مقالة منهجية

القياس الكمي لبروتين اميلويد السلائف γ-سيكريتاسي-بوساطة والانقسام الشق في لوسيفراس يستند إلى الخلية مراسل منصات المقايسة

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

يناير 25, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

أننا قد ولدت بنجاح فحوصات محددة الركازة γ-سيكريتاسي اثنين. كلا فحوصات يستند إلى الخلية المعروضة هنا مصممة لقياس الأنشطة الانزيمية γ-سيكريتاسي عن طريق إخراج الصحافيين لوسيفراس اليراع.

الملخص

وقد وضعنا على زوج من فحوصات الجينات مراسل يستند إلى الخلية قياس كمي الانقسام γ-سيكريتاسي من ركائز متميزة. هذه المخطوطة يصف الإجراءات التي يمكن استخدامها لرصد الانقسام γ-سيكريتاسي-بوساطة من التطبيق--C99 أو الدرجة، واستخدام نظام مراسل لوسيفراس اليراع يحركها المروج Gal4. ووضعت هذه فحوصات ستابلي المشترك ترانسفيكتينج الخلايا HEK293 مع الجينات مراسل يحركها Gal4 لوسيفراس وأما الجزء الطرفي ج Gal4/VP16-معلم للتطبيق (التطبيق--C99؛ CG الخلايا)، أو Gal4/VP16-معلم الدرجة-ΔE (NΔE؛ خلايا الحرس الوطني). استخدام هذه الاختبارات مراسل في نفس الوقت، وقد أثبتنا أن المانع ErbB2، CL-387,785، تفضيلي يمكن قمع انشقاق γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 في الخلايا الفريق الاستشاري، ولكن لا NΔE في خلايا الحرس الوطني. الردود التفاضلية التي أظهرتها الخلايا الفريق الاستشاري، والحرس الوطني، عندما تعامل مع CL-387,785، تمثل سمة مفضل المغيرون γ-سيكريتاسي، وهذه الردود في تناقض صارخ مع عموم-تثبيط γ-سيكريتاسي الناجمة عن ضابت. لدينا دراسات توفير دليل مباشر على أن أنشطة γ-سيكريتاسي تجاه ركائز مختلفة يمكن أن تكون متباينة في سياق خلوية. قد تكون هذه الاختبارات الجديدة وبالتالي أدوات مفيدة في اكتشاف الأدوية لتحسين العلاجات الإعلانية.

المقدمة

ويعتقد أن السبب الرئيسي في نيوروديجينيريشن في أدمغة المرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر (AD)1oligomeric أشكال اميلويد-بيتا (Aβ). الببتيدات Aβ تنتجها الانقسام التدرجي لبروتين اميلويد السلائف (APP)، أولاً ب β-سيكريتاسي ثم γ-سيكريتاسي2. في العقد الماضي، ركزت النهج العلاجي تجاه معاملة الإعلان على منع Aβ الإنتاج3. معظم الدراسات ركزت على أما زيادة النشاط α-سيكريتاسي، الذي يمكن أن يحول دون الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق ومما خفض إنتاج Aβ، أو تثبيط الأنشطة γ-سيكريتاسي β-و/أو4. ولسوء الحظ، تثبيط غير انتقائية نتائج سيكريتاسيس β أو γ في الآثار الجانبية التي لا يمكن تجنبها التي سبب التدخل مع أداء الأخرى ركائز الفسيولوجية سيكريتاسي β و γ5،6. وأفادت الدراسات الأخيرة فيما يتعلق بمثبطات γ-سيكريتاسي، اكتشاف عدد من المغيرون الكيميائية والجينية التي يمكن أن تنظم إنتاج Aβ أثناء ممارسة آثار لا تذكر على تجهيز أساسي γ-سيكريتاسي-بوساطة من الدرجة7 ،،من89،10،11،12، إلا أن العلاجات الناجحة لم توضع بعد. وهكذا، كذلك مبررة شاشات منهجية لاكتشاف رواية المعدلات الوراثية والكيميائية التي قد تعدل بشكل انتقائي γ-سيكريتاسي-بوساطة تجهيز التطبيق.

