Method Article

إنشاء نموذج عنصر محدود هيكلي واقعية هندسية من كارديوميوسيتي لدراسة دور البنية الخلوية في بيولوجيا الأنظمة كارديوميوسيتي

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويحدد هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء نموذج عنصر محدود مكانياً مفصلة من بنية داخل الخلايا من كارديوميوسيتيس من المجهر الإلكتروني وصور مجهرية [كنفوكل]. ويتجلى السلطة من هذا الطراز مفصلة مكانياً باستخدام دراسات الحالة في إشارات الكالسيوم والاستقلاب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع ظهور تقنيات التصوير (3D) ثلاثي الأبعاد مثل التصوير المقطعي الإلكترون، المسلسل-كتلة-وجه المسح الميكروسكوب الإلكتروني والميكروسكوب [كنفوكل]، يتحمل المجتمع العلمي لم يسبق لها مثيل من الوصول إلى قواعد البيانات الكبيرة في ميكرومتر الفرعية القرار التي تتسم بها يعيد البناء المعماري الذي يرافق التغيرات في وظيفة كارديوميوسيتي في الصحة والمرض. بيد أن هذه مجموعات البيانات كانت غير مستغلة للتحقيق في دور إعادة عرض البنية الخلوية في الدالة كارديوميوسيتي. والغرض من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية إنشاء نموذج عنصر محدود دقيقة من كارديوميوسيتي استخدام الميكروسكوب الإلكتروني عالية الدقة وصور مجهرية [كنفوكل]. نموذج مفصل ودقيق للبنية الخلوية إمكانات كبيرة لتقديم رؤى جديدة في الأحياء كارديوميوسيتي، أكثر مما يمكن كسب التجارب وحدها. السلطة من هذا الأسلوب تكمن في قدرته لالصمامات حسابياً معلومات من اثنين من طرائق التصوير المتباينة من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي لوضع نموذج موحد ومفصل واحد كارديوميوسيتي. هذا البروتوكول يحدد خطوات لإدماج التصوير المقطعي الإلكترون وصور مجهرية [كنفوكل] cardiomyocytes الفئران ويستار (اسم لسلالة معينة من الفئران ألبينو) الذكور الكبار لوضع نموذج عنصر محدود ساركومير النصف كارديوميوسيتي. الإجراء بإنشاء نموذج عنصر محدود ثلاثي الأبعاد يحتوي تصوير عالية الجودة والدقة (حدود ~ 35 نانومتر) لتوزيع الميتوكوندريا، ميوفيبريلس ومجموعات مستقبلات ريانوديني أن الإفراج عن الكالسيوم اللازمة كارديوميوسيتي تقلص من شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic (ريال) في ميوفيبريل وحجرة سيتوسوليك. النموذج التي تم إنشاؤها هنا كمثال لا تتضمن تفاصيل بنية أنبوب عرضية أو شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic وبالتالي فهو نموذج الحد أدنى كارديوميوسيتي. ومع ذلك، يمكن فعلا تطبيق النموذج في التحقيقات على أساس المحاكاة في الدور هيكل الخلية في الاستقلاب إرسال الإشارات والمتقدريه الكالسيوم، الذي يتضح وتناقش استخدام اثنين من دراسات الحالة التي ترد بعد البروتوكول مفصلاً.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اقتران الإثارة--انكماش (ECC) في القلب يشير إلى هامة ومعقدة اقتران بين الإثارة الكهربائية للغشاء كارديوميوسيتي وانكماش الميكانيكية اللاحقة للخلية أثناء كل نبضة. النماذج الرياضية وقد لعبت دوراً رئيسيا في تطوير فهم كمي للعمليات الكيميائية الحيوية المترابطة التي تنظم إمكانية العمل1، سيتوسوليك الكالسيوم مما يشير إلى2،3من الاستقلاب، واللاحقة توليد القوة الهوس. هذه النماذج أيضا بنجاح وتوقع تغييرات لنبضات القلب عند واحد أو العديد من هذه العمليات البيوكيميائية الخضوع للتعديلات4،5. يتزايد الاعتراف أولتراستروكتوري تنظيم درجة عالية من كارديوميوسيتي تلعب دوراً حاسما في الدالة الهوس العادي للخلية والقلب كله. في الواقع، تحدث التغييرات في مورفولوجيا وتنظيم مكونات أولتراستروكتوري القلب بالتوازي مع التغيرات البيوكيميائية في ظروف المرض مثل تضخم6،7من فشل القلب والسكري اعتلال عضلة القلب8. ما إذا كانت هذه التغييرات الهيكلية الردود المرضية البسيطة أو التكيف لتغير الظروف الكيميائية الحيوية لا تزال مجهولة إلى حد بعيد9. اقتران ضيق أصلاً بين الشكل والوظيفة في البيولوجيا يعني أن الدراسات التجريبية وحدها لا يمكن أن يوفر رؤى أعمق من العلاقات المتبادلة بين يعيد البناء الهيكلي والدالة كارديوميوسيتي. جيل جديد من النماذج الرياضية التي يمكن أن تدمج الجمعية الهيكلية من المكونات الفرعية الخلوية، جنبا إلى جنب مع العمليات البيوكيميائية مدروسة، ضرورية لتطوير فهم شامل، والكمي للعلاقة بين هيكل والكيمياء الحيوية والقوة الهوس في cardiomyocytes. هذا البروتوكول توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها لتوليد نماذج عنصر محدود هيكلي دقيقة من كارديوميوسيتيس التي يمكن استخدامها لمثل هذه التحقيقات.

شهد العقد الماضي تقدما ملحوظا في الميكروسكوب الإلكتروني 3D10و [كنفوكل]11مجهرية فائقة القرار12 التي تقدم أفكاراً لم يسبق لها مثيل، والدقة في تجميع نانو النطاق والحجم الصغير مكونات الخلوية دون كارديوميوسيتي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه البيانات لتوليد نماذج حسابية كارديوميوسيتي أولتراستروكتوري13،14،،من1516. استخدام هذه النماذج طريقة محاكاة هندسة راسخة، تسمى طريقة العناصر المحدودة17، لإنشاء عنصر محدد الشبكات الحاسوبية عبر كارديوميوسيتي والعمليات الكيميائية الحيوية التي يمكن محاكاة تقلصات. ومع ذلك، هذه النماذج محدودة بالقرار والتفاصيل التي يمكن أن توفر أسلوب الفحص المجهري في dataset صورة. على سبيل المثال، يمكن أن تولد الميكروسكوب الإلكتروني نانومتر-مستوى من التفصيل لهيكل الخلية، لكن من الصعب تحديد البروتينات المحددة داخل الصورة التي ستكون ضرورية لإنشاء نموذج. من ناحية أخرى، يمكن أن توفر مجهرية بصرية فائقة القرار الصور عالية التباين في قرارات بناء على أمر من 50 نانومتر فقط تحديد عدد قليل الجزيئية مكونات الخلية. إلا من خلال إدماج معلومات تكميلية من هذه الطرائق التصوير يمكن أحد واقعيا استكشاف حساسية الدالة إلى تغييرات في الهيكل. الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني لا يزال غير إجراء روتيني، وأنها سوف لا تزال تعاني الحد أن عدد محدود فقط من مكونات يمكن الملون في رأي الفلورة ويرتبط مع الرأي القائل بالميكروسكوب الإلكتروني.

ويقدم هذا البروتوكول نهج رواية18 يستخدم الأساليب الإحصائية19 لتحليل والصمامات حسابياً المعلومات الخفيفة الميكروسكوب في التوزيع المكاني لقنوات أيون بالميكروسكوب الإلكتروني معلومات عن القلب الأخرى مكونات أولتراستروكتوري، مثل ميوفيبريلس والميتوكوندريا. وهذا ينتج نموذج عنصر محدود التي يمكن استخدامها مع النماذج الفيزيائية للعمليات الكيميائية الحيوية لدراسة دور المنظمة كارديوميوسيتي الخلوية الفرعية على العمليات البيوكيميائية التي تنظم انكماش كارديوميوسيتي. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نماذج من صحية ونماذج myocytes القلب السكري الناجم عن بالستريبتوزوتوسين لدراسة تأثير يعيد البناء الهيكلي في وظيفة القلب الخلية التي يتم ملاحظتها في الحيوان السكري8. ميزة إضافية للطبيعة الإحصائية لطريقة عرض تتجلى أيضا في البروتوكول: الأسلوب يمكن إنشاء مثيلات متعددة من الهندسات العناصر المحدودة التي تحاكي عن كثب التغيرات الملحوظة تجريبيا في هيكل الخلية.

كنظرة عامة، تشمل الخطوات البروتوكول: (ط) إعداد الأنسجة القلبية الميكروسكوب الإلكتروني توليد صور ثلاثية الأبعاد مع القرار كافية والتباين؛ (ثانيا) إعادة الإعمار وتجزئة من مداخن صورة ثلاثية الأبعاد من البيانات الميكروسكوب الإلكتروني باستخدام برنامج تحليل الصور والتعمير الميكروسكوب الإلكتروني 3D دعا إيمود20؛ (ثالثا) باستخدام iso2mesh21 لتوليد شبكة عناصر محددة باستخدام بيانات مجزأة كمدخلات؛ (رابعا) باستخدام خوارزمية جديدة ورموز لخريطة توزيع قنوات أيون على شبكة العناصر المحددة.

الفرضية من النهج المتبع في كل خطوة ويرد ضمن البروتوكول، ويتم توفير نتائج الممثل في الأرقام المصاحبة لها. نظرة عامة حول يرد تحديد كيف يمكن استخدام نماذج مفصلة مكانياً الذي تم إنشاؤه لدراسة ديناميات المكانية من الكالسيوم خلال رعاية الطفولة المبكرة، فضلا عن الاستقلاب المتقدرية. مناقشة لبعض القيود المفروضة حاليا على البروتوكول، فضلا عن التطورات الجديدة التي تجري حاليا للتغلب عليها، والمضي قدما إلى فهم كمي لدور هيكل الخلية لنظم القلب بيولوجيا. ويتناول أيضا كيف يمكن تعميم هذه الأساليب لإنشاء نماذج العناصر المحدودة لأنواع أخرى من الخلايا.

المستخدمين لهذا البروتوكول قد تخطي الخطوة 1 والجزء التعمير من الخطوة 2 إذا كان لديهم الوصول إلى كومة صورة الميكروسكوب الإلكتروني موجودة من قبل. ولعل المستخدمين الذين يعتزمون الحصول على البيانات الخاصة بهم بالتعاون مع ميكروسكوبيستس الإلكترون أكثر خبرة لمناقشة ومقارنة بالتثبيت وإجراءات المصبوغة في الخطوة 1 مع الخبير لتحديد وضع بروتوكول أمثل لاقتناء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة أوكلاند الحيوان لجنة الأخلاقيات وجامعة كاليفورنيا في سان دييغو مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة، حيث وضعت أصلاً بروتوكول الأنسجة.

1-إعداد التجريبية

  1. إعداد حلول الأسهم الصوديوم 0.15 و 0.3 متر مربع مخازن كاكوديلاتي على درجة الحموضة 7.4 وفقا الجدول 1.
  2. إعداد مثبت جلوتارالديهيدي (حمض التانيك 0.2% في م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت على درجة الحموضة 7.4 + 2% بارافورمالدهيد (PFA) + 2.5 ٪ glutaraldehyde) باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1.
    1. حل 2 غ مسحوق منهاج عمل بيجين في 20 مل ماء المقطر عند 60 درجة مئوية في هوتبلت مع التحريك المستمر.
    2. إضافة حل هيدروكسيد الصوديوم 1 م حتى الحل الواضح.
    3. انتظر حتى درجة الحرارة من أن الحل أقل من 40 درجة مئوية، ثم أضف 10 مل من جلوتارالديهيدي و 20 مل من كاكوديلاتي الصوديوم 0.3 متر.
    4. إضافة 0.2 جم حامض التانيك وتذوب في الحل.
    5. إضافة 50 مل كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر.
    6. تخزين 20 مل التﻷلؤ قنينة ثلاثة أو أربعة من مثبت في الثلاجة عند درجة 4 مئوية، أو على الجليد إذا ما استخدمت في نفس اليوم.
  3. إعداد الحل تيرودي مع 20 مم 2، 3-بوتانيديوني مونوكسيمي (متخذي قرارات العمل)، ووفقا للوصفة في الجدول 1.
  4. بناء جهاز لانجيندورف داخل خزانة الأبخرة.
    1. المشبك أنابيب بلاستيكية حقنه 100 مل اثنين إلى اثنين المعوجة مختلفة تقف، عالية من قاعدة احتياطية حوالي 70 سم.
    2. قم بتوصيل أنابيب بلاستيكية حقنه وأنبوب موصل باستخدام 3 مم-الداخلية-قطر الأنبوب ومحبس الحنفية الثلاثية كما هو مبين في الشكل 1.
    3. تناسب قنية قطر خارجي 3 مم إلى الجزء السفلي من الموصل بالأنابيب، حيث سيكون مرتبطاً القلب للتثبيت التروية.
  5. ملء الأنابيب المحاقن مع تيرودي للحل والحلول مثبت عند 37 درجة مئوية.
    1. إزالة فقاعات الهواء داخل الأنبوب بتمرير الحلول حقنه من خلالهم.

2-الحصول على بيانات المجهر الإلكتروني من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي

  1. إعداد الحيوان للختان والتثبيت الكيميائية من القلب.
    ملاحظة: هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات لمعالجة البالغين الذكور ويستار (اسم لسلالة معينة من الفئران ألبينو) الفئران القلب الأنسجة. البروتوكول قد تتطلب تعديلات عند مصدرها أنسجة القلب الأنواع الأخرى.
    1. تخدير الحيوان بعلاج الفئران (200-250 غم من وزن الجسم) مع 0.5 مل من 250 يو/مليلتر الهيبارين عن طريق الحقن داخل. انتظر لمدة 10 دقائق، ثم علاج الفئران بحقن داخل بينتوباربيتال (210 ملغ/كغ وزن الجسم).
    2. تأكيد درجة ملائمة من التخدير باختبار منعكس قرصه أخمص القدمين.
    3. Euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم.
    4. حصاد قلب استخدام إجراءات تشريح مماثل للمقالات جوف المنشورة سابقا22،23، ثم ضعه في المياه المالحة المثلج.
    5. عزل الشريان الاورطي تصاعدي وكانولاتي. تأكد من أن طرف القنية يجلس فقط فوق صمام شبه القمري، حيث الشرايين التاجية فرع. ربط مؤشر ترابط محكم حول الشريان الاورطي تصاعدي.
    6. قم بتوصيل القنية الجهاز لانجيندورف يحركها الجاذبية تعمل في ~ 70 سم فوق قاعدة للنظام (الشكل 1).
    7. تطور في محبس الحنفية على النظام لانجيندورف نتخلل القلب مع الحل تيرودي، بما في ذلك 20 مم متخذي قرارات العمل (مثبط الميوسين) لمدة 2-3 دقائق.
    8. تطور محبس الحنفية البدء التروية مع مثبت بارافورمالدهيد 2%، جلوتارالديهيدي 2.5%، وحمض التانيك 0.2% في 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إذا نجحت، سوف تتحول براون شاحب القلب وتصبح قاسية ومطاطي.
    9. باستخدام شفرة حلاقة، تفتيت كتل الأنسجة من الجدار الحر (الأفقي) البطين الأيسر والحصول على كتل الأنسجة حوالي 1 ملم3 في الحجم.
    10. تخزين العينات في تبريد قبل 20 مل التﻷلؤ قنينة من مثبت نفسه على الجليد ل 2 حاء تخزين عينات أكبر عدد ممكن في القنينات، وضمان أن العينات مغمورة في الحل.
      تنبيه: من المهم الاحتفاظ بعينات الباردة حتى بعد الجفاف 100% الخطوة أدناه.
  2. المزيد من التثبيت وتلطيخ العينات للمجهر الإلكتروني.
    1. من أجل 100 مل م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت في كوب زجاج وبارد على الجليد.
    2. إعداد كميات متساوية من 4% أكسيد الازميوم و 0.3 م الصوديوم كاكوديلاتي، تليها إضافة ز 0.08 من فيروسيانيد البوتاسيوم لجعل حل وصمة عار معادن الثقيلة التي تتضمن فيروسيانيد البوتاسيوم 2% في كاكوديلاتي الصوديوم أكسيد الازميوم وم 0.15 2%. بارد الحل على الجليد.
    3. "الماصة؛" مثبت عليها واستبدالها بما يكفي الباردة م 0.15 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت إلى غمر العينات في القنينات. وضع في قنينة على الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. كرر الخطوة 2.2.3 أربع مرات أكثر مع 0.15 م كاكوديلاتي الصوديوم لإزالة الزائدة مثبت.
      تحذير: لا تستخدم الماصات الزجاجية لأن شظايا صغيرة يمكن أن يحصل في العينة، ويمكن أن تدمر السكاكين الماس أثناء تقطيع كتلة الأنسجة. من المهم قبل تبرد جميع الحلول على الجليد قبل إضافتها إلى النموذج. من المهم أيضا أن العينة لا تزال مغطاة بحل كل الوقت (فترات قصيرة جداً من تغطية جزئية دائمة لا يزيد عن بضع ثوان قد بإيجاز التغاضي خلال التبادلات الحل). عند الغسيل أو الاستعاضة عن الحلول، إضافة الحل الجديد بسرعة بعد إزالة الحل السابق. الاحتفاظ بقارورة التﻷلؤ على الجليد بين يغسل. علما بأن هذه الخطوة لا الوقت الحساسة، يمكن غسلها كتل الأنسجة أطول قليلاً، إذا لزم الأمر.
    5. استبدال الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت مع الحل وصمة عار المثلج المعادن الثقيلة وتخزينها على الجليد بين عشية وضحاها. ضمان أن فيروسيانيد يختلط جيدا التي تهز القنينة باليد؛ وينبغي إيقاف الحل الأسود.
      تنبيه: العمل في غطاء الدخان عند تنفيذ هذه الخطوة لأن أوزميوم السامة.
    6. تمييع 4% مائي خلات (UA) الأسهم اليورانيل (الجدول 1) إلى % 2 باستخدام كميات متساوية من الأسهم حل تعميم الوصول إلى الخدمات، والماء المقطر مزدوجة، وتبرد بالثلج.
    7. تحل محل المعادن الثقيلة وصمة عار مع المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر تبريد الثلج، واسمحوا العينة احتضانها لمدة 5 دقائق على الجليد.
    8. كرر الخطوة 2.2.7 أربع مرات أكثر على الجليد شطف أي حل وصمة عار المعادن الثقيلة الزائدة.
    9. شطف العينات أربع مرات، مع فترة انتظار 2-دقيقة بينهما في تنقية المياه (المقطر مزدوجة غير كافية).
    10. استبدال الماء المنقي المثلج 2% احتضان تعميم الوصول إلى الخدمات، والسماح العينة لمدة 60-120 دقيقة على الجليد.
    11. تهدئة خمسة 20 مل التﻷلؤ قنينة من الإيثانول (ما يكفي لغمر العينات) على الجليد التي سيتم استخدامها في الخطوة الجفاف. قارورة الست بنسب متزايدة من الإيثانول في الماء المقطر: 20%، 50%، 70%، 90% و 100%.
    12. صب الأسيتون النقي في آخر 20 مل التﻷلؤ القنينة وباردة على الجليد جنبا إلى جنب مع قنينة الإيثانول.
    13. شطف عينات في تنقية المياه أربع مرات مع فترات الانتظار 2 دقيقة على الجليد لغسل الزائد تعميم الوصول إلى الخدمات.
  3. يذوي عينات في الإيثانول.
    1. يذوي في السلسلة الباردة الإيثانول بالاستعاضة تباعا عن الحل داخل القنينة عينة كما يلي، على الجليد: الإيثانول 20% لمدة 10 دقائق؛ الإيثانول 50% لمدة 10 دقائق؛ إيثانول 70% لمدة 10 دقائق؛ الإيثانول 90% لمدة 10 دقائق؛ ثم مرتين في الإيثانول 100% لمدة 10 دقائق.
    2. الانتقال عينة لدرجة حرارة الغرفة بالاستعاضة عن الإيثانول 100% النهائي مع تبريد الأسيتون النقي ومكان القنينة عينة على مقعد مختبر في درجة حرارة غرفة لمدة 10 دقائق.
    3. أداء الغسيل 10 دقيقة أكثر واحد في الأسيتون النقي في درجة حرارة الغرفة لإزالة التكثيف الذي يمكن ملاحظته داخل القنينات. حين تفرخ، تشكل الحلول الأسيتون/الراتنج.
    4. استبدال الأسيتون النقي في القنينات مع الراتنج الأسيتون والايبوكسي نقية 50: 50 (مع نسب لمكونات الراتنج الإيبوكسي كما ورد من الشركة المصنعة). استخدام كافة المكونات من نفس الدفعة. ترك قنينة مملوءة راتينج عينة بين عشية وضحاها في دوار.
  4. تضمين عينات في الراتنج.
    1. استبدال راتنج 50: 50 مع الراتنج 75% (25% الأسيتون) واحتضانها ح 3، تليها زيادة الاحتضان/التسلل إلى 100 ٪ راتنج ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
    2. استبدال الراتنج 100% مع الطازجة 100 ٪ راتنج، وترك قنينات العينات بين عشية وضحاها لاختراق أعمق من الراتنج في عينات الأنسجة.
    3. أخذ عينات من القنينات ووضعها في حاويات ملائمة للفرن ولها قاعدة ثابتة؛ الألومنيوم أو الفضة رقائق الخبز أكواب يمكن استخدامها لهذا الغرض، على سبيل المثال.
    4. بلطف من أجل (لتجنب التشريد عينات) الطازجة الراتنج على العينات (وبالتالي تضمين عينات في الراتنج) وبلمره الراتنج والعينات في فرن عند 60 درجة مئوية ح 48.
  5. إعادة توجيه كتل الراتنج للخلايا الصورة في المقطع العرضي.
    1. الحصول على 1 ميكرومتر أقسام الاختبار سميكة من كتل الراتنج استخدام أولتراميكروتومي بسكين زجاج لتقييم خلية التوجه24.
    2. وصمة عار أقسام اختبار سميكة ل 20 ثانية مع التولوين 1% أزرق والحفر 1%.
    3. دراسة اتجاه الخلية العضلات تحت مجهر حقل مشرق.
    4. استناداً إلى التوجه الاستدلال من الصور لأقسام الاختبار الملون، إعادة توجيه طوليا أو منحرف الموجهة (مشابه الرقم 2 ألف) لراتنج القطع للتأكد من أن الخلايا تتعرض للسكين الزجاج حيث أن أنها ستخفض في المقطع العرضي ( مشابه الرقم 2).
  6. الصورة أقسام الأنسجة باستخدام التصوير المقطعي الإلكترون.
    1. الحصول على أبواب شبه رقيقة (~ 300 نانومتر) الأنسجة توجيه سكين القطع باستخدام الماس ونقل المقاطع إلى شبكات النحاس25.
    2. وصمة عار الفروع سميكة مع 2% تعميم الوصول إلى الخدمات وساتو الرصاص25.
    3. تطبيق جزيئات الذهب الغروية على كلا الجانبين من المقاطع25.
    4. الحصول على مجموعات من الميل المزدوج-محور واحد أو سلسلة من الصور المسقطة من-70 ° إلى + 70 °25.
  7. استخدام إيمود20 لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد المكدس (سلسلة من الصور ثنائية الأبعاد التي توفر معلومات ثلاثية الأبعاد لقسم التصوير المقطعي إلكترون واحد) من الخلية. سيتم تقسيم هذا المكدس أعيد بناؤها في الخطوة التالية.

