع مفاتيح السهم الماوس أو لوحة المفاتيح الخاصة بالكمبيوتر.
  3. حدد "التحديد الكمي للتحديد" في برنامج محدد، الذي يقوم بإنشاء ملف قراءات تحتوي على كثافة إشارة لكل بقعة وقيمة أساسية، وتسلسل الببتيد المقابلة.
    ملاحظة: هذا الملف الناتج يمكن أيضا استيراد إلى برنامج جدول بيانات لتحليل إضافي والرسوم البيانية.

7-ميكرواري التخزين

  1. تخزين ميكرواري مختومة في الظلام في 4 درجات مئوية تحت غاز الأكسجين الحر النيتروجين أو الأرجون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إظهار النتائج المتحصل عليها باستخدام البروتوكول هو موضح في الشكل 2 و الرقم 3. ولوحظت لا تفاعلات الخلفية عندما قبل تلطيخ ميكرواري مع الثانوي الإنسان المضادة IgM (البيانات لا تظهر). تلطيخ مع الإنسان المضادة IgM المتقارن أسفرت عن العديد من المجالات أعلاه خلفية كثافات الفلورية الخضراء، التي تشير إلى ربط هذه الببتيدات مع IgM في عينة مصل المضيف (الشكل 2). مفتش الكشف (إشارة حمراء الأسف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتصميم بروتوكول استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على تسلسل البروتين فيروس زيكا كامل (سلالة بولينيزيا الفرنسية). ميكرواري تم تصنيعها من قبل الطباعة الببتيدات 3,423 مختلفة الخطية المتداخلة. وكان 15 من الأحماض الأمينية كل الببتيد ومتنوعة من بقايا واحد فقط من جارتها الأقرب في التسلسل (أي، تداخل بقايا 14). على الرغم من أن يمكن طباعة التداخل أقصر، رسم الخرائط حانمه أكثر دقة مع تداخلات أطول. وطبع كل الببتيد في تكرار زيادة الموثوقية.

من الضروري أن تبدأ العملية تلطيخ ميك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدعم الحالي من قبل منحة ملحق إداري SBIR (بحوث الابتكار الأعمال الصغيرة) من NIDCRR44 DE024456. منح منحة NIDCR فيروس نقص المناعة البشرية التي تطورت من أصل NIDCR U01 DE017855 لوضع تشخيص نقطة الرعاية المؤكدة لفيروس نقص المناعة البشرية. ونعترف Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) سيلك امتنان للمساعدة التقنية والدعم الكريم. ونشكر أيضا جامعة نيويورك Langone المركز الطبي للي كو "أوديسي التصوير النظام".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PEPperCHIP مخصص الببتيد MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001مخصص الببتيد micarray: تحتوي المصفوفة الدقيقة الخاصة بنا على تسلسل بروتين فيروس زيكا بالكامل
علبة حضانة PEPperCHIP 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
طقم تلطيخ PEPperCHIP (680 نانومتر) (مضاد للHA ، وضع العلامات على DyLight)PEPperPRINTPPC.037.002
محلل PepSLidePEPperPRINTPSA.004.001ترخيص مجاني لمدة 14 يوما لنظام التشغيل Windows
Rockland BlockingBuffer RocklandMB-070
IgM المضاد للإنسان (سلسلة mu) DyLight 800Rockland609-145-007
IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
جهاز شاكر مداريIKAMTS 2/4 شاكر
رقمي أدوبي المصورأدوبي
دلتاغرافريدروكس
ميكروتيتر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748(2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
  15. Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IgM IgG

مقالات ذات صلة