هذه المخطوطة يصف كيف شق مثل الآفات على الخلايا الظهارية مثقف مونولاييرس مريح نموذج الجرح الشفاء في المختبر، مما يسمح للتصوير بواسطة [كنفوكل] أو الفحص المجهري بالليزر، والتي يمكن أن توفر جودة عالية البيانات الكمية والنوعية لدراسة سلوك الخلية والآليات المعنية بالهجرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجهرية على أساس أساليب التقييم للهجرة الخلية الظهارية أثناء التئام الجرح في المختبر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الهجرة الخلية جانب إلزامي لالتئام الجروح. إنشاء اصطناعية الجروح في نماذج حيوانية للبحث غالباً ما تكون النتائج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، بينما يحتمل أن تفتقر إلى الدقة. الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية منبرا مناسباً للبحث عن سلوك الخلية المهاجرة في التئام الجروح وأثر العلاجات في هذه الخلايا. غالباً ما يتم دراسة فسيولوجيا الخلايا الظهارية في ظروف غير روافد؛ بيد هذا النهج قد لا تشبه الجرح الطبيعية شفاء الظروف. تعطيل تكامل ظهارة بالوسائل الميكانيكية يولد نموذج واقعي، ولكن يمكن أن تعوق تطبيق التقنيات الجزيئية. ونتيجة لذلك، الأمثل لدراسة الهجرة الخلية الظهارية تقنيات الفحص المجهري على أساس في المختبر. هنا نحن التفصيل طريقتين محددة والمقايسة الصفر الجرح مصطنعة والمقايسة الجبهة الهجرة المصطنعة، التي يمكن الحصول على البيانات الكمية والنوعية، على التوالي، على أداء الخلايا الظهارية المهاجرة.
المقدمة
الهجرة الخلية المطلوب لالتئام الجروح، كما أنها مسؤولة عن الإغلاق النهائي للفجوة الظهارية وترميم السطح تعطلت1. أداء الجروح الاصطناعية في نماذج حيوانية يسمح بتكرار هذه العملية المعقدة بالقرب من الظروف الفسيولوجية2. ومع ذلك، غالباً ما يؤدي هذا النهج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، التي يحتمل أن تكون تفتقر إلى الدقة لدراسة عمليات متميزة، بسبب الطبيعة المعقدة لعملية التئام الجروح.
الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية يوفر بديلاً مفيداً لنماذج حيوانية للبحث في الدور الذي تؤديه هذه الخلايا في التئام الجروح وآثار العلاج على سلوك الخلية المهاجرة. وكثيراً ما هو درس فسيولوجيا الخلايا الظ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-اصطناعية الجرح المقايسة الصفر للدراسات الكمية
- إعداد أحادي الطبقة الخلية
- العمل تحت ظروف معقمة، البذور وتنمو الخلايا الظهارية Mv1Lu أو هاكات في قوارير الثقافة باستخدام مصل تكمل المتوسطة. تحديث المتوسط مرة كل 24-48 h. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80%، فصل الخلايا باستخدام الطريقة المناسبة، أي، تريبسينيزيشن9.
ملاحظة: Mv1Lu هاكات تستزرع خطوط الخلايا الظهارية المتوسطة الثقافة اللور وديميم، باستخدام على التوالي، تكملها مم 2 لتر-الجلوتامين والمحتضنة في 37 درجة مئوية مع جو التي تسيطر عليها شركة 5%2. يجب أن جزيئي كل خط الخلية دقيق لتحديد تركيز الخلية والتوقيت المطلوب للوصول إلى كامل كونفل....
- العمل تحت ظروف معقمة، البذور وتنمو الخلايا الظهارية Mv1Lu أو هاكات في قوارير الثقافة باستخدام مصل تكمل المتوسطة. تحديث المتوسط مرة كل 24-48 h. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80%، فصل الخلايا باستخدام الطريقة المناسبة، أي، تريبسينيزيشن9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الجرح اصطناعية المقايسة الصفر للدراسات الكمية: تقييم عامل نمو البشرة (لو) الترويج للهجرة:
لو محفز معروفة انتشار الخلايا الظهارية والهجرة، وبالتالي عنصر تحكم إيجابية للتحديد الكمي لتشجيع الهجرة. واستخدمت مونولاييرس خلية Mv1Lu وهاكات في فحوصات الصفر الجرح وتم الحصول على صور قبل العلاج. بعد التطعيم مع 10 نانوغرام/مل مماثلة، كانت الخلايا المحتضنة ح 19 قبل التثبيت وصور بعد العلاج. أبقى الانتشار إلى الحد أدنى من الحفاظ على ظروف المجاعة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الجلد أو الأغشية المخاطية التعطيل، يتم استعادة وظيفة حاجز الأعمال التي تقوم بها العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الليفية أو الخلايا الظهارية ومحصنة. مربوط، تخضع هذه الخلايا معقدة العملية التي تنطوي على المبرمج وانتشارها، والتمايز، والأهم من ذلك، تنتجها الخلايا الليفية وطلائي خلايا الهجرة، وهي المسؤولة عن ترميم الأنسجة تعطلت الآلية في نهاية المطاف، إغلاق الفجوة الظهارية السطحية1،12 هكذا، دراسة الهجرة الخلية يساعد على دقة وصف السلوك الفسيولوجية للخلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.
