مقالة منهجية

الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D

DOI:

10.3791/56832

⸱

يناير 18, 2018

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مصانع النسخي الفيروسية هي هياكل منفصلة يتم إثراء الخلوية رنا بوليميراز الثاني لزيادة النسخ المورثات الفيروسية أثناء تنشيط. هنا، يتم وصف طريقة لتحديد المواقع لتدوين الكروماتين الفيروسية في الفضاء ثلاثي الأبعاد النووية بنشاط بمزيج من الفلورة التهجين الحمض النووي الريبي تلطيخ و في الموقع .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فمن المعروف جيدا أن التنظيم المكاني والزماني للجينات جزء لا يتجزأ من الإدارة التعبير الجيني السليم. ونتيجة لذلك، فإنه لا تقدر بثمن لفهم أين ومتى يحدث النسخ داخل الفضاء النووية وتصور العلاقة بين ابيسوميس المصابة داخل نواة الخلية نفسها. هنا، كانت الفلورة (إيفا) والجيش الملكي النيبالي-الأسماك كومبينيدتو تحديد الكتابة بنشاط ابيسوميس ساركوما كابوزي المرتبطة هربس (كشف). تلطيخ كشف الكمون المرتبطة النووية مستضد (LANA)، فمن الممكن لتحديد أين توجد ابيسوميس الفيروسية داخل النواة. وبالإضافة إلى ذلك، بتصميم تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك لاستهداف منطقة إنترون إحدى المورثات الفيروسية، التي يعبر عنها فقط أثناء العدوى الإنتاجية، يمكن وضع الوليدة رنا النصوص. استخدام هذا المزيج من المسابر الجزيئية، من الممكن تصور الجمعية للمصانع الكبيرة النسخ الفيروسية وتحليل التنظيم المكاني للتعبير الجيني الفيروسي أثناء تنشيط كشف. بها بما في ذلك مكافحة-رنا بوليميراز الثاني تلطيخ جسم واحد أيضا تصور الرابطة بين التجميع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابي) وكشف النسخ أثناء تنشيط.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن المنظمة الزمانية المكانية للنواة يلعب دوراً هاما في تحوير الجينات ضبطها بدقة في حقيقيات النوى. معظم الأنسجة جينات محددة موزعة على العديد من الصبغيات، وتحتاج إلى تنظيم شكل متزامن بغية الاستجابة للمحفزات محددة ب طريقة منسقة1. خلايا بناء محاور الكروماتين النشطة (ACH) كطريقة للجمع بين الجينات ومكوناتها التنظيمية المستقلة إلى الفضاء نووية خاصة1.

كما ثبت بالعديد من الدراسات أنه على الرغم من أن يبدو النواة كثيفة ولزجة جداً، النشيطة بيولوجيا الجزيئات يمكنها اجتياز النواة ليس بسرعة عن طريق نشر2. ونتيجة لهذه الخاصية سريعة الزوال، معظم البروتينات ربط الحمض النووي 'القفز' من ربط الموقع إلى ربط الموقع، شعور طريقهم نحو الفضاء النووية، الذي يسمح ب درجة عالية من التكيف وتنوعاً نواة2.

وعلى الرغم من هذا السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية داخل النواة، النووية الهيئات دون أغشية مثل (ولكن لا تقتصر على) نوية والهيئات كيال promyelocytic سرطان الدم الهيئات النووية (حزب الرابطة الإسلامية-ملحوظة) لا تزال موجودة. ومن خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل تكرار الحمض النووي جنبا إلى جنب (نوية)، الرنا الريباسي (نوية) والبروتينات الهيكلية مثل كوالين (الهيئات كيال) أو حزب الرابطة الإسلامية البروتينات (حزب الرابطة الإسلامية-NB) التي تحمل هذه بنيات معا3،4،5 . وهذه الهياكل والتجمعات الأخرى مثل مصانع النسخ بمثابة السقالات التي ليس فقط زيادة تركيز المحلية من المكونات المطلوبة، ولكن أيضا تنظيم تكوين البروتينات والأحماض النووية داخل كل منها في نهاية المطاف إنشاء موقع مركزي لكفاءة الوظائف الخلوية6.

تصور متى وأين شكل الهياكل النووية يوفر ثروة معلومات للباحثين الذين يدرسون التخلق. من منظور علم الفيروسات، إعادة تنشيط الفيروسات المصابة خفية، مثل كشف، يغير إلى حد كبير المناظر الطبيعية نواة وتوزيع الإنزيمات النووية لتحويل النسخ أساسا من الجينات الخلوية للمورثات الفيروسية، في نهاية المطاف إلى إنتاج ذرية فيروسية تعمل بكامل طاقتها7،8. كيفية التعامل مع كشف إليه تعبير الجينات الخلوية لتيسير التعبير الجيني الفيروسي؟ هذه المعلومات يمكن أيضا تسليط الضوء على آليات تنظيمية الجينات الخلوية الزمانية.

مثل جميع herpesviruses الأخرى، قد كشف اثنين من دورات الحياة يسمى النسخ المتماثل الحال والكمون. كشف أساسا تكمن في مرحلة الكمون، فيها معظم المورثات الفيروسية لها هو إسكات التعبير، ما عدا الكمون المرتبطة الجينات9،10. خلال الكمون تنتج كشف المرتبطة الكمون مستضد النووية (LANA)، الذي يربط الجينوم الفيروسي مؤثرا والحبال الكروماتين الفيروسية إلى الكروموسوم البشري11. بسبب العلاقة ل LANA الحميمة مع الجينوم الفيروسي، فمن الممكن استخدام DAPI وايفا لوصمة عار وتحديد موقع حيث تم ابيسوميس الفيروسية بالنسبة الكروماتين المضيف.

قد أنشئ لدراسة تنشيط كشف على مستوى واحد ابيسومي والرابطة مع أخرى ابيسوميس الفيروسية في إحدى خلايا مصابة، استراتيجية لتحديد موقع تدوين بنشاط فيروسي الكروماتين في الموقع . تبعاً لذلك، LANA وايفا رنابي مع إنترون الجيش الملكي النيبالي-الأسماك كانت مجتمعة، عن طريق توليد تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك التي تربط منطقة إنترون (التحقيق الدقيق يمكن الاطلاع على تسلسل في مختبر إيزومييا في منشور آخر8) ك كشف هيئة الطرق والمواصلات البروتين الفيروسي الرئيسية التي يتم ضرورية وكافية لكشف تنشيط-كان من الممكن تحديد مكان وحيثما كان بالفعل أخذ النسخ8،11،،من1213،14،15 . هذا إنترون تقنية الحمض النووي الريبي-الأسماك تمكن الباحثين تصور فيها نسخها مرناً فورا قبل أن يتم تقسم وتصديرها إلى السيتوبلازم16،17.

يمكن إعادة تنشيط كشف من المحفزات الكيميائية المختلفة بما في ذلك إستر phorbol مثل 12-س-تيتراديكونويل-فوربول-13acetate (طن سنوياً)، ويمكن أن يتسبب هيستون deacetylase مثبطات مثل بوتيرات الصوديوم، بالإضافة إلى ذلك كشف إعادة تنشيط قبل overexpression من عامل النسخ الفيروسية، كهيئه الطرق والمواصلات19. الباحثون نجحت في زيادة كفاءة كشف التنشيط بتزامن دورات للخلية قبل حمل تنشيط18. وهكذا، لهذه الدراسات، وخاصة خلايا تم مزامنة استخدام كتلة thymidine مزدوجة (البروتوكول هو موضح أدناه) والمحتضنة مع طن سنوياً والدوكسي (دوكس) لفترة قصيرة. استخدم دوكسيسيليني لأن خط الخلية المستخدمة في هذه التجارب قد كاسيت كهيئه الطرق والمواصلات الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي، التي تم استنساخ من كدنا ولا تشمل منطقة إنترون كهيئه الطرق والمواصلات. على الرغم من إمكانية إعادة تنشيط استخدام كشف فقط المستحث التعبير كهيئه الطرق والمواصلات، وقد ثبت باحثون آخرون أن سبب مجموعة متنوعة من العوامل البيوكيميائية المختلفة يثبت التعبير كهيئه الطرق والمواصلات وحدها أن تكون ضعيفة إعادة تنشيط محفزات20. عن طريق الجمع بين كل هذه، وعن طريق الحد من إينكوباتيونس المخدرات لفترة قصيرة من الزمن، وقد تحقق إعادة تنشيط كشف قوية ولكن غير مفرط اصطناعية للتصوير.

