مقالة منهجية

تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

DOI:

10.3791/56836

⸱

نوفمبر 30, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، طريقة بسيطة كوانتيتاتي المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف (هسبكس) في الزرد الجنينية. يتم مطلي هسبكس من الزرد منفصلان في ميثيلسيلولوسي مع عوامل داعمة، التفريق في الدم الناضجة. يسمح هذا الكشف عن الدم العيوب ويسمح للمخدرات الفرز ستجري بسهولة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هيماتوبويسيس هو عملية خلوية أساسية التي تفرق الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) في العديد الأنساب الخلية المختلفة التي تتألف منها الدم الناضجة. يصعب عزل وتحديد هذه هسبكس لأنها محددة الأمر الواقع اللاحق؛ لا يمكن تحديد بعد على التمايز في الأنساب الخلية المحددة. على مدى العقود القليلة الماضية، أصبحت الزرد (دانيو rerio) كائن نموذج لدراسة هيماتوبويسيس. الأجنة الزرد وضع خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) قد ولدت نهائي هسبكس. فحوصات لتقييم التمايز هسبك وطورت قدرات انتشار استخدام زرع واللاحقة إعادة تشكيل النظام المكونة للدم بالإضافة إلى تصور خطوط المعدلة وراثيا المتخصصة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. بيد أن هذه الاختبارات تكلفة باهظة وصعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً للعديد من المختبرات. وضع نموذج لتقييم هسبكس في المختبر ستكون فعالة من حيث التكلفة، وأسرع، وصعوبات أقل مقارنة بالسابق ووصف الأساليب، السماح لمختبرات تقييم شاشات الطفرات والعقاقير التي تؤثر على بيولوجيا هسبك بسرعة. هذه الرواية في المختبر فحص لتقييم هسبكس يؤديها تصفيح فصل الزرد كله الأجنة وإضافة عوامل خارجية تعزز فقط هسبك التفريق والانتشار. فصل في الخلايا المفردة ومطلي مع عوامل تحفيز مستعمرة هسبك الداعمة التي تسبب لهم لإنشاء مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) التي تنشأ من خلية واحدة السلف الأجنة. ينبغي أن تسمح هذه فحوصات دراسة متأنية أكثر من المسارات الجزيئية مسؤولة عن انتشار هسبك، والتمايز، والتنظيم، التي سوف تسمح للباحثين لفهم أسس هيماتوبويسيس الفقاريات والتقلبات أثناء المرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هيماتوبويسيس هو عملية صنع العديد خلايا الدم الناضجة اللازمة لبقاء الكائن الحي. أنها عملية إنمائية رئيسية ينطوي على التفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا تنمويا المقيدة التي تتألف منها الدم الناضجة. يجب تجديد هذه هسكس ذاتيا حيث أن النظام لم تستنفد، وأنها يجب أن تستمر من التنمية الجنينية المبكرة حتى الموت. في الفقاريات، هناك حاجة إلى تغذية كافية غالبية خلايا الدم التي يتم بعدها الانقسامية التمايز المستمر وانتشار الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) ويجري إعادة تدويرها كل يوم. هسكس توليد خلايا الدم الناضجة بالتفريق الأولى إلى مجموعات فرعية خلايا السلف مقيد؛ المشتركة المتكفل اللمفاوية (المعنية)1، والذي في نهاية المطاف إنتاج خلايا تي وب ناغورني-كاراباخ، و المتكفل النقوي (CMPs) المشتركة2 التي تولد المحببة والكريات الحمراء والضامة وميجاكاريوسيتيس. هذه المتكفل ملتزمون بتوليد الأنساب خلية معينة، وكذلك تفرق في المزيد من الخلايا السلف تنمويا المقيدة مثل المتكفل محمر النقوي (MEPs) التي تولد الكريات الحمراء والصفائح الدموية، أو المحببات بلعم موروث (غمبس) التي تولد الحمضات والعدلات، الاسسه والضامة2. تحديد وعزل هذه المتكفل تتيح تحديد المسارات الجزيئية الهامة المشاركة في تمايز المكونة للدم والعديد من الأمراض المكونة للدم مثل اللوكيميا تنشأ عندما تعجز هذه الخلايا السلف بشكل صحيح التفريق.

على مدى العقود القليلة الماضية، أصبح النظام النموذجي الزرد (دانيو rerio) أداة بحث رئيسية للدراسات المكونة للدم الجنينية والكبار. الزرد قابلة للتحليل الجيني والأنواع النموذجية الفقاريات فيلوجينيتيكالي أدنى المفرج مماثلة ونظام المكونة للدم للبشر. تطوير الزرد الأجنة خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد إنشاء التسميد (hpf) هسبكس3،4،،من56،،من78. الزرد أيضا مثمر جداً، مع الإناث زرع على البيض 100 في مخلب واحد، مما يسمح للعينات ذات الأحجام الكبيرة والنسخ المتماثل التجريبية. الأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح لرؤية مجهرية للنظام المكونة للدم. عدة خطوط المعدلة وراثيا الفلورسنت الزرد وسم هسكس مثل runx1: اجفب الأسماك9، cd41: اجفب الأسماك10، و كدرل:مشري؛ كميب: بروتينات فلورية خضراء3 إيجابية مزدوجة الحيوانات، والسماح للتصور في الوقت الحقيقي، والعيش من HSC نشوء وتوسع في فيفو3،4،،من78، 9. الزرد توليد سريعة الوقت والتنمية خارج الرحم أدى إلى استخدامه في الطفرات الدراسات11،،من1213،،من1415 والمخدرات فحص16،17،،من1819،20 للمركبات التي تبشر العلاجية لاضطرابات الدم البشري. عموما، جعلت الحفاظ على المنظومة المكونة للدم، ووجود وسهل تطوير خطوط المحورة وراثيا، ووقت التجديد السريع الزرد نموذجا غير مكلفة وسريعة ومرنة ومثالية للدراسات المكونة للدم.

وقد وضعت أساليب عديدة لعزل واختبار هسكس في الثدييات الأنظمة المكونة للدم. يمكن استخدام المحققين مزيجاً من مستقبلات الخلية السطحية وضع علامة هسكس21،22،،من2324، فضلا عن استغلال قدرة هسكس efflux صبغ25،26. بعد أنها وصفت، يسمح fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) الانفصال الجسدي. تثبت أن خلية هي HSC يتطلب الإشعاعية حيوان مضيف لتدمير هسبكس الذاتية، زرع هسكس المفترضة، ومراقبة إعادة تشكيل طويلة الأجل، ونسب متعددة جميع أنواع خلايا الدم الناضجة. هذه فحوصات تعمل جيدا في الفئران، كما أن هناك العديد من الأجسام المضادة سطح الخلية ضد الخلايا المكونة للدم وسلالات الماوس الفطرية التي تيسر مطابقة المناعي للزرع. ومع ذلك، قد القليلة الزرد سطح الخلية المكونة للدم أجسام ولدت27، التي تعوق تحديد وعزل هسكس. الطريقة الأكثر شيوعاً للاحتفال وعزل هسكس الزرد مع الحيوانات المحورة وراثيا، حيث يقود تسلسل منظم خلية محددة التعبير بروتين فلوري في. وقد تصور الدراسات وتعداد هسكس في الجدار البطني للشريان الاورطي الظهرية مع الفحص المجهري استخدام هذا الأسلوب3،4،،من89. مختبرات أخرى قد ولدت ضغوطا الاستنساخ الزرد28،29 وإجراء عمليات الزرع الناجحة في الحيوانات مطابقة MHC30. ومع ذلك، هذه التقنيات هي التكلفة الباهظة للعديد من المختبرات ويصعب من الناحية الفنية، وهي مضيعة للوقت. لمعالجة هذه القضايا، قد ولدت مختبرات عدة فحوصات في المختبر لاختبار الوجود ومعدلات انتشار وقدرة التمايز، هسبكس31،،من3233 35،،من 3436. إظهار هذه فحوصات الانتشار والتفريق بين هسبكس في المختبر31،32،،من3334،35،36، إنقاذ 36من عيوب المكونة للدم، ووسيلة فعالة لاكتشاف واختبار السيتوكينات33،،من3435. وقد استخدمت أيضا لتحديد الجينات المسؤولة عن هسبك البيولوجيا31،32. في هذه الدراسة، نأخذ هذه الاختبارات خطوة أخرى، مما يتيح كوانتيتيشن هسبكس في جنينا الزرد نامية. كما يمكن أن تستخدم هذه الاختبارات قوانتيتاتي عدد هسبكس في الحيوانات المسخ والحيوانات تعامل مع الأدوية المكونة للدم التخريبية. في جوهرها، هذه فحوصات سريعة، وهذا من التحديات التقنية القليلة، وهي طرق غير مكلفة كوانتيتاتي أرقام هسبك ودراسة انتشارها، والتحقيق في كتل في التفريق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق المجلس الاستشاري "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية كاليفورنيا، شيكو، جميع الأساليب المذكورة أدناه.

1-التبييض 48 هبف الزرد الأجنة

  1. مع 15 سم x 15 (w) سم (l) × 7 سم (ح) حاويات بلاستيكية إنشاء 3 محطات للمياه والصرف الصحي: 1) مع 1 مل التبييض 5 ٪ في المتوسط الجنين 1000 مل (E3) (انظر الجدول 1) 2) E3 العقيمة، ومع 3) مع E3 العقيمة. التأكد من 500 مل من محلول إلى غمر الأجنة في كل حاوية.
    ملاحظة: لكل حالة اختبار، سيلزم على الأقل 10 أجنة. ويتسع هذا الإجراء الغسيل الأجنة يصل إلى 200.
  2. مع ماصة نقل، وضع الأجنة في مصفاة الشاي وغمر البيض في محطة الغسيل #1 5 الحد الأدنى إزالة مصفاة الشاي (مع الأجنة داخل) ووضع في محطة الغسيل #2 لمدة 5 دقائق؛ كرر محطة الغسيل #3 لدقيقة 5 نهائي.
  3. بعد الغسيل الأخير، قبالة شطف الأجنة من مصفاة الشاي بتحويلها رأسا على مدى 10 سم نظيفة طبق بيتري والشطف بلطف الأجنة مصفاة الشاي مع E3 العقيمة وماصة نقل.

2-ديتشوريوناتي الأجنة

  1. مع ماصة نقل، إزالة وتجاهل E3 قدر ممكن من طبق بيتري وإضافة 500 ميكروليتر من البروتياز ديتشوريونيشن (10 مغ/مل) للأجنة. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 اضغط بلطف إلى جانب طبق بيتري لإزالة تشوريونس.
  2. مع ماصة مصلية، إضافة 20 مل E3 العقيمة تمييع حوزتي. السماح للأجنة لتسوية، وإزالة E3 مع ماصة نقل. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات لإزالة جميع آثار حوزتي ديتشوريونيشن.

3-إعداد عينات الأجنة

  1. استخدام ماصة P1000، ضع 10 أجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد معقم 1.5 مل.
  2. إزالة E3 مع ماصة، وتجاهل.
    تنبيه: "الماصة؛" بعناية كما يمكن بسهولة المشردين الأجنة وتجاهل أثناء الغسيل الخطوات التالية.

4-إعداد أجنة للانفصال

  1. نقل العينات إلى هود الاندفاق الصفحي، وتغسل الأجنة بإضافة 1 مل E3 العقيمة. السماح للأجنة لتسوية إلى أسفل الأنبوب وإزالة المادة طافية مع ماصة P1000. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل.
  2. بعد غسل آخر، إزالة E3 وتجاهل. أضف 1 مل من 10 مم ديثيوثريتول (DTT) في E3 لإزالة الطلاء المخاط (وأي جراثيم أو خميرة أو البكتيريا التي قد حوصروا في ذلك) المحيطة الزرد الجنينية. وضع أنبوب ميكروسينتريفوجي أفقياً، واحتضان في درجة حرارة الغرفة في هود الاندفاق الصفحي لمدة 25 دقيقة.

5-الأجنة الانفصال

  1. تغسل العينة 3 مرات مع 1 مل دببس العقيمة (مع Ca2 + و Mg2 +). بعد غسل الماضي إضافة 500 ميكروليتر من دببس (مع Ca2 + و Mg2 +) وإضافة 5 ميكروليتر من مبطلات الانفصال 5 ملغ/مل (26 U/mL).
    تنبيه: هذا الإنزيم يحتاج Ca2 + و Mg2 +، حتى تضمن أن دببس تحتوي على هذه الأيونات.
  2. احتضان عينات في 37 درجة مئوية في شاكر مداري أفقي 180 لفة في الدقيقة للعينات مكان 60 دقيقة في هود الاندفاق الصفحي وتريتوراتي الأجنة مع P1000 حتى يتم فصل العينات تماما.
    تنبيه: فحص الأجنة بشكل دوري لتحديد متى تصبح نات بأنهم. يجب أن يكون الحل الجنين كمية من الأنسجة الحالية؛ يجب أن لا متجانسة تماما. فمن الممكن لهضم المفرط، الذي سوف يدمر هسبكس (انظر تكميلية الشكل 1).

6-إعداد أجنة ينتابها

  1. ماصة 10 فصل الأجنة إلى الخزان العلوي البوليسترين 5 مل الجولة أنبوب أسفل مع قبعة مصفاة خلية ميكرومترات 35.
  2. مع ماصة، تصفية شطف الأنبوب بيتري مع PBS العقيمة (مع لا Ca2 + أو Mg2 +) ونقل الحل إلى 5 مل البوليستيرين أنبوب يحتوي على خلايا من الخطوة 6، 1. كرر حتى 4 مل سائل موجود في أنبوب البوليستيرين 5 مل.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني أو دببس، أو حلول أخرى مخزنة متساوي التوتر قد تستعمل في هذه المرحلة، طالما أنها لا تحتوي على Ca2 + أو Mg2 +
  3. الطرد المركزي أنابيب في 4 درجة مئوية و 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه العينة خلية المتجانس. مع ماصة، إزالة وتجاهل المادة طافية من أنبوب أسفل جولة. الحرص على عدم تعطيل الخلايا القريبون في الجزء السفلي من الأنبوب. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.

7-إعداد ميثيلسيلولوسي

  1. توليد 1 × الحل الأسهم methylcellulose كاملة (الجدول 1) وإضافة 2.5 مل لأنابيب معقمة أسفل الجولة 14 مل مع 3 مل المحاقن والإبر ز 16. استخدام أنبوب واحد لكل حالة اختبار.
  2. إضافة السيتوكينات، والجزيئات الصغيرة، أو وكلاء آخرين التحقيق لكل عينة.
    1. التفريق النقوي، إضافة 1% كارب 0.3 ملغ/مل والمصل الزرد المؤتلف المحببات مستعمرة حفز عامل (Gcsf)34 إلى متوسط ميثيلسيلولوسي. انظر سفوبودا et al. 37 لوصف كامل على كيفية توليد سمك الشبوط السيتوكينات المصل والمؤتلف.
    2. التفريق محمر، إضافة 1% كارب المصل و 0.1 مغ/مل الزرد المؤتلف الاريثروبويتين (Epo)38 إلى المتوسطة methylcellulose.
    3. بحث موروث مولتيلينيجي، أضف البراءات وجكسف.
      تنبيه: السيتوكينات، والمضافات، ينبغي أن لا مجموع أكثر من 10% الحجم الإجمالي، المتوسط يكون لزج ما يكفي تمييز المستعمرات الفردية.

8-إضافة للأجنة منفصلان إلى ميثيلسيلولوسي

  1. استخدام ماصة، إضافة 100 ميكروليتر من الأجنة 10 منفصلان لسطح ميثيلسيلولوسي المعدة مع المصل السيتوكينات وسمك الشبوط المؤتلف. غطاء كاب ودوامه بلطف مجانسة عينة تماما. ينبغي أن تتضمن كل أنبوبة الآن ينتابها أنسجة الأجنة 10.
  2. استخدام 3 مل المحاقن والإبر ز 16، الكوة 1 مل من العينة في أطباق بتري منفصلة 35 مم 2. تأكد من أن العينة هي موزعة تماما طبق بيتري. كرر لكل عينة.
  3. ضع أطباق بتري 35 ملم مع الخلايا في ميثيلسيلولوسي إلى 15 سم طبق بيتري. لكل طبق 15 سم، إضافة لوح بيتري 35 ملم واحد مع 5 مل الماء المعقم يرطب العينات. احتضان أول أكسيد الكربون 32 درجة مئوية و 5%2 لمدة 7-10 أيام.

9-تصور مستعمرة هسبك-مشتقة تشكيل وحدات (كفوس)

  1. بعد حضانة 7 أيام، وضع عينات إلى مجهر مقلوب في 40-100 X للتصور والتعداد. عند هذه النقطة، يمكن عزلة مع ماصة مستعمرات فردية وتخضع للتحليل تلطيخ و/أو الجينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم الأرقام هسبك في الزرد الجنينية، يهضم 48 هبف الأجنة، مطلي في ميثيلسيلولوسي مع عوامل النمو المكونة للدم داعمة خارجية، والمحتضنة لمدة 7 أيام (الشكل 1أ). بعد 7 أيام، كانت مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) المذكورة (الشكل 1ب) والمصورة (الشكل 1ج). عن طريق التحكم في السيتوكينات المختلفة وأضاف، واحدة يمكن التحكم في أنواع المستعمرات المنتجة: مكتب البراءات الأو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أصبح النظام النموذجي الزرد نموذجا كفؤة وفعالة وغير مكلفة لدراسة هيماتوبويسيس الفقاريات البدائية ونهائي. ويمكن استخدام جيل فحوصات سريعة وغير مكلفة، ويقدم بعض الصعوبات التقنية لاختبار الجزيئات الصغيرة وتحليل الأجنة متحولة، وتوضيح المسارات الجزيئية الهامة للبيولوجيا هسبك. في المختبر الطلاء من هسبكس من الزرد الكبار وسيلة فعالة لدراسة الطفرات، السيتوكينات، وعيوب المكونة للدم. هذا البروتوكول يستند إلى تلك الدراسات، ولكن يستخدم الزرد الجنينية. تطبيق هذه الاختبارات على الزرد الجنينية يسمح لجمع البيانات أسرع، واستخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من "معاهد الصحة الوطنية" (المعاهد الوطنية للصحة: K01-DK087814-01A1 إلى D.L.S.)، "برنامج جامعة كاليفورنيا الولاية" للتعليم والبحوث في مجال التكنولوجيا الأحيائية (كسوبيرب: "السيطرة الجزيئية" من "الفقاريات مكانة المكونة للدم" إلى D.L.S.) ومن مكتب الدراسات العليا في جامعة ولاية كاليفورنيا في تشيكو (إلى A.C.B.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ ألبومين مصل البقر في تقنيات الخلايا الجذعية MDM من Iscove.9300
DPBS (10x) مع الكالسيوم 2 + < / sup> والمغنيسيوم 2 + < / sup>Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 ملCorning CellGrow10-017-CV
  Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 ملGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 مل (1 م)تقنيات Gibco life15-630-080
البنسلين / الستربتومايسين (5000 وحدة / مل
و 5000 مجم / مل) مع L-Glutamine (200 مل) Corning		Mediatech30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 مل (50 مجم / مل)Corning Mediatech30-005-CR
1.5 مل أنبوب MCFFisherBrand05-408-129
3 مل 23gx1 إبرة حقن مع قفل لورBD Safety Glide305905
5 مل أنبوب سفلي دائري من البوليسترين مع غطاء مصفاة الخليةCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 مل أنبوب دائري من البوليسترينكورنينج فالكون352057
10 ملم بوليسترين إيزي جراب طبق بتريكورنينج فالكون351008
ليبريز TMروش سيجما ألدريتش5401119001تفكك البروتياز
بروناسروش سيجما ألدريتش11459643001ديكوريونايشن بروتياز
15 سم طبق بتريكورنينج فالكون351058
ABمركز الموارد الدولي لأسماك الزرد (ZIRC)تستخدم سلالة أسماك الزردZL1
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644(2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة