مقالة منهجية

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

DOI:

10.3791/56815

⸱

نوفمبر 9, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول توليف الجزيئات المغناطيسية وتقييم خصائصها ربط الحمض النووي عن طريق نثر الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي. يركز هذا الأسلوب على رصد التغيرات في حجم الجسيمات، وعلى بوليديسبيرسيتي والرئيسية إمكانات زيتا لسطح الجسيمات التي تلعب دور في ملزمة لمواد مثل الحمض الريبي النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات باستخدام حقل ذو أهمية فائقة في بحوث التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. ويصف هذا البروتوكول تقييم جزيئات الحمض النووي المغناطيسي ملزمة عن طريق نثر الضوء الحيوي (DLS) وتشتت الضوء الغرواني الكهربي (ELS). تحليل حسب DLS توفر معلومات قيمة عن الخصائص الفيزيائية للجسيمات بما في ذلك حجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي، وزيتا المحتملة. ويصف هذا الأخير تهمة السطحية للجسيمات التي تلعب دوراً رئيسيا في الربط الكهربائي من مواد مثل الحمض النووي. وهنا يستغل تحليل مقارن التعديلات الكيميائية ثلاثة جسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة وتأثيراتها على الحمض النووي ملزم وشطف. التعديلات الكيميائية التي تشعبت بولييثيلينيميني، ويجري التحقيق في تريثوكسيسيلاني إيثيل أورثوسيليكاتي و (3-أمينوبروبيل). لما الحمض النووي المعارض شحنة سالبة، فمن المتوقع أن تنخفض إمكانيات زيتا لسطح الجسيمات عند ربط الحمض النووي. وينبغي تشكيل المجموعات تؤثر أيضا على حجم الجسيمات. من أجل التحقيق في كفاءة هذه الجسيمات في العزلة وشطف الحمض النووي، مختلطة الجسيمات مع الحمض النووي في انخفاض الأس الهيدروجيني (~ 6) وقوة الأيونية عالية وجفاف البيئة. تغسل الجسيمات في المغناطيس وثم الحمض النووي هو الوتيد بالمخزن المؤقت تريس-HCl (pH = 8). ويقدر عدد نسخ الحمض النووي باستخدام الكمية البلمرة المتسلسل (PCR). تقييم ومقارنة إمكانات زيتا وحجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي وبيانات PCR الكمي. دائرة الأراضي والمساحة هو الثاقبة ودعم أسلوب التحليل الذي يضيف منظورا جديداً لعملية فحص جسيمات لعزل الحمض النووي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الحمض النووي إحدى الخطوات الأكثر أهمية في مجال البيولوجيا الجزيئية. تطوير أساليب استخراج الحمض النووي تأثيراً كبيرا على الناشئة مجالات علم الجينوم وميتاجينوميكس والتخلق وترانسكريبتوميكس. وهناك مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لعزل الحمض النووي بما في ذلك الطبية (أدوات الطب الشرعي/التشخيص وتنبؤاتها المؤشرات الحيوية)، والتطبيقات البيئية (الجينومية التنوع البيولوجي وانتشار مسببات المرض والمراقبة). كان هناك طلب متزايد لتنقية وعزل الحمض النووي من مواد مختلفة، وفي مستويات مختلفة مثل الدم، البول، والتربة، والخشب، وأنواع أخرى من العينات. 1 , 2 , 3 , 4

جزيئات نانو والصغيرة الحجم مناسبة لعزل الحمض النووي بسبب تلك المساحة السطحية العالية، ولا سيما عندما أنهم يمكن أن تكون معطلة بحقل مغناطيسي. الخصائص الفيزيائية للجسيمات، مثل الحجم أو التهمة، يمكن أن تؤثر إلى حد كبير قدرتها على ربط الجزيئات الحيوية المستهدفة. 5 لزيادة تعزيز ربط الجزيئات الحيوية واستقرار الجزيئات، يمكن أن تستخدم مختلف التعديلات الكيميائية (طلاء السطح). العديد من الاستراتيجيات المختلفة لربط تصنف وفقا للتفاعلات التساهمية وغير التساهمي. 6 حجم الجسيمات يؤثر تأثيراً مباشرا على خصائصها المغناطيسية، بينما يمكن أن تكون مصممة تكوين الجسيمات بإدراج معدنية أو سبائك أو غيرها من المواد التي يمكن أن تؤثر في كثافة، المسامية، وسطح. وهناك 7 لا طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس تهمة السطحية لجزيئات صغيرة. بدلاً من ذلك، يمكن قياس القدرة الكهربائية في الطائرة المتأخرة (بعض المسافة بعيداً عن سطح نانوحبيبات). 8 هذه القيمة يسمى زيتا المحتملة وهو أداة قوية التي تستخدم عادة للتقييم لنانو-ويمثل الاستقرار عن طريق دائرة الأراضي والمساحة. 9 نظراً لقيمته اعتماداً كبيرا ليس فقط على درجة الحموضة وقوة الأيونية البيئة المشتتة، ولكن أيضا على الخصائص السطحية للجسيمات، فإنه يمكن أيضا أن تثبت التغييرات في هذا السطح الناجمة عن التفاعل بين الجسيمات وجزيء من الفائدة. 10

من ناحية أخرى، تحدث بنية الحمض النووي في ظروف المجففة (نموذج أ-الحمض النووي) المعارض والتشكلات المضغوطة التي تيسر لها هطول الأمطار (تجميع) عند مقارنة إلى عادة شكل ب-الحمض النووي. كهرباء (الأيونية والسندات ح) هي القوى الرئيسية السيطرة على ربط الحمض النووي للمواد الأخرى بسبب ما فوسفات ستيريكالي موجوداً وقواعد النيتروجين (لا سيما جوانين). 7 , 10

في هذا العمل، ويتم تحليل التعديلات الكيميائية الممثل ثلاثة جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة (الشكل 1A). يتم وصف أسلوب التوليف والتعديل الكيميائي لجسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة. حل ملزم، أن اتفاقات المبادئ النظرية لترسيب الحمض النووي (درجة الحموضة، القوة الأيونية، والجفاف)، يستخدم لتقييم الحمض النووي ملزم وشطف. يتم استخدام PCR الكمي لتقييم كفاءة شطف الحمض النووي من جسيمات نانوية الممثل والمجهرية الدقيقة (الشكل 1B). حجم الجسيمات ومؤشر بوليديسبيرسيتي وزيتا المحتملة هي المعالم الهامة التي يتم استخدامها لتصور التغيرات الفيزيائية التي تحدث على سطح الجسيمات (الشكل 1). من المهم التأكيد على أن وصف السطح المغناطيسي الجسيمات الكيميائية. وبينما كانت هذه الخطوة خارج نطاق هذا البروتوكول، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الحديثة للتحقيق في كفاءة التعديلات الكيميائية. 11 , 12 , 13 , 14 فورييه تحويل مطيافية الأشعة تحت الحمراء (FTIR) يمكن استخدامها لتقييم طيف الأشعة تحت الحمراء لسطح الجسيمات وذلك مقارنة بطيف المعدلات الكيميائية الحرة. مطيافية إلكترون الأشعة السينية (XPS) هو تقنية أخرى يمكن استخدامها لتحديد تكوين عنصري من سطح المادة. يمكن استخدام أساليب أخرى الكهروكيميائية والمجهرية والطيفية تسليط الضوء على نوعية التوليف الجسيمات. ويبرز هذا العمل منظورا جديداً لتحليل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات التفاعل عن طريق دائرة الأراضي والمساحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-توليف جسيمات نانوية مغناطيسية

  1. استقرت توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية مع سترات (منبس)
    1. إضافة 20 ملمول فيكل 3 ∙ 6 ح 2 س (5.406 ز) و 10 مليمول من فيكل 2 ∙ ح 4 2 س (1.988 ز) في 20 مل ماء المقطر مزدوجة deoxygenated (ddd المياه). إثارة الحصول على الحل بقوة في الكأس تحت الغلاف الجوي 2 ن استخدام محرض ميكانيكية حتى يتم الحصول على حل شفافة-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 150 مل م 1 NH 4 أوه، قطره قطره باستخدام القمع إسقاط (تأخذ ح 1 أو أكثر إذا لزم الأمر). نقل الحل في سفينة سكريوابلي بعد إضافة جميع NH 4 أوه. برغي الحل السفينة والحرارة عند 75 درجة مئوية للحد الأدنى 30
      تنبيه: تصنف NH 4 يا أكالة وتشكل خطرا على البيئة.
      ملاحظة: تعد NH 4 يا الحل من الدرجة العالية 28% NH 4 يا في المياه باستخدام مياه deoxygenated.
    3. جمع متسرعا أسود استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 100 مل الماء ddd. كرر 3 مرات. إضافة 50 مل من 0.5 م الصوديوم ثلاثي سترات ثنائي هيدرات تعمد إلى. برغي السفينة.
      ملاحظة: استخدم deoxygenated حل ثنائي هيدرات سترات الصوديوم الثلاثية-
    4. إعادة تفريق في ترسبات عبر سونيكاتيون (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وسفينة الحرارة عند 80 درجة مئوية حاء 1
      ملاحظة: هناك حاجة إلى سونيكاتور طاقة كافية.
    5. السماح لتبرد الحل إلى درجة حرارة الغرفة. جمع متسرعا باستخدام مغناطيس وإزالة المادة طافية. إعادة تفريق الطين الأسود في 50 مل مياه ddd باستخدام سونيكاتور (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
      6. نقل مختبرين (~ 25 مل) في أنابيب الطرد المركزي 50 مل
    6. وإضافة 20 مل الأسيتون. الطرد المركزي في 2400 x ز لمدة 10 دقائق وإزالة سوبيرناتانتس.
    7. إعادة تفريق متسرعا وحل ضد الماء باستخدام جهاز الغسيل الكلوي الوقف الوزن الجزيئي المنخفض (500-1,000 دا) لحجم مناسب ل 24 h. دياليزي
      ملاحظة: تحضير جهاز الغسيل الكلوي وفقا للشركة المصنعة ' متطلبات s-
  2. توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية معدلة مع تشعبت بولييثيلينيميني (MNPs_PEI)
    1. إضافة 2 مل من الحصول عليها منبس الحل (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 38 مل من الماء ddd و sonicate (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) التعليق (10 دقيقة)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 10 مل من 10% تشعبت بولييثيلينيميني (متوسط كاتشين 25). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع يعجل باستخدام المغناطيس وإزالة المادة طافية. إعادة تفريق متسرعا في 20 مل من الماء ddd. كرر 5 مرات ثم sonicate بتعليق نهائي (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  3. تعديل توليف للجسيمات جسيمات نانوية مغناطيسية مع السليكا (MNPs_TEOS)
    1. إضافة 10 مل من الحصول عليها منبس الحل (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 60 مل من المياه و 130 مل من الإيثانول. Sonicate الحل وإضافة 6 مل من 28% NH 4 يا.
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 1 مل من الرصاص رباعي الإيثيل أورثوسيليكاتي. إثارة الحل ل h. 12 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). إعادة تفريق الجزيئات في 10 مل ddd المياه و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  4. توليف لجسيمات نانوية مغناطيسية معدلة مع المجموعات الأمينية (MNPs_APTES)
    1. إضافة 5 مل حل MNPs_TEOS التي تم الحصول عليها (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 45 مل من المياه و 50 مل من الإيثانول. Sonicate الحل (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 0.5 مل تريثوكسيسيلاني (3-أمينوبروبيل). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). إعادة تفريق الجزيئات في 5 مل ddd المياه و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-

2. مغناطيسية المجهرية الدقيقة توليف

  1. استقرت توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة مع سترات (يتولى)
    1. إضافة 25 مل م 2 كنو 3 ومل 12.5 م 1 كوه ومل 205.875 ddd المياه داخل وعاء سكريوابل. إضافة مل 6.675 م 1 فيسو 4 أثناء إثارة المغناطيسية. الفور نقل السفينة إلى حمام مائي مسخن (90 درجة مئوية) حاء 2
      ملاحظة: إعداد كنو 3 وحلول كوه في ddd المياه-
    2. السماح لتبرد الحل إلى درجة حرارة الغرفة. جمع الأسود متسرعا استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 50 مل الماء ddd (5 مرات). إضافة 50 مل من 0.5 م الصوديوم ثلاثي سترات ثنائي هيدرات تعمد إلى. برغي السفينة.
    3. ريديسبيرسي ترسبات عبر سونيكيشن (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وسفينة الحرارة عند 80 درجة مئوية لترسبات سوداء جمع حاء 1 استخدام المغناطيس، والمياه والصرف الصحي باستخدام 50 مل الماء ddd (10 مرات).
      4. يتولى تعديل
    4. مع تشعبت بولييثيلينيميني (MMPs_PEI)، السيليكا (MMPs_TEOS) والمجموعات الأمينية (MMPs_APTES) مماثلة لبروتوكول منبس. راجع الأقسام 2.2، 2.3 و 2.4، على التوالي لمزيد من التفاصيل.
  2. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع تشعبت بولييثيلينيميني (MMPs_PEI)
    1. إضافة 5 مل من محلول يتولى (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 38 مل من الماء ddd و sonicate الحل (35 كيلو هرتز، سعة 100%، 10 دقيقة). تحت التحريك الميكانيكية السريعة إضافة 10 مل من 10% تشعبت بولييثيلينيميني (متوسط كاتشين 25). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    2. جمع متسرعا باستخدام مغناطيس وإزالة المادة طافية. ريديسبيرسي متسرعا في 20 مل ماء المقطر مزدوجة. كرر 5 مرات ثم sonicate الحل النهائي (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  3. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع السليكا (MMPs_TEOS)
    1. إضافة 5 مل من محلول يتولى (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 60 مل من المياه و 130 مل من الإيثانول. Sonicate تعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100 ٪) وإضافة 6 مل من 28% NH 4 يا.
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 1 مل من الرصاص رباعي الإيثيل أورثوسيليكاتي. إثارة الحل ل h. 12 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام مغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرات). ريديسبيرسي الجسيمات في 5 مل الماء ddd و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
  4. توليف المغناطيسي المجهرية الدقيقة المعدلة مع المجموعات الأمينية (MMPs_APTES)
    1. أضف 3 مل من محلول MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) في كوب زجاج. إضافة 45 مل من المياه و 50 مل من الإيثانول. Sonicate التعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-
    2. تحت التحريك الميكانيكي السريع، إضافة 0.5 مل تريثوكسيسيلاني (3-أمينوبروبيل). إثارة الحل حاء 3 اللاحقة
    3. جمع ترسبات سوداء باستخدام المغناطيس وغسله باستخدام 50 مل إيثانول (3 مرات) و 50 مل من الماء (3 مرة). ريديسبيرسي الجسيمات في 3 مل من الماء ddd و sonicate بتعليق (35 كيلو هرتز، سعة 100%)-

3. مغناطيسية الجسيمات حجم تحليل استخدام DLS

  1. حجم الجسيمات في المياه
    1. استخدام DLS الصك الذي ينطبق على زاوية للكشف عن تشتت الخلفي (رقم 173) وطول موجه شعاع من 633 نانومتر.
      ملاحظة: العودة ونثر DLS مناسبة لعينات مركزة حيث يمكن تجنب تشتت متعددة. الجانب نثر (كاشف زاوية 90°) ونثر الأمام (كاشف زاوية 15 درجة) DLS تصلح لجسيمات أصغر ومختلطة الجسيمات، على التوالي.
    2. السابقة للقياس في الماء، sonicate الجسيمات للحد الأدنى 3
      ملاحظة: استخدم الحل المخفف للجسيمات. ولهذا الغرض، مزيج ميليلتر 9.6 الجسيمات مع 96 ميليلتر من الماء.
    3. بعناية "الماصة؛" 50 ميليلتر من الجسيمات الحل إلى مطاط البوليستيرين الترعة وتجنب تكوين فقاعات.
      ملاحظة: لكل عينة، استخدام المتاح ومبومو (انظر الجدول للمواد)-
      4. ملاحظة
    4. وضوح ومبومو واتجاه شعاع ضوء. إدراج الخلية في صاحب العينة وإغلاق الدائرة.
    5. استخدم المعلمات التالية للقياس: درجة الحرارة: 25 درجة مئوية؛ والانكسار المرحلة المشتتة (الحديد): 2.344؛ والانكسار المشتتة البيئة (المياه): 1.333
      ملاحظة: إجراء قياس الانكسار استخدام إنكسار لنتائج أكثر دقة، لا سيما عند وضع مواد رواية أو المختلطة-

4. إعداد المخزون الحمض النووي، والجسيمات المغناطيسية والمخزن المؤقت ملزم

العازلة 10 ملم HCL تريس
  1. الأسهم الحمض النووي
    1. استخدام (pH = 8) لتمييع ومخزن للحمض النووي. استخدام عينة الحمض النووي قياسية التي يمكن توسيعها على وجه التحديد مع بروتوكول بكر مباشرة في المختبر (انظر الفرع 5-2 لإعدادات رد الفعل والظروف). لتضخيم 498 زوج قاعدي (bp) الجين xis من عاثية λ التحكم، استخدم كبسولة تفجير التالية. إلى الأمام التمهيدي: 5 '-ككتجكتكتجككجكتكاكجك-3Ɔ عكس التمهيدي: 5 '-تككجاتااااكجتكجاتجاكاتتجك-3 '
    2. "بكر تنقية" المنتج باستخدام أدوات تنقية الحمض النووي التجاري-
      ملاحظة: مجموعات تجارية باستخدام السليكا المستندة إلى العمود الداخلي العائد > 100 نانوغرام/ميليلتر تنقية الحمض النووي-
    3. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام أسلوب سبيكتروفوتوميتريك (امتصاص في 260 nm). تمييع الأسهم الحمض النووي من 10 11 نسخة/ميليلتر كما هو موضح أعلاه للحلول العامل من 10 10، 10 9، 10 8، و 10 7 نسخة/ميليلتر.
      ملاحظة: يمكن حساب عدد نسخ منتج PCR وفقا للمعادلة التالية، بافتراض متوسط الوزن الجزيئي هو دا 650 لكل شركة بريتيش بتروليوم:
      نسخ الحمض النووي/ميليلتر = (الكمية في نانوغرام/ميليلتر * 6.022x10 23 نسخ/مول)/(498 bp * 650 غ/مول من بي بي * 1 x 10 9 نانوغرام/غرام)
  2. المغناطيسي الجسيمات
    1. السماح للجسيمات للرواسب دون المغناطيس وإزالة المادة طافية. مزيج 01:20 v/v نسبة الجزيئات المغناطيسية مع المياه ddd (الجسيمات: المياه)-
      ملاحظة: النهج القائم على وحدة تخزين تستخدم لوصف كميات من الجسيمات المغناطيسية نظراً لسهولة من الصعب مقارنة الجماهير تساوي منبس ويتولى.
  3. ملزمة المخزن المؤقت
    1. للإعداد السريع لحل HCL خلات الصوديوم 0.75 متر (pH = 6)، مزيج 1 مل خلات الصوديوم م 3 مع 3 مل من 1 مم HCL.
      ملاحظة: يمكن تخزين كافة الحلول المستخدمة في الربط في 4 ° جيم-مذكرة بأن درجة الحرارة منخفضة يزيد بشكل ملحوظ ملزمة لا سيما في حالة الحل الإيثانول. التحكم بعناية في درجة حرارة الحلول لإمكانية تكرار نتائج أفضل ودقة الفحص.

5. اختبار "الكفاءة للحمض النووي العزل استخدام الكمية بكر"

  1. عزل الحمض النووي بواسطة تعديل يتولى أو منبس
    1. استخدام لوحة 96-جيدا ومغناطيس مخصصة للوحة 96-جيدا لتجارب صغيرة الحجم-
    2. استخدام خليط الحل الملزمة التالية: تعديل ميليلتر 8 يتولى أو منبس، 10 ميليلتر الصوديوم خلات-HCl (0.75 م، ودرجة الحموضة = 6)، 60 ميليلتر إيثانول 85%، 10 ميليلتر الحمض الخلوي الصبغي (10 10 نسخ الحل).
    3. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ومكان لوحة على المغناطيس لمدة 3 دقائق. بينما اللوحة على المغناطيس، إزالة الحل وإضافة 100 ميليلتر من الإيثانول 85% للغسيل.
    4. إزالة الإيثانول.
      ملاحظة: تسمح الإيثانول لتجف لبضع ثوان ولكن لا تدع الجسيمات الجافة الإفراط أو إظهار الشقوق. إذا الجسيمات الجافة الإفراط سيكون من الصعب حل مع الحل شطف.
    5. إزالة اللوحة من المغناطيس وإضافة 40 ميليلتر من شطف الحل. مزيج جيد من قبل بيبيتينج. ضع اللوحة مرة أخرى على المغناطيس وجمع الحمض النووي الوتيد (~ 37 ميليلتر). تخزين الوينت في-20 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.
  2. PCR الكمي
    1. استخدام أجهزة الإشعال التي استخدمت لإعداد الأوراق المالية الحمض النووي في خطوة 4.1.1 التحديد الكمي لنسخ الجين xis، وفقا للبروتوكول من جانب حداد وآخرون- 10
    2. إعداد مزيج الرئيسي حل وفقا لكمية عينات لفحصها، ثم توزيع الخليط في أنابيب PCR أو لوحة خلفية بيضاء 96-جيدا-
    3. استخدام الكميات التالية لوحدة كاملة من مزيج PCR ميليلتر 20: 10 ميليلتر بوليميريز/إينتيركالاتينج خليط الصبغة (انظر الجدول للمواد)، 2 ميليلتر عينة الحمض النووي، 2 ميليلتر الأمام التمهيدي (10 ميكرومتر)، 2 ميليلتر عكس التمهيدي (10 ميكرون)
    4. إعداد ثيرموسيكلير وفقا للبرنامج التالي: 95 درجة مئوية عن 120 s، دورات 40 (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 64 درجة مئوية لمدة 15 s، 68 درجة مئوية ل 45 s)، 68 درجة مئوية للحد الأدنى 5
      5. حساب عتبة دورة
    5. تريبليكاتيس استخدام المقاييس وعينات، وتشييد منحنى قياسي لتقدير عدد نسخ الحمض النووي التي يتم استردادها في كل عينة. الأداة المستخدمة هنا ينفذ هذا تلقائياً.
    6. هنا، يقدر عدد نسخ الحمض النووي شطف إجمالي حجم (~ 40 ميليلتر). يمكن أن تختلف النسبة المئوية للحمض النووي استرداد المقابلة للمبلغ الأصلي إضافة إلى ربط الحل (تماما 10 نسخ 11) إلى ما بعد الفترة من 0 إلى 100-

6. الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط تحليل استخدام DLS

تجارب
  1. ملزم للحمض النووي
    1. للحجم الكبير (في أنبوب 1.5 مل)، استخدام خليط الحل الملزمة التالية: تعديل ميليلتر 96 يتولى أو منبس، 120 ميليلتر الصوديوم خلات-HCl (0.75 م، ودرجة الحموضة = 6)، 720 ميليلتر إيثانول 85%، 120 ميليلتر الحمض الخلوي الصبغي (10 10 نسخ الحل) أو 120 العازلة HCL تريس ميليلتر (10 ملم، ودرجة الحموضة = 8) لعنصر التحكم.
  2. تحليل المحتملة زيتا
    1. حلول ملزمة تحضير اثنين، أحدهما مع الحمض النووي وآخر مع المخزن المؤقت تريس-HCL لعنصر التحكم كما هو موضح في الخطوة 6.1.1. لتجنب تكوين فقاعات، بعناية "الماصة؛" 800 ميليلتر من خليط ملزمة في خلية المتاح.
      ملاحظة: استخدم ومبومو القابل للقياس من السطح زيتا المحتملة (انظر الجدول للمواد)-
  3. استخدم المعلمات التالية لقياس على صك DLS: نموذج Smoluchowski مع F(ka) 1.5، درجة الحرارة: 25 درجة مئوية، والانكسار المرحلة المشتتة (الحديد): 2.344، الانكسار المشتتة البيئة (المياه): 1.333.
    ملاحظة: معدل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات التفاعل يؤثر تأثيراً مباشرا على قياس replicates. قياس واحد بالصك يأخذ s 60-70. هنا، كلف هذا الصك لأخذ القياسات 10 مع 1 دقيقة فترات التأخير. للبساطة، سيظهر النتائج في الوقت = 0، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14، 16 و 18 دقيقة من القراءة الأولى-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا للتوليف الكيميائي وتعديل المغناطيسي الجسيمات، توليف ستة جزيئات مغناطيسية وتحليل للحمض النووي ملزم. ويرد في الجدول 1موجزاً للتحليل. بمقارنة حجم الجسيمات في الماء وفي حل ملزم، فمن الواضح أن جميع الجزيئات المجمعة في ربط الحل بطيات 2-22. كذلك تجميع بعض الجسيمات إلى طيات أكثر حضور الحمض النووي؛ ولكن هذا كان لا ترتبط مباشرة مع استرجاع الحمض النووي الكشف عنها بواسطة PCR الكمي (الجدول 1). مقارنة زيتا المحتملة (قياسات 10 في فواصل زمن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، كانت المبادئ النظرية التي تشرح الحمض النووي ملزم بالجسيمات المغناطيسية عن طريق زيتا المحتملة تحت السؤال. ويصف البروتوكول التوليف وتعديل جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة. كما يتم وصف طريقة لإعداد حل التحكم وربط الحمض النووي. تظهر هاتان الاستراتيجيتان هنا لفحص الحمض النووي-الجسيمات التفاعلات: النهج الكمي PCR ودائرة الأراضي والمساحة. DLS يوفر ثلاثة مؤشرات للتغيرات الفيزيائية الكيميائية في الجزيئات: حجم الجسيمات، ومؤشر بوليديسبيرسيتي وزيتا المحتملة. التغييرات حجم الجسيمات تشير مباشرة إلى التجميع أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المسلم به إلى حد كبير الدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم التشيكية (مشروع GA CR 17-12816S) وعام 2020 سيتيك (LQ1601).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحديد (III) كلوريد سداسي هيدراتسيجما ألدريتش207926تخليق الجسيمات المغناطيسية
الحديد (II) كلوريد رباعي الهيدراتسيجما ألدريتش380024تخليق الجسيمات المغناطيسية
الحديد (II) كبريتات سباعي هيدراتسيجما ألدريتشF8263تخليق الجسيمات المغناطيسية
الأسيتونبنتا10060-11000تخليق الجسيمات المغناطيسية
سيترات الصوديوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشW302600تخليق الجسيمات المغناطيسية
رباعي إيثيل أورثوسيليكاتسيجما ألدريتش131903تخليق الجسيمات المغناطيسية
(3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلانسيجما ألدريتش440140تخليق الجسيمات المغناطيسية
بولي إيثيلينيمين ، متفرعة ، متوسط ميغاواط ~ 25،000سيجما ألدريتش408727تخليق الجسيمات المغناطيسية
محلول هيدروكسيد الأمونيومSigma-Aldrich221228-M & nbsp ؛تخليق الجسيمات المغناطيسية
الإيثانولبنتا71250-11000تخليق الجسيمات المغناطيسية
نترات البوتاسيومسيجما ألدريتشP6083تخليق الجسيمات المغناطيسية
هيدروكسيد البوتاسيومسيجما ألدريتش1.05012تخليق الجسيمات المغناطيسية
غشاء قطع الوزن الجزيئي (ميغاواط = 1 كيلو دالتون)مختبرات الطيفG235063تخليق
الجسيمات المغناطيسيةالنمام العلويwiteg Labortechnik GmbHDH. WOS01035تخليق الجسيمات المغناطيسية
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998تخليق الجسيمات المغناطيسية
SonicatorBandelin795تخليق الجسيمات المغناطيسية
BRAND UV cuvette microSigma-AldrichBR759200-100EACuvette لقياس الحجم
غطاء العلامة التجارية للأشعة فوق البنفسجية كوفيت microSigma-AldrichBR759240-100EAأغطية كوفيت لقياس الحجم
الشعيرات الدموية المطوية Zeta CellMalvernDTS1070كوفيت لقياس إمكانات زيتا
جهاز ZEN3600 نانو ZSMalvernلقياس الحجم وإمكانات زيتا
لانهائي 200 PRO
أداة NanoQuant		Tecan396 227 V1.0 ، 04-2010جهاز لقياس تركيز الحمض
النووي SYBR Green Quantitative RT-PCR KitSigma-AldrichQR0100PCR
Mastercycler pro S أداةEppendorf6325 000.013Thermocycler
MinElute kitQiagen28004طقم تنقية الحمض النووي
أسيتات الصوديومSigma-AldrichS7670ربط الحمض النووي
kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA qPCR

مقالات ذات صلة