بعد وضع العلامات LANA، رنابي، introns كهيئه الطرق والمواصلات، والحمض النووي كما هو موضح في هذه الورقة، وأجرى تصوير 3D fluorescence استخدام مجهر deconvolution ويديفيلد. بعد المعالجة مع برامج التصوير، يمكن تقييم التوزيع المكاني ابيسوميس الفيروسية النشطة بشكل صحيح. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسة الأسئلة المركزية فيما يتعلق بالطبيعة الأساسية لتشكيل محاور الكروماتين النشطة وغيرها من الهياكل النووية. وبعد ابيسوميس الفيروسية متطابقة في خلية واحدة تقوم بمعالجة نفس العناصر التنظيمية قد تمثل أداة بحث فريدة من نوعها لتعميق فهم آليات تنظيمية الجينات الزمانية المكانية.

حد تصوير متعددة العينات خلية ثابتة عند نقاط زمنية مختلفة لوصف عملية جزيئية طبيعتها دينامية هو أن التغييرات خفية أو الصغيرة في توزيع الأسفار التي لم يتم كشفها أو تعتبر ضئيلة. وهذا صحيح إلا في حالة نادرة، يعرض كل خلية ولاحظ نفس التغيير خفية. وهكذا، لا يمكن العلاقة الزمانية المكانية الكاملة النشطة النسخ الفيروسية وغيرها من الهياكل النووية خطيرة تقييمه باستخدام التصوير الثابت. لمواجهة هذه التحديات التقنية، أفضل نهج للصورة الخلايا الحية التي تميزت ابيسوميس الفيروسية ومتابعة موقع الإنزيمات الخلوية الرئيسية على مر الزمن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبيه: خطوط الخلايا المستخدمة في هذا الإجراء تحتوي على الفيروسات المعدية وكن حذراً وإلا المضي قدما في مرفق BSL المستوى 2 أو أعلى.

1-الخلية إعداد وصيانة

  1. الثقافة الخلايا TREx-كهيئه الطرق والمواصلات BCBL-1 (أو كشف آخر إصابة خطوط الخلايا PEL) في المتوسط RPMI1640 وتستكمل مع 15% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين والستربتوميسين الجلوتامين الحل.
  2. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2)، مع التأكد من أن تنمو بشكل مستمر وانقسام الخلايا بنسبة 1:4 كل 2 – 4 أيام.
  3. رصد الثقافات الخلية مجهر خفيفة يوميا للتأكد من نمو الخلايا الجيدة ومورفولوجيا، خلاف ذلك فمن المستحسن إعادة تشغيل ثقافة الخلية أو تعديل شروط ثقافة الخلية تبعاً لذلك.

2-thymidine المزامنة وتحريض الحال

  1. في 10 سم طبق بيتري، طازج لوحة TREx-كهيئه الطرق والمواصلات BCBL-1 الخلايا في وسائط الإعلام (1 × 106 خلايا/2 مل من وسائل الإعلام)
  2. إضافة thymidine 200 ملم (التركيز النهائي: 2 مم) إلى الطبق، مزيج واحتضانها ح 18.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الطازجة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام الطازجة.
  4. السماح للخلايا لإنهاء مرحلة ثانية ح 8.
  5. إضافة thymidine (التركيز النهائي: 2 مم) وخلط واحتضانها ح 16.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الطازجة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام الطازجة.
  7. للحث على إعادة تنشيط الفيروسات، إضافة 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (طن سنوياً، التركيز النهائي 20 نانوغرام/ملليلتر) والدوكسي (دوكس، تركيز نهائي 100 نانوغرام/مل) في ثقافة الخلية وخلط واحتضانها ح 4. لخطوط الخلايا دون كاسيت إيندوسيبلي كهيئه الطرق والمواصلات، تحفز على إعادة تنشيط استخدام طن سنوياً (التركيز النهائي 20 نانوغرام/مليلتر والصوديوم butyrate (1 مم)).
  8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غ. س 500 تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) والطرد المركزي مرة أخرى وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة كاملة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل. ريسوسبيند في وسائل الإعلام ثقافة كاملة.
  9. السماح للخلايا أن تنمو على ح 24.

3-التثبيت وبيرميبيليزيشن

ملاحظة: قبل المتابعة، تأكد من تحديد الحل (3.7% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني تعامل ديبك)، ثنائي إثيل بيروكاربوناتي معاملة مخزنة الفوسفات المالحة (ديبك-برنامج تلفزيوني)، جليكاين "ديبك برنامج تلفزيوني" (تركيز جليكاين النهائي: 100 ملم) والحل بيرميبيليزاتينج (50% الأسيتون، 50% ميثانول) يتم إعدادها. عادة، كل شريحة سوف تتطلب على الأقل 0.5 مليون الخلايا وتتضاعف إذا لزم الأمر وتشمل خلايا إضافية للخلف حتى لا سيما إذا كانت الخلايا غير صحية.

  1. جمع الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 200 x غ. غسيل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من "برنامج تلفزيوني ديبك" العقيمة. ريسوسبيند 1.2 مل من برنامج تلفزيوني ديبك.
  3. ضع العدد المناسب من كوفيرسليبس (يحدده الإعداد التجريبية) في القيعان من لوحة 6-جيدا.
  4. "الماصة؛" ميليلتر 200 خلية خليط "ديبك برنامج تلفزيوني" على كل ساترة، والتأكد من وجود خلايا على الأقل 0.5 مليون على كل شريحة. السماح للخلايا بتسوية لمدة 2 دقيقة، ونضح PBS ديبك الزائدة التي تترك سوى طبقة رقيقة من الخلايا. فمن الطبيعي بالنسبة للخلايا المراد إزالتها في هذه العملية.
    تنبيه: منهاج العمل السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
  5. أضف 1 مل من تحديد الحل (3.7% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني ديبك) لكل كشف الغطاء بعناية. السماح للخلايا لإصلاح لمدة 10 دقائق.
  6. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع "برنامج تلفزيوني ديبك".
  7. أضف 1 مل جليكاين "ديبك برنامج تلفزيوني" بعناية (التركيز النهائي جليكاين: 100 ملم) لكل كشف الغطاء. السماح للخلايا لإخماد لمدة 5 دقائق.
  8. إضافة 1.5 مل "برنامج تلفزيوني ديبك" وأي مكان في شاكر لمدة 5 دقائق أو هزة بحزم ولكن برفق في اليد للحد الأدنى 1 أسبيراتي "برنامج تلفزيوني ديبك" الزائدة. احرص على عدم تعطيل الخلايا. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 3 يغسل.
  9. أضف 1 مل من بيرميبيليزينج الحل (الأسيتون 50%، 50% ميثانول) لكل كشف الغطاء بعناية. السماح للخلايا إلى بيرميبيليزي لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزينها في كوفيرسليبس في ثلاجة-20 درجة مئوية لمدة لا تزيد على أسبوع واحد. تجنب تجميد أو تقليل الوقت الذي يقضيه في الثلاجة كما يمكن أن تتحلل جودة الصورة بسرعة. تأكد من أن عند في الثلاجة التي تظل الخلايا رطبة ومغطاة في الميثانول/الأسيتون، وضمان أنها ترطيب بشكل صحيح مع "برنامج تلفزيوني ديبك" بعد إزالة من الثلاجة.
  10. إضافة 1.5 مل "برنامج تلفزيوني ديبك" وأي مكان في شاكر لمدة 5 دقائق أو هزة بقوة ولكن برفق في يد نضح للحد الأدنى 1 "برنامج تلفزيوني ديبك" الزائدة، يجب الحرص على عدم تعطيل الخلايا. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 3 يغسل.

4-إيفا، والجيش الملكي النيبالي-الأسماك

ملاحظة: فيما يتعلق بتسمية مسبار "الحمض النووي الريبي الأسماك" وإعداد: كهيئه الطرق والمواصلات إنترون وهو 959 قاعدة أزواج، وتحقيقات مختلفة 31 تم إنشاؤها التي كانت 20 قاعدة أزواج كل منها يحتوي على نشرة مصورة عمومية المحتوى من حوالي 50%. حلول العمل والأسهم التحقيقات كانت الكوتيد إلى 100 ميكرومتر و 2.5 ميكرون التركيزات، على التوالي.

  1. التسمية شرائح المجهر مع المعلومات التجريبية اللازمة أو نوعا من تسمية مميزة.
  2. خط الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك يمكن إغلاقها بشرط مع منشفة ورقية رطبة.
  3. إعداد الحل جسم الأولية (1.5 ميليلتر جسم LANA، ميليلتر 0.75 من جسم رنا بول الثاني، 3 ميليلتر من خبازة خميرة الحمض الريبي النووي النقال، "برنامج تلفزيوني ديبك" ما يصل إلى 30 ميليلتر)، وتتكاثر بوصفه لكل ساترة الحالية. مكان 30 ميليلتر من محلول جسم الأولية على كل شريحة المجهر المسمى.
    1. تيتراتي جسم الأولية ذات الأهمية الأولى واستخدم المبلغ الأمثل. تأكد من استخدام مفتش المنقي، المصل (سائل الاستسقاء) قد تحتوي على كمية كبيرة من رناسي.
  4. ضع ساترة (الخلايا التي تواجه الحل) على الشرائح المجهر المسمى ونقل الشرائح إلى الحاوية مع منشفة ورقية رطبة. احرص على عدم إدخال فقاعات. تغطية السطح الخارجي للحاوية مع غلاف بلاستيكي. نقل الحاوية إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية ح 1.
  5. إعداد المخزن مؤقت يغسل السمك (2 x المالحة سترات الصوديوم العازلة (SSC) (نهائي)، ميثلامين 10%، 90% dH ديبك2س).
  6. إعداد 2 × التهجين المخزن المؤقت (4 x SSC، كبريتات ديكستران 20%).
  7. إعداد الأجسام المضادة الثانوية والأسماك إنترون المسبار المخزن المؤقت (20 ميليلتر من 2 × التهجين المخزن المؤقت (1 النهائي x هيب المخزن المؤقت)، 4 ميليلتر بيكر للخميرة الحمض الريبي النووي النقال (النهائي 10%)، 4 ميليلتر من ميثلامين (النهائي 10%)، مسبار إنترون كهيئه الطرق والمواصلات (125 النهائي nM)، 0.8 ميكروغرام للجسم المضاد الثانوي، dH ديبك2 يا ما يصل إلى 40 ميليلتر). اضرب وصفه لكل الشرائح المطلوبة.
  8. بعد الحضانة، يغسل خلايا 3 مرات مع "برنامج تلفزيوني ديبك" في لوحة 6 جيدا لمدة 5 دقائق.
  9. يغسل مع المخزن المؤقت ليغسل السمك 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل. تبقى ساترة في المخزن المؤقت ليغسل السمك حتى الانتهاء من إعداد خليط من ثانيا التحقيق جسم وانترون (الخطوة 4، 7).
  10. الشرائح الزجاجية النظيفة المستخدمة لتفريخ جسم الأولية التهجين.
  11. ضع ميليلتر 40 جسم الثانوية ومسبار إنترون الأسماك التي تحتوي على الحل على كل شريحة الزجاج.
  12. ضع كوفيرسليبس مع الخلايا على الشرائح مع الجانب الخلية أسفل فوق المخزن المؤقت، ويكون حذراً من عدم إدخال فقاعات.
  13. وضع الشرائح في وعاء من بلاستيك مع منشفة ورقية رطبة على الجزء السفلي. التفاف الحاويات البلاستيكية في غلاف بلاستيكي أولاً ثم رقائق الألومنيوم.
  14. احتضان الحاوية مع الشرائح في 37 درجة مئوية ح 16-24.
  15. بعد الحضانة، بعناية الشريحة ساترة من الحافة من الشريحة الزجاجية، ووضع مرة أخرى في 6 لوحات جيدا مواجهة، وتغسل الخلايا مع المخزن المؤقت ليغسل السمك 3 مرات في 6 لوحة جيدا لمدة 5 دقائق في كل.
  16. تغسل الخلايا مرات 2 مع 2 x SSC.
  17. إضافة DAPI (1:1، 000) في 2 x SSC، والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  18. تغسل الخلايا مرات 2 مع 2 x SSC.
  19. تنظيف الشرائح الزجاجية المستخدمة التهجين، وإضافة 10 ميليلتر لتركيب محلول على الشرائح الزجاجية.
  20. ضع الوجه كوفيرسليبس إلى أسفل على الحل المتصاعدة. احرص على عدم إدخال فقاعات.
  21. بلطف مع أنسجة مختبرية، إزالة الحل تركيب الزائدة، مع الحرص على عدم الاسكواش الخلايا.
  22. استخدام طلاء الأظافر، تطبيق طبقة وافرة حول حافة كوفيرسليبس والسماح لتجف.
  23. المضي قدما لإجراء الفحص المجهري الأسفار.

5-3D Fluorescence الفحص المجهري

ملاحظة: في حين سوف تختلف بروتوكولات مع نوع نظام مجهر الأسفار المستخدمة، ستساعد الخطوات التالية لضمان الحصول على بيانات الصورة المثلى للتحليل الكمي.

  1. بريتريت عينات الثابتة وجبل في وسائل الإعلام تتلاشى المضادة لتأخير فوتوبليتشينج fluorescence أثناء التصوير.
  2. استخدام هدف عالية جودة (مثل 60 × 1.42 N.A نفط-غمر عدسة)، الذي يمكن التقاط كل خلية (أو نواة الخلية) في الحقل من العرض.
  3. تعيين معلمات التعرض (مثل، قوة الإثارة، وزمن التعرض للضوء) لكل قناة لون الأسفار، باستخدام عينات مراقبة إيجابية وسلبية. الحصول على الصور الفلورية.
    ملاحظة: مراقبة إيجابية العينات التي تحتوي على التسمية الفلورسنت واحدة فقط يجب ستستخدم أيضا لتحديد مستوى "الحديث المتبادل" بين قنوات اللون. للتصوير عينات الخلايا الثابتة، يمكن تخفيض طاقة الإثارة الفلورية (مع التعرض لأوقات أطول قليلاً) للتقليل من فوتوبليتشينج.
  4. متى أنشئت في بروتوكول التصوير، الحفاظ على نفس المعلمات التعرض متسقة بالنسبة لجميع العينات في دراسة – حيث أنه يمكن تحليل ومقارنة بيانات الصورة بدقة.
  5. أداء معالجة ما بعد اقتناء الصور وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. تحديد النصوص كهيئه الطرق والمواصلات بإشارة الجيش الملكي النيبالي-الأسماك (أحمر)، والجزيئات LANA الفلورة (الأخضر)، والكروماتين النووي (حيثما ينطبق ذلك) ملطخة DAPI (أزرق).
    ملاحظة: مناطق نواة الخلية، التي كهيئه الطرق والمواصلات LANA وشارك متفاوت المسافات، وبالتالي يعتقد أن تترافق مع المصانع الفيروسية النسخ والنسخ المتماثل معقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان تنفيذ بروتوكول مختصرة قليلاً حيث استخدمت خلايا BCBL-1 وإلا LANA ورنا كهيئه الطرق والمواصلات كانت الملون (الشكل 1). هذه التجربة يسمح لنا بالنظر فيها بنشاط الاختزال ابيسوميس الفيروسية وعدم تجانس الاستجابة للمحفزات تنشيط كشف في عدد أن خلايا. في الخلية هو مبين بالسهم في الشكل 1، الأسفار كهيئه الطرق والمواصلات متميزة في المناطق التي تطابق توزيع ابيسوميس الفيروسية (ملحوظ مع LANA) أدلة للنسخ النشطة أخذ مكان قريب من كشف الجينوم. في ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك بعض الجوانب للبروتوكول التي يمكن تعديلها لاستيعاب ظروف غير عادية. ويمكن أيضا تغيير خيار التثبيت و permeabilization المخازن المؤقتة. للمخازن المؤقتة للتثبيت، بارافورمالدهيد أيضا فعال ويمكن استخدام الإيثانول بيرميبيليزيشن.

