نقدم هنا، طريقة بسيطة كوانتيتاتي المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف (هسبكس) في الزرد الجنينية. يتم مطلي هسبكس من الزرد منفصلان في ميثيلسيلولوسي مع عوامل داعمة، التفريق في الدم الناضجة. يسمح هذا الكشف عن الدم العيوب ويسمح للمخدرات الفرز ستجري بسهولة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هيماتوبويسيس هو عملية خلوية أساسية التي تفرق الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) في العديد الأنساب الخلية المختلفة التي تتألف منها الدم الناضجة. يصعب عزل وتحديد هذه هسبكس لأنها محددة الأمر الواقع اللاحق؛ لا يمكن تحديد بعد على التمايز في الأنساب الخلية المحددة. على مدى العقود القليلة الماضية، أصبحت الزرد (دانيو rerio) كائن نموذج لدراسة هيماتوبويسيس. الأجنة الزرد وضع خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) قد ولدت نهائي هسبكس. فحوصات لتقييم التمايز هسبك وطورت قدرات انتشار استخدام زرع واللاحقة إعادة تشكيل النظام المكونة للدم بالإضافة إلى تصور خطوط المعدلة وراثيا المتخصصة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. بيد أن هذه الاختبارات تكلفة باهظة وصعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً للعديد من المختبرات. وضع نموذج لتقييم هسبكس في المختبر ستكون فعالة من حيث التكلفة، وأسرع، وصعوبات أقل مقارنة بالسابق ووصف الأساليب، السماح لمختبرات تقييم شاشات الطفرات والعقاقير التي تؤثر على بيولوجيا هسبك بسرعة. هذه الرواية في المختبر فحص لتقييم هسبكس يؤديها تصفيح فصل الزرد كله الأجنة وإضافة عوامل خارجية تعزز فقط هسبك التفريق والانتشار. فصل في الخلايا المفردة ومطلي مع عوامل تحفيز مستعمرة هسبك الداعمة التي تسبب لهم لإنشاء مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) التي تنشأ من خلية واحدة السلف الأجنة. ينبغي أن تسمح هذه فحوصات دراسة متأنية أكثر من المسارات الجزيئية مسؤولة عن انتشار هسبك، والتمايز، والتنظيم، التي سوف تسمح للباحثين لفهم أسس هيماتوبويسيس الفقاريات والتقلبات أثناء المرض.
المقدمة
هيماتوبويسيس هو عملية صنع العديد خلايا الدم الناضجة اللازمة لبقاء الكائن الحي. أنها عملية إنمائية رئيسية ينطوي على التفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا تنمويا المقيدة التي تتألف منها الدم الناضجة. يجب تجديد هذه هسكس ذاتيا حيث أن النظام لم تستنفد، وأنها يجب أن تستمر من التنمية الجنينية المبكرة حتى الموت. في الفقاريات، هناك حاجة إلى تغذية كافية غالبية خلايا الدم التي يتم بعدها الانقسامية التمايز المستمر وانتشار الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) ويجري إعادة تدويرها كل يوم. هسكس توليد خلايا الدم الناضجة بالتفريق الأولى إلى مجموعات فرعية خلايا السلف مقيد؛ المشتركة المتكفل اللمفاوية (المعنية)1، و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافق المجلس الاستشاري "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية كاليفورنيا، شيكو، جميع الأساليب المذكورة أدناه.
1-التبييض 48 هبف الزرد الأجنة
- مع 15 سم x 15 (w) سم (l) × 7 سم (ح) حاويات بلاستيكية إنشاء 3 محطات للمياه والصرف الصحي: 1) مع 1 مل التبييض 5 ٪ في المتوسط الجنين 1000 مل (E3) (انظر الجدول 1) 2) E3 العقيمة، ومع 3) مع E3 العقيمة. التأكد من 500 مل من محلول إلى غمر الأجنة في كل حاوية.
ملاحظة: لكل حالة اختبار، سيلزم على الأقل 10 أجنة. ويتسع هذا الإجراء الغسيل الأجنة يصل إلى 200. - مع ماصة نقل، وضع الأجنة في مصفاة الشاي وغمر البيض في محطة الغسيل #1 5 الحد الأدنى إزالة مصفاة الشاي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقييم الأرقام هسبك في الزرد الجنينية، يهضم 48 هبف الأجنة، مطلي في ميثيلسيلولوسي مع عوامل النمو المكونة للدم داعمة خارجية، والمحتضنة لمدة 7 أيام (الشكل 1أ). بعد 7 أيام، كانت مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) المذكورة (الشكل 1ب) والمصورة (الشكل 1ج). عن طريق التحكم في السيتوكينات المختلفة وأضاف، واحدة يمكن التحكم في أنواع المستعمرات المنتجة: مكتب البراءات الأو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أصبح النظام النموذجي الزرد نموذجا كفؤة وفعالة وغير مكلفة لدراسة هيماتوبويسيس الفقاريات البدائية ونهائي. ويمكن استخدام جيل فحوصات سريعة وغير مكلفة، ويقدم بعض الصعوبات التقنية لاختبار الجزيئات الصغيرة وتحليل الأجنة متحولة، وتوضيح المسارات الجزيئية الهامة للبيولوجيا هسبك. في المختبر الطلاء من هسبكس من الزرد الكبار وسيلة فعالة لدراسة الطفرات، السيتوكينات، وعيوب المكونة للدم. هذا البروتوكول يستند إلى تلك الدراسات، ولكن يستخدم الزرد الجنينية. تطبيق هذه الاختبارات على الزرد الجنينية يسمح لجمع البيانات أسرع، واستخدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
تم توفير التمويل من "معاهد الصحة الوطنية" (المعاهد الوطنية للصحة: K01-DK087814-01A1 إلى D.L.S.)، "برنامج جامعة كاليفورنيا الولاية" للتعليم والبحوث في مجال التكنولوجيا الأحيائية (كسوبيرب: "السيطرة الجزيئية" من "الفقاريات مكانة المكونة للدم" إلى D.L.S.) ومن مكتب الدراسات العليا في جامعة ولاية كاليفورنيا في تشيكو (إلى A.C.B.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10٪ ألبومين مصل البقر في تقنيات الخلايا الجذعية MDM من Iscove | . | 9300 | |
| DPBS (10x) مع الكالسيوم 2 + < / sup> والمغنيسيوم 2 + < / sup> | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 مل | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 مل | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 مل (1 م) | تقنيات Gibco life | 15-630-080 | |
| البنسلين / الستربتومايسين (5000 وحدة / مل و 5000 مجم / مل) مع L-Glutamine (200 مل) Corning | Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 مل (50 مجم / مل) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 مل أنبوب MCF | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 مل 23gx1 إبرة حقن مع قفل لور | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 مل أنبوب سفلي دائري من البوليسترين مع غطاء مصفاة الخلية | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 مل أنبوب دائري من البوليسترين | كورنينج فالكون | 352057 | |
| 10 ملم بوليسترين إيزي جراب طبق بتري | كورنينج فالكون | 351008 | |
| ليبريز TM | روش سيجما ألدريتش | 5401119001 | تفكك البروتياز |
| بروناس | روش سيجما ألدريتش | 11459643001 | ديكوريونايشن بروتياز |
| 15 سم طبق بتري | كورنينج فالكون | 351058 | |
| AB | مركز الموارد الدولي لأسماك الزرد (ZIRC) | تستخدم سلالة أسماك الزرد | ZL1 |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
المراجع
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدممقايسة أجنة سمك الزيبراتحليل الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم في المختبرالوحدات المكونة للمستعمراتبروتوكول تفكيك الأجنةمقايسة مستعمرات الميثيل سليلوزتعداد السلفيات المكونة للدمتطور الدم في سمك الزيبرامقايسة التحفيز بالسيتوكيناتتمايز وتكاثر الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم
