Method Article

البروتوكول التجريبي للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد المعرضة لمبيدات الآفات أورجاكلوري

DOI:

10.3791/56800

⸱

September 16th, 2020

 ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Institute of Toxicology, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Modern Toxicology of Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, 3Center of Gallbladder Disease, Shanghai East Hospital, Institute of Gallstone Disease, Tongji University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن فهم تأثير مبيدات الآفات العضوية العضوية (OCPs) على وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد مهم في استكشاف آلية OCPs التي تسبب اضطرابات التمثيل الغذائي. تعرض هذه الورقة طرق مفصلة للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا الكبدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرض هذه الورقة طرقًا تفصيلية للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا الكبدية لفهم أفضل سبب الاضطرابات الأيضية الناجمة عن مبيدات الآفات العضوية (OCPs) في خلايا الكبد. وقد تعرضت خلايا HepG2 إلى β-سداسي كلورو حلقي الهكسيكاني (β-HCH) لمدة 24 ساعة بجرعة مكافئة من التعرض الداخلي لدى عامة السكان. تم فحص الهيكل الفائق في خلايا الكبد عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) لإظهار أضرار الميتوكوندريا. تم تقييم وظيفة الميتوكوندريا كذلك من خلال كثافة الفلورية الميتوكوندريا، الأدينوسين 5'ثلاثي الفوسفات (ATP) مستويات، معدل استهلاك الأكسجين (OCR) وإمكانية غشاء الميتوكوندريا (MMP) في خلايا HepG2 المحتضنة مع β-HCH. لوحظت شدة الفلور الميتوكوندريا بعد أن لطخت بمسبار الفلورسنت الأخضر الميتوكوندريا مع مجهر الفلورسين. تم استخدام رد فعل لوسيفيرين-لوسيفراز لتحديد مستويات ATP. تم الكشف عن MMP بواسطة الصبغة الاتينية JC-1 وتحليلها تحت عملية استئصال السيل. تم قياس OCR مع محلل تدفق خارج الخلية. وباختصار، استخدمت هذه البروتوكولات في الكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد مع للتحقيق في أضرار الميتوكوندريا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

آثار مبيدات الكلور العضوي (OCPs) على الصحة ، على سبيل المثال التدخل التناسلي ، والسمية المناعية ، والتغيرات الأيضية وقد سبق دراسة1،2،3. وقد مكنت طرق الكشف عن التمثيل الغذائي الخلوي ومعرفة الخلل الميتوكوندريا العلماء لفهم دور وظيفة الميتوكوندريا(أي.، مستويات الميتوكوندريا STAT3، اللاكتات، البيروفات، اللاكتات إلى بيروفات نسبة، انزيم Q10، تسرب البروتون الميتوكوندريا، الحيوية، النشوء الحيوي، وديناميات) في مجالات مثل الشيخوخة والسمنة والسكري، وظيفة القلب والأوعية الدموية، والسرطان، والسمية السلامة4،,5،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع التجارب وبروتوكولات التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة، ووافقت عليها اللجنة الأخلاقية المحلية لجامعة نانجينغ الطبية.

1. البنية الفائقة الميتوكوندريا من قبل TEM

  1. جمع خلايا HepG2
    1. بذور خلايا HepG2 في أطباق 100 ملم. تخزين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. هضم الخلايا مع 0.25٪ EDTA في أنبوب 1.5 mLEP.
    3. جهاز طرد مركزي عند 1000 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل المُندفع.
    4. جمع 4-6 × 105 خلايا HepG2.
  2. إضافة 1 مل من 5٪ غلتارالدهيد (المذيبات: الماء المقطر مزدوجة) مع الماصات واحتضان في 4 °C لمدة 2 ساعة.
  3. إض....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تضررت بشكل ملحوظ الميتوكوندريا كريستا من خلايا HepG2 المعرضة لهو HCH. كانت الميتوكوندريا المتناثرة أقل ما يقال إلى موسعة بشكل ملحوظ ، على شكل غير منتظم ، واختفت التلال الميتوكوندريا مع بنية الميتوكوندريا غير طبيعية نسبيًا (الشكل 1).