من المعروف أن تهزم أكثر من 90 من البروتينات المختلفة ترتكز على غشاء γ-سيكريتاسي. بين ركائز هذه هي الدرجة، ونشاطها أمر حاسم لتحديد مصير الخلية والتمايز خلال التنمية13. تحوير بشكل انتقائي التطبيق γ-سيكريتاسي-حفز المعالجة في الغياب التأثير على درجة تجهيز ستكون ضرورية للتقليل إلى أدنى حد الآثار الجانبية المتعلقة بالشق من مثبطات γ-سيكريتاسي، وهذه الانتقائية ويعتقد أن عامل أساسي الذي سوف إملاء فعالية بيولوجية المغيرون γ-سيكريتاسي المحتملة للمعالجة المزمنة للإعلان. وقد كان هناك عدد من مشتقات أريلسولفوناميدي، مثل GSI-953 (بيجاسيستات)، وخدمات إدارة المباني-708163 (أفاجاسيستات)، التي وجدت لمعرض تثبيط قوية وانتقائية γ-سيكريتاسي14،15. دراسة سابقة أظهرت أنه يمكن ملاحظة التفاضلية تثبيط الانقسام γ-سيكريتاسي التطبيق ودرجة استخدام مقايسة كمية على أساس أليسا في تركيبة مع فيفو التحقق من استخدام الزرد16. وعلاوة على ذلك، أنشئت نماذج التحليل يستند إلى الخلية لمعالجة انتقائية الركيزة المحتملة γ-سيكريتاسي نحو التطبيق والدرجة17،18. استخدام بروتوكولات مماثلة لتلك الموصوفة هنا، لقد اكتشفنا مؤخرا فئة جديدة من (د)-ليوسيناميديس أن تعدل أظهرت الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق مع الانتقائية تجنيب حز19. معا، هذه المجموعة من الدراسات يوفر دليلاً لمفهوم دعم الفكرة القائلة بأن الانتقائية الركازة/توافر γ-سيكريتاسي يمكن أن تخضع للتحوير الكيميائي والتحقق التجريبي. ومع ذلك، هذه المنابر المقايسة غالباً ما تعتمد على قراءات الإنتاجية منخفضة نسبيا والنهج ذات العمالة الكثيفة التي قد لا تفي بالمعايير الصناعية لبرامج اكتشاف المخدرات.

ونحن قد ولدت مؤخرا فحوصات الجينات مراسل لوسيفراس يستند إلى الخلية التي يمكن أن تحدد كمياً نشاط الحفاز γ-سيكريتاسي نحو اثنين من ركائز متميزة والجزء الطرفي ج حمض 99 الأمينية للتطبيق (التطبيق--C99) وفي خارج الخلية حذف المجال الشق الببتيد (NΔE). وقد استخدمت على نطاق واسع كركائز مباشرة من γ-سيكريتاسي في فحوصات مختلفة التطبيق--C99 و NΔE. لتوليد فحوصات الجينات مراسل لوسيفراس متجانسة ومتسقة للانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 أو NΔE، نحن إنشاء خط الخلية مستقرة المستمدة من HEK واحد (CG) مؤثرا يعبر عن Gal4 اليراع يحركها مروج لوسيفراس مراسل ( Gal4-Luc) والتطبيق--C99 Gal4/VP16-معلم الانصهار البروتين (C99-GV). وبالإضافة إلى ذلك، أنشأنا آخر خط الخلية مستقرة المستمدة من HEK (الحرس الوطني) مؤثرا يعبر عن لوك Gal4 و NΔE Gal4/VP16-معلم (NΔE-GV). باستخدام هذه الاختبارات رواية الركيزة الخاصة γ-سيكريتاسي، نقدم الآن طريقة لتقدير وتميز نشاط الحفاز γ-سيكريتاسي تجاه ركائز متميزة (التطبيق--C99 في الخلايا CG)، أو NΔE في خلايا الحرس الوطني. وعلاوة على ذلك، صممت فحوصات محددة الركازة γ-سيكريتاسي أن تفضي إلى منصات فحص محتوى عالية. هذه الاختبارات التي تم إنشاؤها حديثا γ-سيكريتاسي يمكن أن يمهد لاكتشاف المغيرون رواية γ-سيكريتاسي التي يمكن أن تحسن الوظائف المعرفية بقمع إنتاج Aβ دون التماس تثبيط الشق غير مرغوب فيه لعلاج الجيل المقبل للإعلان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-قياس "إشارات مراسل لوسيفراس"، والتي تناظر الانقسام γ-سيكريتاسي للتطبيق--C99 أو NΔE