شكر وتقدير
نحن نريد أن نعطي بفضل كبار أعضاء المختبر التي تساعد في تحسين وصقل هذه التقنيات إلى حالته الفعلية: د. سيليا مارتينيز-مورا؛ أنا الدكتور مروويك والدكتور كاتالينا رويز-كانيادا والدكتور أنطونيا الكاراز-غارسيا. ونحن مدينون لمستشفى Clínico الجامعي فيرجن de la اريتشاكا لدعم تطوير هذه التقنيات بشدة. كما دي معهد الصحة كارلوس الثالث، Sanitarias فوندو للبحوث. خطة استاتال أنا + د + أنا ومعهد دي السعود كارلوس الثالث-Subdirección العامة دي تقييم y Investigación de la الحكوميتين (منحة رقم: PI13/00794)؛ www.isciii.es-FEDER Fondos "أونا manera de hacer Europa". ونشكر أيضا جامعة دي مورسيا، إيميب-اريتشاكا وفيس للدعم الإداري والمساعدة. وأخيراً، نحن نريد أن نعطي خاصة بفضل الدكتورة إيزابيل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دولبيكو s معدل النسر المتوسط (DMEM) | Biowest ، Nuaillé ؛ ، فرنسا | L0102-500 | اختياري 10٪ FBS ملحق |
| النسور الحد الأدنى من الوسط الأساسي (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | اختياري 10٪ FBS مكمل |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | استخدم في 2 ملي مولار |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس الولايات المتحدة الأمريكية | DE17603A | |
| تريبسين - EDTA | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | T4049 | تمييع حسب الاقتضاء |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich ، St لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | P9155 | |
| ملحي ذو فوسفات Dulbecco (DPBS) (10x) | Gibco من Life Technologies | 14200-067 | مخفف إلى 1x |
| 24 بئر ألواح استزراع | BD FALCON // SARSTED | 734-0020 | |
| ألواح استزراع 6 آبار | SARSTEDT | 83-3920 | |
| عامل نمو البشرة (EGF) | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | E9644 | مستعمل 10 ng / مل |
| زجاج غطاء دائري | MENZEL-GL & Auml ؛ SER | MENZCB00120RA020 | عمق قصير للمجال |
| شفرة حلاقة معززة رقم 743 | مارتور (من خلال VWR) | MARO743.50 | |
| 200 & micro ؛ ل نصائح ماصة الهباء الجوي المعقمة | VWR | 732-0541 | |
| 20 & micro; ل نصائح ماصة الهباء الجوي المعقمة | VWR | 732-0528 | |
| كاميرا رقمية مقترنة بمجهر تباين الطور | Motic Spain | Moticam Camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0 ؛ مجهر Motic Optic AE31 | |
| متحد البؤر | ZEISS التصوير المصغر ، ألمانيا | LSM 510 META | |
| 10 سم طبق ثقافة | BD FALCON | 353003 | |
| الأرنب متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد c-Jun | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-1694 | مستعمل 1:100 |
| مضاد للأرانب IgG (ماعز متعدد النسيلة) AF 488 | Invitrogen | A11008 | مستخدم 1: 400 |
| Hoechst-33258 | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | 14530 | مستعمل 1: 1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (في الميثانول) (أحمر) | Invitrogen | A12381 | مستعمل 1: 100 |
| مصل الأبقار ألبومين | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | T9284 | |
| حليب خالي الدسم | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية | الإصدار 1.50i | |
| Zen LSM 510 برنامج معالجة الصور | ZEISS Microimaging ، ألمانيا | الإصدار 5.0 SP 1.1 |
المراجع
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amnio....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
