القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR

تم استكشاف ميكرورناس (ميرناس) كالمؤشرات الحيوية للتشخيص والتشخيص لأمراض السرطان، عدد متزايد من الدراسات أو الرصد والكشف عن الأمراض الأخرى في الدراسات السريرية و nonclinical^1،2،3 . الكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بكر (RT-qPCR) إحدى الطرق الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم ميرناس الهدف الفردي، لأن هذا الأسلوب أكثر حساسية من ميكرواري⁴ وتسلسل الحمض النووي الريبي القائمة على منصات⁵. بشكل عام، يتم قياس التعبير ميرنا مقارنة بعينه مرجعية باستخدام أسلوب ΔCq⁶. وهذا النهج مناسبة للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، محدودة الكمي النسبي لتعميم ميرناس الأداة المساعدة بسبب تلك الكميات الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختلاف التقني يجعل من الصعب مقارنة النتائج من الدراسات المختلفة، لأن تخصيص مختبرات مختلفة البروتوكولات التجريبية RT-قبكر بطريقة مختلفة، الأمر الذي يؤدي إلى غير متناسقة أو نتائج متناقضة حتى من ⁷من دراسات مختلفة.

وفي ضوء الشواغل المذكورة أعلاه، قد يكون القياس الكمي المطلق أكثر مناسبة لتقييم كميات صغيرة من ميرناس في سوائل الجسم. يستخدم الأسلوب الكمي المطلق منحنى المعياري المتولدة من تركيزات معروفة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية متطابقة في تسلسل إلى المقابلة ميرنا الهدف⁸. الصحة، ومعهد العلوم البيئية (هيسي) اللجنة التقنية المعنية بعلم الجينوم أجرت مؤخرا دراسات شاملة لمقارنة نتائج القياسات المطلقة للبلازما ميرناس، عبر مواقع اختبار متعددة. وأظهرت النتائج أن استخدام بروتوكول قياسي للمطلقة كوانتيتيشن من ميرناس إلى نتائج قابلة للمقارنة عبر مواقع اختبار متعددة⁹. RT-qPCR المقايسة الطريقة الموضحة في هذه الدراسة مطابق تقريبا لبروتوكول قياسي هيسي، الذي يتضمن تحليل متعدد لميرنا أهداف متعددة، والتضخيم السابقة للمساعدة في الكشف عن ميرناس التعبير منخفضة.

في هذه الدراسة، حجم ثابت (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من المنطلق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50) كانت تستخدم¹⁰. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لإعداد عينات البلازما، واستخراج ميرنا، و RT-قبكر، بما في ذلك ما قبل التضخيم. الأهم من ذلك، معلومات تقنية إضافية حول البروتوكول قد أدرج، حيث أنه يمكن أن يتم التحقق من صحة كمية ميرناس المستهدفة في العينات في تركيبة مع عملية المؤهلين تأهيلاً جيدا. أولاً، تم التحقق من صحة المنحنى المعياري لكل ميرنا لنطاق الكشف الفردية، قبل القياس الكمي في العينات البيولوجية. ثانيا، تم تقييم جودة المنهجية الحالية صورة شاملة عن طريق الاستبيان المفاهيمي قيم عنصر تحكم خارجي (cel-مير-238). ولذلك، هذا المنبر غلة أكثر من بيانات موثوق بها ومفيدة لمقارنة النتائج من دراسات مختلفة أو المختبرات.

لمحات ميرناس 8 قد أدرجت في هذا التقرير كنتائج تمثيلية من أسلوب الفحص الموضحة هنا. وقد اقترحت هذه ميرناس كما المحتملة سلامة المؤشرات الحيوية المرتبطة بإصابة الأنسجة إلى الكبد (مير-122 ومير-192)، القلب (مير-1 ومير-208a، مير-208b ومير-499a)، والهيكل العظمى والعضلات (133a مير ومير-206) في القوارض والبشر^{3، 11،،}من¹²¹³.

وقد أقر جميع التجارب برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة دايتشي سانكيو المحدودة

1. إعداد نموذج

1. جمع الدم (يقل عن 0.5 مل) من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس في الأنابيب التي تحتوي على 2 ك يدتا.
   ملاحظة: سترات والهيبارين غير مقبولة لأن تكبح هذه التخثر اللاحقة بكر^14،15.
2. وضع العينات التي تم جمعها فورا على الجليد وعملية لعزل البلازما خلال ساعتين جمع.
3. الطرد المركزي في عينات 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. نقل المادة طافية في microtube 2 مل، متبوعاً بالطرد المركزي في س 16,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام خلية والصفائح الدموية المتبقية.
   ملاحظة: القياس الكمي ميرناس يمكن أن تتأثر إلى حد كبير بالصفائح الدموية تلوث¹⁶.
5. ضع 200 ميليلتر مختبرين للمادة طافية في مل 2 جديدة-microtubes، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: يتم استخدام وحدة تخزين ثابتة لكل عينة لاستخراج الحمض النووي الريبي؛ ولذلك، يجب أن يكون حجم قاسمة الضبط.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

1. ذوبان الجليد عينات مجمدة في الجليد (من الخطوة 1، 5).
   1. تبقى عينة الباردة على الجليد أثناء استخراج الحمض النووي الريبي. البرد الكاشف تحلل وكلوروفورم على الجليد قبل الاستخدام.
2. إضافة 5 مجلدات (1000 ميليلتر) لكاشف تحلل، تتضمن حل أحادي الطور isothiocyanate الفينول وغوانيدين، للعينة (200 ميليلتر)، ومزيج بشدة من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة.
3. إضافة 5 ميليلتر 5 نانومتر الاصطناعية ميرنا ايليجانس كاينورهابديتيس (Syn-سل-مير-238-3 ع).
4. إضافة إلى حجم 1 (200 ميليلتر) كلوروفورم، ومزيج قوة من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة.
5. الحفاظ على الجليد لمدة 2 إلى 3 دقائق ومن ثم الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. نقل المرحلة المائية بعناية إلى microtube جديدة.
   ملاحظة: لا يتم تحويل أي من مرحلة العضوية (أحمر) أو الطور البيني (أبيض). ينبغي أن يكون حجم المرحلة المائية التي جمعت موحدة لتجنب التعامل مع التناقض، مما يؤدي إلى زيادة التباين التقني. وكان المبلغ المعتاد من المرحلة المائية المنقولة في هذا البروتوكول ميليلتر 650.
7. إضافة مجلدات 1.5 (975 ميليلتر) من الإيثانول، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
8. نقل العينة إلى العمود المطابق ومحول، متبوعاً بفراغ التجفيف لمدة 3 دقائق استخدام الفتحات فراغ. إذا كان حجم العينة أكثر من 700 ميليلتر، كرر هذه الخطوة لعملية الحل المتبقية.
   ملاحظة: عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود متوافق مع الأسلوب الفراغ والطرد المركزي.
9. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 1 دقيقة.
10. إضافة 800 ميليلتر روت المخزن المؤقت إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 2 دقيقة.
11. إضافة 800 ميليلتر RPE المخزن المؤقت إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 2 دقيقة.
12. كرر الخطوة 2.11.
13. إضافة 300 ميليلتر من الإيثانول إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 1 دقيقة.
14. مكان العمود على microtube جديدة، والطرد المركزي في 12,000 س ز في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
15. نقل العمود إلى microtube جديدة، وإضافة 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
16. الوقوف في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) 3 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في ز × 8,000 في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
17. إعادة تطبيق النذرة للعمود.
18. كرر الخطوة 2، 16، وتخزين النذرة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-كدنا التوليف

1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 2، 18).
2. إعداد تركيز معلوم من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية التي تتوافق مع الهدف ميرناس.
   1. استخدام الاصطناعية رنا اليغنوكليوتيد لتوليد منحنى قياسي في قبكر. حل الأسهم 1 × 10⁸ نسخة/ميليلتر تركيز مستعدة لأغراض التخزين.
   2. تمييع الحل الأسهم 10 إضعاف للحصول على 1 × 10⁷ نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 10⁵ نسخة/ميليلتر (عينات قبل تضخيم) العامل الحل كأعلى تركيز لإنشاء المنحنى المعياري. بشكل عام، هو مجموعة مقترحة لتركيزات المنحنى المعياري 1 × 10⁷ إلى 1 × 10² نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 10⁵ إلى 1 × 10⁰ نسخة/ميليلتر (عينات تضخيم مسبقاً).
3. إعداد تجمع التمهيدي RT تعدد الإرسال عن طريق خلط كميات متساوية من 20 x RT الإشعال للهدف ميرناس.
   ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2، يمكن إجراء مجموعة تحتوي على 4 تصل إلى الهدف ميرناس بخلط الإشعال RT 20 x لكل من ميرناس في حمام السباحة. يجب تضمين كواحدة من ميرناس المستهدفة في كل أنبوبة cel-مير-238 (عنصر تحكم خارجي). في حالة أقل من 4 ميرناس المستهدفة، إضافة كميات متساوية من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 1/10 بدلاً من 20 x RT التمهيدي.
4. إعداد مزيج رد فعل RT: 3 ميليلتر من التمهيدي RT تجمع (من الخطوة 3، 3)، 0.15 ميليلتر من دنتبس 100 ملم مع دتتب، 1 ميليلتر المنتسخة العكسية (50 ش/ميليلتر)، ميليلتر 1.5 10 × RT المخزن المؤقت، 0.19 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، وميليلتر 4.16 الحرة نوكلياسي المياه.
5. ميكس 10 ميليلتر من رد فعل RT مزيج مع 5 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي (من الخطوة 3.1) أو النوكليوتيد (من الخطوة 3، 2) من بيبيتينج، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
6. تشغيل النسخ العكسي على جهاز cycler حرارية: 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها خطوة نهائية عكس المنتسخة المنظمة في 85 درجة مئوية للحد الأدنى 5 عينات يدون عكس مخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4-بريامبليفيكيشن (اختياري)

ملاحظة: ميرناس التي تظهر القيم Cq فوق 35 أو أكثر في قبكر اللاحقة تضخيم مسبقاً.

1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 3، 6).
2. جعل الوقت تخفيف المسلسل المنتج RT من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية؛ 1 × 10⁵ إلى 1 × 10⁰ نسخة/ميليلتر لتوليد المنحنى المعياري.
3. إعداد المقايسة متعدد التمهيدي تجمع عن طريق خلط كميات متساوية (5 ميليلتر) 20 x المقايسة كبسولة تفجير ميرناس المستهدفة مع تركيز كل التحليل التمهيدي يجري المخفف 200-fold النهائي من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بحجم نهائي في 1,000 ميليلتر.
   ملاحظة: الإشعال الإنزيم ميرناس المستهدفة التي يمكن كشفها في قبكر اللاحقة دون التضخيم السابقة، وتلك الخاصة بالجوف-مير-238 (المراقبة الخارجية) غير مضمنة في تجمع التمهيدي.
4. إعداد مزيج التضخيم قبل الرد: 12.5 ميليلتر من 2 × كاشف بريامبليفيكيشن جاهزة للاستخدام، 3.75 ميليلتر من التحليل التمهيدي بركة (من الخطوة 4، 3)، وميليلتر 6.25 المياه خالية من نوكلاس.
5. ميليلتر 22.5 مزيج من التضخيم قبل رد فعل مزيج مع 2.5 ميكروليتر من عينة يدون عكس (من الخطوة 4، 1) أو النوكليوتيد (من الخطوة 4، 2) التي بيبيتينج، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
6. تشغيل رد فعل على جهاز cycler حرارية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ تليها دورات 12 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية للحد الأدنى 4 تخزين العينات قبل تضخيم في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5-الكمي PCR الوقت الحقيقي (قبكر)

1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 3، 6 أو الخطوة 4، 6).
2. تمييع العينات إضعاف مع الماء المعقم.
3. إعداد الوقت تخفيف المسلسل المنتج RT المستمدة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية؛ 1 × 10⁷ إلى 1 × 10² نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 10⁵ إلى 1 × 10⁰ نسخة/ميليلتر (عينات تضخيم مسبقاً) لتوليد المنحنيات القياسية.
4. إعداد qPCR رد فعل ميكس: 10 ميليلتر من 2 x كاشف التضخيم جاهزة للاستخدام، 1 ميليلتر من 20 x كاشف المقايسة، تحتوي على الأمام/عكس التمهيدي بكر ومسبار المقابلة لميرنا المستهدفة، و 7 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
5. نقل 18 ميليلتر من مزيج رد فعل qPCR للوحات الضوئية سريعة 96، حسنا فعل، وإضافة 2 ميليلتر من العينات مخففة (من الخطوة 5.2 أو خطوة 5.3) في الآبار.
   ملاحظة: نماذج ومعايير ل qPCR تقام في التكرارات.
6. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، والطرد المركزي بإيجاز.
7. تشغيل الرد على cycler حرارية في الوقت الحقيقي: 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 45 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 s.

6-بيانات التحليل

1. يتم حساب عدد نسخة أولية لكل عينة باستخدام برامج تحليل البيانات التي تعمل مع المقابلة cycler الحرارية في الوقت الحقيقي.
   ملاحظة: خط عتبة يتم تعيين يدوياً إلى "1.0" في كل الألواح في الدراسة، للتأكد من إمكانية تكرار نتائج المقارنة بهم vales Cq. يتم تعيين مستوى وقف إنتاج المواد الانشطارية في الاستبيان المفاهيمي > دورات 40.
2. حساب متوسط عدد نسخة أولية لكل عينة من التكرارات.
3. حساب معامل تصحيح بقسمة عدد نسخ من الجوف-مير-238 في كل عينة متوسط عدد النسخ من الجوف-مير-238 من جميع العينات في أنبوب مقابلة.
   ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2، كل أنبوبة تحتوي على ما يصل إلى 4 ميرناس المستهدفة بما في ذلك سل-مير-238 (عنصر تحكم خارجي). ولذلك، يتم احتساب عامل التصحيح لكل أنبوبة استخدام القيمة المطابقة في الجوف-مير-238.
4. حساب عدد النسخ المعدلة بقسمة عدد متوسط نسخة أولية لكل عينة (من الخطوة 6، 2) بواسطة عامل التصحيح (من 6.3 خطوة) لكل عينة.
5. حساب عدد النسخ المطلق بضرب عدد النسخ الخام المعدل لكل عينة (من 6.4 خطوة) بعامل إضعاف لكل عينة.
   ملاحظة: عامل إضعاف وهو "5" في هذا البروتوكول، الذي تم اشتقاقه من 5.2 خطوة.
6. حساب كفاءات التضخيم بكر من المنحدر المؤامرة من قيم كل تمييع المسلسل ضد سجل كدنا تركيز الاستبيان المفاهيمي.
   ملاحظة: صيغة لحساب الكفاءة؛ E = (10^{(-1/المنحدر)} -1) × 100%.
7. حساب التباين التقنية باستخدام قيم Cq الجوف-مير-238 من جميع العينات باستخدام الصيغة الإلكترونية = (كفاءة التضخيم x 2)^{ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))}.
   ملاحظة: يتم استخدام الخطوات 6.5 و 6.7 لتقييم الجودة للإجراء.

سير العمل للمقايسة ميرنا من الرايت قبكر والجودة أسيسمينر
ويبين الشكل 1 سير العمل للمقايسة ميرنا من عينات الدم باستخدام قبكر10. يمكن التحقق من جودة التجارب بالجوف-مير-238 كعنصر تحكم خارجي. هذا وسوف تكشف عن الاختلافات التقنية في استخراج الحمض النووي الريبي والعمليات اللاحقة RT-قبكر. في هذه الدراسة، كان ± يعني SD Cq القيم المحسوبة من 50 عينات 21.0 ± 0.4 (الجدول 1). إذا كان مخفف cel-مير-238 بسبب الخطوة ما قبل التضخيم، وكانت قيمة الاستبيان المفاهيمي 24.2 ± 0.4 (الجدول 1). في أسلوب الفحص الموضحة هنا، قدرت مدى التغير التقني يكون أقل من 3-fold على أساس الفرق في قيم الاستبيان المفاهيمي. درجة التباين بقي يتمشى حتى عندما كان التضخيم قبل خطوة إضافية لإدراجها. هذه القيم متوافقة مع تلك الخاصة بالعينات الأخرى من مختلف الأنواع الحيوانية، مثل الفئران والجرذان والبشر التي يؤديها في هذا المختبر (البيانات لا تظهر).

مجموعة قابلة للكشف من المنحنى المعياري لميرنا الهدف

أي تضخيم قبل العينات

وكان متسلسل المخفف المنتج (RT) يدون عكس من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية بتركيزات من 1 × 107 نسخة/ميليلتر قبل qPCR اللاحقة. واستخدمت هذه السلسلة لإنشاء المنحنى المعياري الذي يكفل تغطية متسقة لجميع العينات البيولوجية التي تم كشفها دون خطوة ما قبل التضخيم. القيم الاستبيان المفاهيمي للعينة القياسية في تركيز نسخة/ميليلتر2 1 × 10 كانت عموما قريبة من قطع مستويات لكل ميرنا المستهدفة. ولذلك، قدرت حد الكشف 1 × 102 نسخة/ميليلتر (الشكل 3).

عينات تضخيم مسبقاً

لتحديد نطاق يمكن كشفها للعينات التي تتطلب قبل التضخيم، مقارنة سلسلتين مختلفة من العينات مخففة، كما هو مبين في الشكل 4. لإنشاء المنحنى المعياري A، وأعدت تخفيف المسلسل للمنتج RT قبل الخطوة ما قبل التضخيم. ثم استخدمت سلسلة المعايير قبل تضخيم qPCR اللاحقة. لإنشاء المنحنى المعياري ب، قدم تمييع الأولى العينات قبل تضخيم بتركيز 1 × 105 نسخة/ميليلتر. وأظهرت هذه المنحنيات القياسية حدود الكشف على ما يبدو مختلفاً (الشكل 5). على الرغم من أن المنحنى المعياري ب أظهرت مجموعة خطية من زيادة وصولاً إلى 1 نسخة/ميليلتر، لا يمكن استخدام المنحنى المعياري A أمبليكونس الخاصة بتركيزات أقل من 102 أو 103 نسخة/ميليلتر (الشكل 5). واقترحت هذه النتيجة أنه لا يمكن تقييم كميات صغيرة للغاية من ميرناس حتى مع الخطوة ما قبل التضخيم. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات قبل تضخيم ينبغي أن تفسر بعناية عندما تكون قيم Cq > 30، لأن حدود الكشف عن العينات قبل تضخيم قريبة من هذه القيمة. ولذلك، كقاعدة عامة، استخدمت المنحنى المعياري ب في الأسلوب الموصوفة هنا، بعد تحديد نطاق يمكن كشفها، إلا من أجل تجنب استخدام عدد كاف من المؤامرات القياسية.

ونتيجة لذلك، كان الحد الأدنى للقياس الكمي (لوك) 102 نسخة/ميليلتر لأكثر من ميرناس (الشكل 3 و الشكل 5). فقط أظهرت مير-1 لوك أعلى (3 10 نسخة/ميليلتر) (الشكل 5). وكان التضخيم متوسط الكفاءة نحو 90 في المائة، مع أن معامل الارتباط (ص2) منحنيات قياسية تتراوح بين 0.998 1.000. السمات المميزة للمقايسة RT-qPCR دقيقة تعتبر خطية ص2 يساوي أو أكبر من 0.98 وكفاءة تضخيم بكر من 90 إلى 110%17. ولذلك، تم التحقق من نوعية المنحنيات القياسية في المقايسة.

آثار ما قبل التضخيم لكميات صغيرة من ميرناس

وكانت ميرناس التي أظهر الاستبيان المفاهيمي القيم أعلاه 35 أو أعلى في قبكر اللاحقة تضخيم مسبقاً. هذا الإجراء تعزيز الكشف عن كميات صغيرة من ميرناس. على سبيل المثال، قيم Cq (يعني ± SD) تضخيمه من قبل غير مير-206 كان ± 37.9 1.9، بينما قبل تضخيم مير-206 انخفض إلى 27.0 ± 2.2. اختلافات كبيرة بين أزواج القياس مكررة لوحظت في عينات تضخيمه من قبل غير بقيم Cq عالية (الشكل 6). وفي المقابل، أظهرت عينات قبل تضخيم قيم متساوية تقريبا في التكرارات (الشكل 6). هذه النتائج أشارت إلى أن التضخيم السابقة ستكون فعالة لتوفير المزيد من البيانات الدقيقة والموثوق بها في الحالات كميات صغيرة من عينات.

التنميط في ميرناس البلازما في القرود cynomolgus

استخدام منصة الفحص المتبعة، تحليل مستويات البلازما من ميرناس 8 (مير-1 ومير-122، مير-133a، مير-192، مير-206، مير-208a، مير-208b ومير-499a) من 50 cynomolgus كانت القرود (الشكل 7)10. في هذا التحليل، مير-122 و 133a مير مير-192 كانت قابلة للكشف دون ما قبل التضخيم، بينما مير-1، مير-206، ومير-499a المطلوبة قبل التضخيم بسبب مستويات منخفضة من التعبير. ومع ذلك، كان من الممكن اكتشاف حتى مع التضخيم قبل مير-208a ولا مير-208b. البيانات ليست موزعة بشكل طبيعي؛ ولذلك، أجرى تحولاً لوغاريتمي لحساب متوسط، والانحرافات المعيارية. بين ميرناس النظر، مير-122 أظهرت أعلى مستوى يعني البلازما (5.71 × 104 نسخة/ميليلتر)، مع مجموعة ديناميكية صغيرة (ضعفا). وفي المقابل، لوحظت نطاقات دينامية كبيرة مير-1 (581-fold)، مير-133a (971-fold)، ومير-206 (426-fold).

الشكل 1 : سير العمل التخطيطي للمقايسة ميرنا قبل RT-قبكر- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : سير العمل التخطيطي للنسخ العكسي للمقايسة ميرنا. يمكن أن تقدمها مجموعة تحتوي على 4 تصل إلى الهدف ميرناس خلط الإشعال RT 20 x لكل من ميرناس في حمام السباحة. يجب تضمين كواحدة من ميرناس المستهدفة في كل أنبوبة cel-مير-238 (عنصر تحكم خارجي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: تقييم نوعية استخدام القيم دورة (Cq) التحديد الكمي لسل-مير-238- وتم تقييم الاختلافات التقنية من قيم Cq مير-238 بكل مقايسة. عينات خمسين قسمت إلى مجموعتين المقابلة مع (حق) أو دون (يسار) التضخيم قبل الخطوة. تم حساب التباين باستخدام الصيغة الإلكترونية = (كفاءة التضخيم x 2)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). وتم حساب كفاءة التضخيم من منحدر المنحنى المعياري. كانت تضعف العينات التي تتطلب خطوة ما قبل التضخيم أثناء الخطوة ما قبل التضخيم (مير-238 نفسها لم يكن تضخيم مسبقاً). لقد تم تعديل هذا الرقم من لدينا تقرير10.

الشكل 3 : الأرض منحنيات القياسية لعينات تضخيمه من قبل غير. المنحنيات القياسية (N = 3، مكررة) تم إنشاؤها بواسطة التآمر تركيز سجل مقابل Cq. تم حساب تحليل الانحدار لتحديد المنحدر، الذي يتوافق مع كفاءة التضخيم الخطي. المنحنيات القياسية مير-122 (العلوي)، مير-192 (الأوسط)، ومير-133a (السفلي) أظهرت العلاقة الخطية بين الاستبيان المفاهيمي، والتركيز على مجموعة اختبار. تمثل أشرطة الخطأ في المنحنيات القياسية، انحراف معياري واحد من ثلاثة فحوصات مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : الإجراء لإنشاء المنحنيات القياسية للعينات قبل تضخيم. (المنحنى المعياري A) ممثل اليغو الاصطناعية (1 × 105 نسخة/ميليلتر) وكان تركيز عكس نسخها، متبوعاً بإعداد سلسلة المسلسل تمييع الوقت العينة القياسية. استخدمت هذه المعايير قبل تضخيم qPCR اللاحقة. (المنحنى المعياري ب) وكان تركيز ممثل اليغو الاصطناعية (1 × 105 نسخة/ميليلتر) عكس نسخها وتضخيمه قبل. بعد ذلك، تم إعداد سلسلة تمييع مسلسل إذ عينات قياسية من قبل qPCR اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : قطعة منحنيات القياسية A و B للعينات قبل تضخيم. المنحنى المعياري A (n = 1، مكررة) والمنحنى المعياري ب (n = 3، مكررة) تم إنشاؤها بواسطة التآمر تركيز سجل مقابل Cq. تم حساب تحليل الانحدار لتحديد المنحدر، الذي يتوافق مع كفاءة التضخيم الخطي. (العلوي) وأظهرت المنحنى المعياري (الخط المنقط) أمبليكون غير محدد على ما يبدو في 1 × 102 نسخة/ميليلتر، بينما المنحنى المعياري ب (خط متصل) أظهرت العلاقة الخطية بين الاستبيان المفاهيمي، والتركيز على مجموعة اختبار مير-1. (وسط و السفلي) أظهرت المنحنى المعياري (الخط المنقط) لا أمبليكون بتركيزات 1 × 102 نسخة/ميليلتر أو أقل، بينما المنحنى القياسي ب (خط متصل) أظهرت العلاقة الخطية بين الاستبيان المفاهيمي، والتركيز على مجموعة اختبار من مير-499a و مير-206. تمثل أشرطة الخطأ في المنحنى القياسي ب، انحراف معياري واحد من ثلاثة فحوصات مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : التضخيم مؤامرة لعينات تضخيمه من قبل غير وتضخيم مسبقاً. (العلوي) الأرض التضخيم من مير-206 في عينات تمثيلية (أ، ب، ج) دون (العلوي)، أو مع ما قبل التضخيم (السفلي). تم إعداد القياسات في مكررة. كانت هناك اختلافات بين العينتين إعداد كالتكرارات في عينات تضخيمه من قبل غير، لا سيما في أعلى من عينات الاستبيان المفاهيمي (A و B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : القيمة المطلقة للبلازما ميكرورناس (ميرناس) في القرود cynomolgus. وتمثل مستويات التعبير ميرناس المؤامرات دوت. الوسط، والقيمة لاثنين من انحرافات قياسية أدناه وفوق المتوسط (كما هو موضح في المربع الرمادي)، حددت بعد تحويل لوغاريتمي. لقد تم تعديل هذا الرقم من لدينا تقرير10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وقد صاحب البلاغ لا تضارب في الكشف عن.