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة أوصاف مفصلة لتوليد CG ونغ خلايا20،21.

  1. بذور الخلايا نغ أو CG (20، 000 خلايا/جيدا) على ميكروبلاتيس 96-جيدا في وحدة تخزين نهائي 200 ميكروليتر/بئر المتوسطة النمو التي تتألف من تعديل النسر المتوسطة (دميم) بالإضافة إلى 10% الجنيني البقري المصل دولبيكو (FBS)، 5 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين، 250 ميكروغرام/مل المضادات الحيوية (مثل ، زيوسين)، و 200 ميكروغرام/مل هيجروميسين باء
    1. حساب الخلايا التي تحتوي هيموسيتوميتير.
    2. نقل ميكروبلاتيس هوميديفيد CO2 حاضنة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إزالة 100 ميكروليتر من متوسط النمو من كل بئر.
  3. إضافة 100 ميكروليتر/جيدا للنمو المتوسط الذي يحتوي على 2 ميكروغرام/مل التتراسيكلين مع أي 0.2% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، 2 ميكرومتر CL-387,785، أو 2 ميكرومتر N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine تي-بوتيليستير (ضابت)، أو المتصلة بمثبطات ErbB1/ErbB2.
  4. احتضان تعامل الخلايا CG أو الحرس الوطني في ميكروبلاتيس في 37 درجة مئوية ح 24.
  5. إزالة 150 النمو ميكروليتر/البئر متوسطة من ميكروبلاتيس.
  6. إضافة كاشف الإنزيم ميكروليتر/بئر لوسيفراس 50 (يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد).
  7. نقل ميكروبلاتيس إلى قارئ ميكروسكوبية التﻷلؤ.
    1. الحفاظ على ميكروبلاتيس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف.
  8. تحديد لوسيفراس اليراع (فلوريدا)-تنبعث التﻷلؤ باستخدام برنامج محدد مسبقاً المخزنة في القارئ الميكروسكوبية التﻷلؤ.
    1. فتح برنامج التحكم الصك (انظر الجدول للمواد للحصول على تفاصيل الصك).
    2. من القائمة "أدوات"، حدد 'لومينوميتري'.
      1. تحت إعدادات 'المعلمات'، اختر 'لا يوجد عامل تصفية' لتصفية الانبعاثات، والتجزئة 'عادي' "الفتحة الانبعاثات"، وأدخل '1' "وقت العد"، وانقر فوق 'موافق' لإعداد قراءة التﻷلؤ.
    3. ضمن علامة التبويب 'أداة التحكم'، قم بالتمرير خلال قائمة البروتوكولات النشطة، وحدد بروتوكول المخزنة مسبقاً لقراءة التﻷلؤ.
    4. ضمن علامة التبويب 'يعيش العرض'، تعريف الجدول من القائمة المنسدلة، وحدد 'لوغاريتم' أو 'الخطي' للنوع.
    5. ضمن علامة التبويب 'الحرارة'، حدد 'إيقاف' للتدفئة لوحة.
    6. انقر فوق الزر 'ابدأ' لأداء التﻷلؤ في القراءة.
    7. حسب الحاجة، تصدير النتائج إلى تنسيق جدول بيانات باستخدام 'مستكشف' مضمن داخل البرنامج عنصر التحكم.

2-التحديد الكمي لنشاط γ-سيكريتاسي

  1. تعريف إشارة التﻷلؤ المنبعثة من الفريق الاستشاري أو خلايا نغ تعامل مع [دمس] 0.1 في المائة في متوسط النمو الذي يحتوي على 1 ميكروغرام/مل التتراسيكلين وحدها كنشاط نسبي γ-سيكريتاسي 100%.
    1. تقدير التﻷلؤ الخلفية من الخلايا CG أو الحرس الوطني بعلاج الخلايا مع متوسط النمو التي لا تتضمن التتراسيكلين.
  2. تطبيع لوسيفراس إشارات من خلايا CG أو الحرس الوطني التي تستزرع مع متوسط النمو الذي يحتوي على 1 ميكروغرام/مل التتراسيكلين وأما 1 ميكرومتر CL-387,785 أو 1 ميكرومتر من ضابت مع إشارة لوسيفراس المنبعثة من CG يعامل [دمس] أو نغ الخلايا (نشاط نسبي γ-سيكريتاسي 100%، كما تعريف في 2.1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تثبيط ErbB2 من CL-387,785 يمكن أن تعزز خلطات معالجة التطبيق--C99 Γ --سيكريتاسي دون التأثير على الانقسام والدرجة
إنشاء تحليل يستند إلى الخلية التي يمكن قياس كمي الانقسام proteolytic من الركازة خاصة γ-سيكريتاسي، نحن تولدها خط الخلية المستمدة من HEK293 الفريق الاستشاري تعداء المشارك مستقرة من التتراسيكلين إيندوسيبلي ج-شفاء Gal4/VP16-معلم التطبيق--C99 وجينات مراسل لوسيفراس اليراع يحركها المروج Gal4. أيضا أنشئ خط خلية نغ موازية الاعتداء للا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أقامت إيمانا راسخا الدور الحاسم ل Aβ في الآلية المرضية لإعلان22 نتائج واعدة من محاكمة 1b مرحلة العلاج المناعي أدوكانوماب للإعلان وتشير إلى أن نهج مكافحة Aβ لا تزال استراتيجية قابلة للتطبيق لوضع إعلان لمكافحة المخدرات. هنا، يمكننا وصف يستند إلى الخلية فحوصات لقياس proteolysis γ-سيكريتاسي-حفزت التطبيق--C99 و NΔE باستخدام نظم مراسل لوسيفراس اليراع. هي ركائز γ-سيكريتاسي مدروسة أكثر اثنين التطبيق--C99 و NΔE معا وتمثل كلا من الأنشطة المسببة للأمراض والفسيولوجية γ-سيكريتاسي13. الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون "مرفق الأساسية" المعهد الخلوي و "علم الأحياء أورجانيسميك"، "سينيكا"، الحصول على الدعم التقني. هذه الدراسة كانت تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (الأكثر 103-2320-B-001-016-MY3 إلى يوسف-واو. L.)، برنامج الابتكار متعدية للتنمية الصيدلانية البيولوجية – التكنولوجيا الداعمة للمحور الأساسي المخطط (NP7 إلى. ي.)، وسينيكا (ليوسف-).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قارئ لوحة التلألؤ VictorLightPerkinElmer2030-0010
الفئة الثانية ، خزانة السلامة البيولوجية من النوع 2Thermo Scientific1300 Series A2
CL-387،785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046المكون الرئيسي لوسط النمو
مصل الأبقار الجنيني (FBS)ثيرمو فيشر16000044
بلاستيسيدينثيرموفيشر A1113903
زيوسينثيرمو فيشرR25005
هيغروميسين بجيبكو10687010
هيموسيتومرسيجما ألدريتشBR717805 ألدريتش
96 بئر صفيحةدقيقة Nunc156545
التتراسيكلينسيجماT7660
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650
كاشف مقايسة لوسيفيرازثابتة بروميجاE2510
CO2< / sub> حاضنةRevcoUltima II
خط خلية T-REx293InvitrogenR71007
Wallac 1420 إصدار البرنامج 3.0PerkinElmerلقارئ اللفائح الدقيقة
برنامج التحكم في أداة

المراجع

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293 CL 387 785 DAPT

مقالات ذات صلة