انخفض متوسط كثافة الفلور الأخضر الميتوكوندريا، الذي يمثل الميتوكوندريا، في خلايا HepG2 المعرضة لـ β-HCH (الشكل 2)، وكذلك في مستويات ATP.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10- ومن الأهمية بمكان لنجاح بروتوكول الكشف استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية التي تمت تغطيتها في الدراسة من النمط الظاهري إلى الآلية. في هذه الدراسة، كانت خلايا HepG2 المستزرعة في DMEM مع البنسلين وstreptomycin و 10٪ مصل الأبقار الجنين. عندما وصلت الخلايا إلى التقاء 40-50٪ ، تمت إضافة HCH -β (0 ، 10 ، 100 نانوغرام / مل) واحتضانها لمدة 24 ساعة. استخدمنا أولاً TEM التي أظهرت التغيرات ultrastructural في الكبد الناجمة عن OCPs ممثل، β-HCH، والتي تبين ضعف بنية الميتوكوندريا (الشكل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 81573174، 81570574)؛ صندوق الشباب المتميز لمقاطعة جيانغسو (SBK2014010296)؛ المشروع البحثي لوزارة التعليم الصينية (213015A)؛ :: تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو، وهو التطور الرئيسي الرئيسي لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو؛ وبرنامج المشروع المفتوح للمختبر الرئيسي للدولة للكيمياء البيئية وعلم السموم الإيكولوجية (KF2015-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجهر إلكتروني الإرسال FEITecnai G2 Spirit Bio TWINعالي التباين وعالي الدقة ومراقبة وتصوير بجرعة منخفضة ومراقبة درجات حرارة منخفضة وأداء تحليلي متميز وأتمتة للراحة والأداء
Mito-Tracker GreenBeyotimeC1048Mito-Tracker Green هو مسبار فلورسنت أخضر للميتوكوندريا يمكن استخدامه لتلوين الفلورسنت الخاص بالميتوكوندريا الحية.
مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزرZeiss700Bالتصميم مضغوط ومستقر ومسار الضوء هو الأقصر ودقة الإضاءة العالية والتكنولوجيا الإبداعية وتقنية المسح الضوئي المتطورة معا لإنتاج صورة عينة مثالية ثلاثية الأبعاد.
يمكن استخدام مجموعة فحص ATP المحسنةBeyotimeS0027Enhanced ATP Assay Kit للكشف عن مستويات ATP (الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات) في المحاليل أو الخلايا أو الأنسجة الشائعة. يمكن تقسيم عينات الخلايا والأنسجة لإكمال تحضير العينة ، وحساسية الكشف تصل إلى 0.1 نانومول / لتر ، ويمكن الحفاظ على التلألؤ الكيميائي لمدة 30 دقيقة.
مقياس الإضاءةBertholdCentro LB 960Luminometer هو كاشف التلألؤ الكيميائي ، يمكن أن تكون عينة الاختبار نفسها خفيفة ، ولا تحتاج إلى التحفيز. مقياس الإضاءة هو الأداة التي تكتشف التلألؤ الكيميائي.
مجموعة فحص البروتين BCABeyotimeP0012BCA Protein Assay Kit هي واحدة من أكثر الطرق استخداما للكشف عن تركيزات البروتين.
يمكن استخدام قارئ متعدد الأوضاعTECANInfiniteM200متعدد الأوضاع للكشف عن موافقة البروتين.
تصوير

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79(2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionHepatocytesOrganochlorine PesticidesHepG2 CellsTransmission Electron MicroscopyFluorescence MicroscopyFlow CytometryExtracellular Flux AnalyzerATP LevelsOxygen Consumption Rate

Related Articles