3-الجزء ميوفيبريلس ومناطق الميتوكوندريا من Dataset صورة 3D م

  1. تنفيذ البرنامج إيمود "3dmod".
  2. ضمن واجهة المستخدم الرسومية 3dmod، قم بإدخال عنوان ".rec" أو ".mrc" الملف الذي يحتوي على 3D بناؤها dataset صورة للخلية (التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.7) في مربع إدخال المسمى "صورة الملف (الملفات):"، ثم اضغط "موافق".
  3. ضمن القائمة "ملف"، حدد "النموذج الجديد"، ثم حفظ الملف باسم مناسب باستخدام "حفظ نموذج ك".. بند القائمة "ملف".
    ملاحظة: يمكن أن تحتوي على كائن في إيمود عبارة عن مجموعة من المكونات المقسمة التي تقوم بإنشاء "كائن". بشكل افتراضي، يحتوي نموذج جديد على كائن جديد بمعرف "#1".
  4. ضمن القائمة "خاص"، حدد "أدوات الرسم". سيؤدي هذا إلى فتح شريط الأدوات جديد يماثل ما هو مبين في الشكل 3 ألف.
    ملاحظة: هناك العديد من الأدوات التي يمكن استخدامها لإنشاء معالم حول حدود عضية مختلفة. يمكن الاطلاع على مزيد من التعليمات حول كيفية استخدام هذه الأدوات في وثائق20 إيمود.
  5. اختر الخيار "نحت" في قائمة "أدوات الرسم"، وحرك الماوس إلى إطار الصورة؛ سوف تظهر محيط دائري تركزت على مؤشر الماوس.
  6. بالضغط على زر الماوس الأوسط باستمرار على ميتوكندريا (المناطق الأغمق من ملفات الصور، كما يتضح من ترسيم مع الخطوط الكنتورية الخضراء في الشكل 3 ألف)، اسحب محيط محيط الدائرة إلى شكل حدودها.
  7. بمجرد اكتمال الكنتوري الحدود ميتوكندريا، حرر الزر الأوسط وكرر الخطوات من 3.6 لكل ميتوكندريا في البيانات. سيتم تلقائياً الاعتراف كل كفاف من إيمود كمحيط جديد داخل نفس الكائن.
  8. إطار "تحرير | كائن "القائمة، حدد" جديد "لإنشاء كائن جديد. وهذا تلقائياً زيادة العدد الإجمالي للكائنات بواسطة واحدة وتعيين هذا الرقم للكائن الجديد.
  9. كرر الخطوات من 3.6 و 3.7 الجزء وحفظ معالم ميوفيبريل.
  10. كرر الخطوة 3، 8، تليها الخطوة 3، 6، الجزء حدود الخلية، كذلك.
  11. حفظ ملف نموذج ضمن القائمة "ملف".
  12. تنفيذ الأوامر التالية في نافذة سطر أوامر لتحويل كل كائن تجميع في قناع ثنائي كما هو موضح في الشكل 4أ-ج.
    1. استخراج كائن معين من نموذج "إيموديكستراكت الكائن موديلفيلي أووتبوتموديلفيلي" حيث هو "كائن" الرقم للكائن الذي تريد استخراجه.
    2. إنشاء قناع لهذا الكائن: إيمودموب-outputmask.mrc imagefile أووتبوتموديلفيلي القناع 255
    3. تحويل الملف إلى كدسة tif:-s mrc2tif outputmask.mrc outputmask.tif

4-إنشاء شبكة عنصر محدد من عناصر مجزأة

  1. Iso2mesh برنامج MATLAB متاحة بحرية لتحويل رصات الصور TIFF إلى تنسجم الحجمي هرمي ثلاثي العناصر المحدودة. قم بتحميل وإضافة iso2mesh إلى مسار MATLAB من iso2mesh.sourceforge.net.
  2. تحميل رموز المصدر والبيانات لمحاكاة الكتل RyR على الشبكة من https://github.com/CellSMB/RyR-simulator موقع github.
  3. بدء تشغيل التطبيق MATLAB كاردياكسيلميشجينيراتور (الشكل 5).
  4. تحميل أقنعة مكون عضية مختلفة في MATLAB باستخدام ثلاثة أزرار الضغط في الجانب العلوي الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية.
  5. إنشاء مكدس الصورة الثنائية آخر أنه فىالوقت الفجوات بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا كما هو موضح في الشكل 6A.
    1. افتح إيماجيج.
    2. استخدام الملف | فتح مربع الحوار، وتحميل رزمة المشاجرة myofibrils والميتوكوندريا في البرنامج.
    3. بدء البرنامج المساعد إضافة صورة عن طريق تحديد "عملية | آلة حاسبة بالإضافة إلى ".
    4. حدد المكدس الصورة ميوفيبريل ك i1، الميتوكوندريا الصورة المكدس ك i2، واختيار المشغل "إضافة". انقر فوق "موافق".
    5. بعد ظهور كومة صورة جديدة تمثل نتيجة 4.5.4، حدد "تحرير | عكس "لإنتاج رصة صور مشابهة الشكل 6A.
  6. تحميل ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية للفجوات القائمة بين ميوفيبريلس والميتوكوندريا بالضغط على زر "ريرجابسفيلي" في برنامج كاردياكسيلميشجينيراتور.
  7. دفع "إنشاء شبكة" في واجهة المستخدم الرسومية. وهذا سوف يؤدي إلى v2m الأمر iso2mesh مع الخيار 'كجالميش' لإنشاء شبكة هرمي ثلاثي مماثل الشكل 4E. ستكون ثلاثة ملفات الإخراج في نهاية هذه الخطوة: ملف.ele وملف.face وملف.node الذي يحتوي على قائمة العقد التي تشكل العناصر، العقد التي تشكل الوجوه، واحداثيات العقد ، على التوالي.

5-رياضيا خريطة كثافة القنوات الأيونية للاهتمام على شبكة عنصر محدود مكانياً متفاوتة.

  1. توليد المدخلات اللازمة للمحاكاة-RyR بالضغط على الزر المسمى توليد RyR-محاكاة المدخلات في واجهة المستخدم الرسومية.
    ملاحظة: سوف يؤدي الزر دالة generateRyRsimulatorInputs.m، الذي يستخدم المعلومات التالية من الخطوة 4 لإنشاء المدخلات:
    (1) أووتدير: موقع ملفات الإخراج التي ضرورية لمحاكاة الكتلة RyR.
    (2) إيمريس: القرار بكسل في اتجاهات ثلاث رصات الصور.
    (3) myofibril_file: الملف الذي يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 4 باء.
    (4) sarcolemma_file: ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 4A.
    (5) ryrgaps_file: ملف يحتوي على المكدس الصورة الثنائية مثل هو موضح في الشكل 5 ألف.
    1. بعد تنفيذ هذه المهمة، تحقق من أنه تم إنشاء الملفات التالية في الدليل المحدد كمسار أووتدير:
    • d_axial_micron.txt، الذي يمثل المسافة المحورية بين موقف z-القرص وما تبقى من البيكسلات في الصورة المكدس.
    • d_radial_micron.txt، الذي يمثل مسافة إقليدية (باستثناء عنصر محوري) من كل بكسل في مجموعة المواقع الكتلة RyR المحتملة إلى بكسل على متن الطائرة z-القرص.
    • W_micron.txt، الذي يمثل قائمة الإحداثيات المكانية لجميع المناصب المتوفرة لمجموعات RyR أن يكون حاضرا.
    • تتضمن الملفات المتبقية في المجلد 3 اللاحقة "_pixel" بدلاً من "_micron" للدلالة على أن القيم الموجودة في هذه الملفات قد كتب في شكل تنسيق بكسل.
  2. محاكاة RyR الكتلة التوزيعات على المكدس الصورة الثنائية من ميوفيبريلس.
    1. تضغط على الزر المسمى "محاكي RyR المفتوحة في البحث والتطوير" الشروع في برنامج البحث والتطوير.
    2. R-واجهة المستخدم الرسومية، حدد "ملف | فتح "والعثور على الملف" إعدادات. R "ضمن حزمة محاكي RyR (RyR-محاكاة/المصدر/إعدادات. R).
    3. كما فتح ملف ryr-المحاكاة-الموازية. R (الموجود في RyR-محاكاة/المصدر/ryr-محاكاة-التوازي. R)-البيئات مثل رستوديو (https://www.rstudio.com) أو واجهة سطر الأوامر عادي يمكن استخدامها، مثلاً باستخدام الأمر R64 في نافذة الأوامر أو قذيفة.
    4. تغيير المعلمات في الإعدادات. R الملف كما هو مفصل أدناه:
      1. تعيين Path2 إلى عنوان المجلد الذي يحتوي على الملفات المدرجة في 5.1.2 رصة صور [كنفوكل] تجريبيا مكتسبة من مجموعات RyR وميوفيبريلس.
        ملاحظة: github مستودع المجلد الإدخال--الملفات/الماجستير-الخلية/يحتوي بالفعل على الملفات التي تم إنشاؤها لكومة صورة التي تم جمعها سابقا.
      2. تعيين Path4 إلى عنوان مجلد حيث يتم تخزين الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.1.2.
      3. تعيين نقطة Path3 إلى مجلد حيث يريد المستخدم مواقع الكتلة RyR محاكاة ليتم حفظها.
      4. مجموعة N إلى عدد الكتل RyR محاكاة في النموذج (عادة في المجموعة من 200 إلى 300).
      5. تعيين أتول، تسامح الإعداد للفرق بين التوزيع المكاني المقاسة تجريبيا لمجموعات RyR ونموذج محاكاة التوزيع المكاني لمجموعات RyR.
      6. تعيين نوميتير وضع حد لعدد محاولات ينبغي أن RyR--جهاز محاكاة العثور على نقش كتلة RyR محاكاة الذي يفي بقيمة أتول.
        ملاحظة: تم تعيين قيم أتول ونوميتير إلى القيم النموذجية ضمن الإعدادات. ملف البحث والتطوير.
      7. تعيين نومباتيرنس إلى العدد من مختلف أنماط الكتلة RyR التي يريد المستخدم لمحاكاة (عادة، ممارسة مفيدة محاكاة أنماط 99 للثقة الإحصائية).
      8. تعيين نومكوريس لتمكين استخدام وحدة المعالجة المركزية العديد من المواضيع (النوى) للمعالجة مع البحث والتطوير لمحاكاة أنماط نقطة المتوازية أسرع.
    5. تحقق من أن الحزم التالية مثبتة باستخدام مثبت حزمة واجهة المستخدم الرسومية في r: الثلج، دوسنوو، دوباراليل، foreach، المكررات، ورجل.
    6. تنفيذ المحاكاة عن طريق إدخال الأمر التالي في نافذة الأوامر R: المصدر (' الطريق إلى ryr-محاكاة-الموازية. R '، chdir = TRUE)
      ملاحظة: إخراج برنامج محاكاة RyR هو قائمة بملفات.txt (سيتم إنشاء ملف نومباتيرنس) التي تحتوي على تنسيق القوائم في الصفوف N ومحاكاة 3 أعمدة، التي تمثل x و y، و z إحداثيات N المجموعات RyR.
  3. خريطة النقاط الكثافة المكانية على نموذج حسابية باستخدام في كاردياكسيلميشجينيراتور.
    1. عن طريق تحديد الزر المسمى "حدد ملف نقاط RyR"، اختر ملف نصي توزيع كتلة RyR محاكاة من تلك التي كانت المخرجات التي RyR--جهاز محاكاة.
    2. تنفيذ "مخطط كثافة RyR" في واجهة المستخدم الرسومية في MATLAB. هذا سوف تعيين المواقع المكانية الكتل RyR المحاكاة في ملف.txt في خطوة 5.3.1 على شبكة العناصر المحددة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.8 باستخدام أسلوب يسمى نواة كروية كثافة مقدر أسلوب26.
      ملاحظة: الإخراج من هذه الخطوة هو ملف مع الملحق.txt يحتوي على قائمة قيم الكثافة العددية لايون-قناة لكل وحدة حجم كروية في كل من عقد الشبكة الحاسوبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرقم 2 إلى الرقم 7 توفر نتائج تمثيلية للعديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول: (ط) تصور وإعادة توجيه كتل الأنسجة لآراء مستعرضة المجهر الإلكتروني؛ (ثانيا) إنشاء كومة صورة 3D مجهر الإلكتروني؛ (ثالثا) بتجزئة أولتراستروكتوري الخلوية الفرعية العضيات اهتمام؛ (رابعا) جيل شبكة العناصر المحددة باستخدام iso2mesh؛ (ت) محاكاة واقعية توزيع مجموعات RyR على الشبكة؛ (سادسا) متبوعاً بتعيين هذا التوزيع المكاني ككثافة مكانية عبر الشبكة الحاسو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول أعلاه الخطوات الأساسية لإنشاء نموذج عنصر محدود رواية هندسية من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي. الأسلوب يتيح طرائق الانصهار الحسابية للفحص المجهري مختلفة (أو، من حيث المبدأ، بيانات أخرى) لوضع نموذج حسابية أكثر شمولاً لديناميات كارديوميوسيتي الذي يتضمن تفاصيل عن العمارة خلية المكانية. لا يوجد حاليا لا بروتوكول الأخرى المتاحة لإنشاء نموذج من هذا القبيل من كارديوميوسيتي.

الخطوة 1 يحدد بروتوكول لتثبيت التروية. وبدلاً من ذلك، القلب يمكن أن يكون اقتطعت وتشريح إلى أجزاء أصغر ومنغمسين في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان يدعمها هذا العمل الملكية المجتمع من نيوزيلندا مارسدن سريعة بدء المنحة 11-أوا-184 ومنح "العلم الحدود البشرية برنامج البحوث" RGP0027-2013 والاسترالية البحث اكتشاف المشروع مجلس DP170101358 منحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>مواد< / قوي>
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش746398
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC8106
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM2393
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتشS5761
كلوريدالبوتاسيومسيجما ألدريتشP5405
سكر العنبسيجما ألدريتشD9434
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS8045
بروبينسيدسيجما ألدريتشP8761
2،3-بوتانيديون مونوكسيمسيجما ألدريتشB0753
25٪ جلوتارالديهايد درجة EM (زجاجة 500 مل)ميرك354400-500 مل
بارافورمالديهايدسيجما ألدريتشP6148
حمض التانيكسيجما ألدريتش403040-500 جرام100 جرام
كاكوديلات الصوديومEM سيجما ألدريتشC0250
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشP4593
رباعي أكسيد الأوزميومسيجما ألدريتش75632-10 مل4٪ في الماء ، زجاجة 5 مل (أو زجاجة 10 مل متوفر أيضا)
Uranyl AcetateEM Sciences22400زجاجة 25 جرام
من البوتاسيوم فيروسيانيدMerck Millipore104973
التولوين الأزرقSigma-AldrichT3260
BoraxSigma-AldrichS9640يطلق عليه أيضا بورات الصوديوم
إيثانولسيجما-ألدريتش792780مخفف بنسب مختلفة مع المياه النقية
الأسيتونEM SciencesRT10017
مجموعة الراتنجEM Sciences14040ACM Durcupan يعمل بشكل جيد
حمض الهيدروكلوريكSigma-AldrichH98921 محلول
عادي<قوي> معدات< قوي>
UltramicrotomeLeicaEM UC7
إلكترون الإرسال المجهرThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
معوجة حاملProscitechT752
TubingBioStrategy75831-346لجهاز التروية langendorff ، يوصى بقطر 3 مم ولكن ليس ضروريا
StopcocksSDRQP13813لأنابيب langendorff ؛ المنتج هو مجرد مثال ، يمكن للمستخدم تحديد أي
مشابك حامل معوجةProscitechT715
محاقن بلاستيكيةSDRQPC1108للحلول على جهاز langendorff
خياطة حريرية مقلية ، 7-0TeleFlex15B051000لربط القلب على جهاز langedorff
قنيةمصنوعة من إبرة فولاذية بقطر خارجي 3 مم
حصيرة طبق بتري مطاطيةProscitechH068للاستخدام كلوح تقطيع أثناء تشريح القلب
الثابت شفرات الحلاقةProscitechL056لتقطيع القلب الثابت إلى كتل صغيرة لمعالجة EM
الزجاجاتBioStrategy89000-236لتخزين المحاليل أثناء تثبيت الأنسجة ومعالجتها ل
EM AcakersBioStrategy213-0477لتخزين المحاليل مؤقتا وأثناء التروية
قوارير التلألؤBioStrategy548-2170لعينات الأنسجة أثناء معالجة EM
طقم التشريحProscitechT161لتشريح
مرشحات الحقنةProscitechWS3-02225Sلتنقية أكواب
اليورانيل من الألومنيوم / رقائق الفضةمن أي متجر لمنتجات الخبز
سكينDupont DiamondBioStrategy102680-780نسخة زاوية 35 درجة تنتج أفضل الأقسام.
BBI الذهبية الغرويةEM. GC1515 نانومتر شبكات EM الذهبية الغروية
ProscitechGCU150يمكن اختبار مجموعة متنوعة من الأحجام: GCU150h ، GCU200h على سبيل المثال
ماصات التخلص من البلاستيكProscitechLCH20الأفضل لاستخدام المستهلكات البلاستيكية خاصة عند العمل مع
برنامج
الراتنج SerialEMاكتساب التصوير المقطعيبجامعة بولدر
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODبجامعة بولدرمحاذاة الصور وتجزئتها
iso2meshمتوفرة في http://iso2mesh.sourceforge.net
فيجي أو برامج معالجة الصور المماثلةImageJFiji هي مجرد صورةJ متاحة في https://fiji.sc لمعالجة الصورة الثنائية مكدسات
رموز RyR-Simulator / بياناتCellSMBمتوفرة في https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorتأتي مجموعةمع RyR-Simulator ضمن المجلد "gui-version"
R-statistics softwareR-projectتنزيل من https://www.r-project.org
spatstatR-projectالتثبيت عبر برنامج
R rgl-projectinstall عبر R البرنامج
doparallelR-projectتثبيت عبر برنامج R
لكلR-projectتثبيت عبر برنامج R
doSNOWR-projectتثبيت عبر
مكرراتR-projectعبر برنامج R
الصف خبز أسيتاتحلول مجموعة CellSMB R برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417(2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908(2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Finite Element ModelCardiomyocyte ArchitectureElectron TomographyConfocal MicroscopyCellular ArchitectureCalcium SignalingMitochondrial BioenergeticsRyR Cluster SimulationImage SegmentationMesh Generation

Related Articles