تبريد الفورمالدهايد مع جليكاين يوصي برنامج تلفزيوني كما أنه يمنع فورمالدهايد تعطيل الأجسام المضادة في حالة عدم وجود ألبومين المصل البقري (BSA)، ولكن إذا كان يتم غسلها كوفيرسليبس دقة كافية، يمكن تخطي هذه الخطوة برنامج تلفزيوني جليكاين. في البروتوكول، وتجنب استخدام ألبومين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واضعي هذه الورقة ليس لهم علاقات مالية أو تضارب المصالح المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من منحة "المعاهد الوطنية للصحة" (R01-DE025985) و "الأمريكية سرطان المجتمع البحث الباحث تحكيم" (RSG-13-383-MPC). وأيد هذا العمل أيضا منح من وزارة الزراعة الأمريكية (2015-67015-23268 و 2014-67015-21787) ومنحة مبادرة بحوث جديدة من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI متوسط 1650 GlutaMAXGibco من Life Technologies61870-036يحتاج إلى التسخين إلى 37 درجة ؛ C
مصل الأبقار الجنينأوميغا العلمية Inc.FB-11
Pen Strep Glutamine (100x)Gibco by Life Technologies10378-016
Thymidine سيجما ألدريتشT9250
Dulbecco s محلول الفوسفاتالمخزن Gibco من Life Technologies14190-144
TPASigma AldrichP1585
زبدات الصوديوم  Sigma AldrichB5887
محلول الفورمالديهايد  سيجما ألدريتش252549، سام ، مخاطر صحية
ثنائي إيثيل بيروكربوناتسيجما ألدريتشD-5758سمية حادة   ؛
جلايسينسيجما ألدريتش410225
الأسيتونسيجما ألدريتش179124للاشتعال وسام
الميثانولفيشر كيماويكال   ؛67-56-1للفئران قابل للاشتعال ، سام ، خطير على الصحة
ل KSHV / HHV-8 ORF73التقنيات الحيوية المتقدمة13-210-100
استنساخ الأجسام المضادة للبوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني CTD4H8EMD Milipore05-623
الحمض النووي الريبي ، النقل من الخباز خميرة (S. cerevisiae) Sigma Aldrich9014-25-9
ملحي سترات الصوديوم 20x (SSC)Thermo Fisher Scientific 15557044
فورماميد سيجما ألدريتش295876
Omnipur Dextran, محلول 50٪EMD Milipore1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, dihydrochloride)Thermo Fisher Scientific D1306
slowFade Gold الكاشف المضاد للبهتانLife TechnologiesS36936
غطاء صغير 22x22MatsunamiC022221
VoloCITYالتصوير ثلاثي الأبعاد
DeltaVision مجهر
Superfrost / Plus شرائح مجهرفيشر Scientific12-550-15
تآكل قابل جسم مضاد أحادي النسيلة محلول زجاج برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30(2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192(2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300(2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة