وترد بروتوكولات مفصلة لإدخال إنزيم هندسيا سبليت-TET2 (عصير التفاح) في خلايا الثدييات هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي إيندوسيبلي الكيميائية وإعادة عرض جينية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مثلايشن الحمض النووي هو تعديل جينية الموروثة ومستقر في الجينوم الثدييات وهو يشارك في تنظيم التعبير الجيني للتحكم في الوظائف الخلوية. عكس مثلايشن الحمض النووي، أو ديميثيليشن الحمض النووي، هو توسط إزفاء (TET) أحد عشر-عشرة عائلة البروتين ديوكسيجيناسيس. على الرغم من أن قيل على نطاق واسع أن الشاذة مثلايشن الحمض النووي و demethylation المرتبطة بعيوب التنموية والسرطان، كيف هذه التغيرات جينية تسهم مباشرة في التعديلات اللاحقة في تطور التعبير أو المرض الجيني لا تزال غير واضحة، إلى حد كبير نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها لدقة إضافة أو إزالة التعديلات الدنا في الجينوم بدقة زمنية ومكانية محددة. للتغلب على هذه العقبة، صممنا إنزيم سبليت-TET2 لتمكين التحكم الزمني للأكسدة 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) ويعيد البناء اللاحقة للدول جينية في خلايا الثدييات ببساطة إضافة المواد الكيميائية. هنا، يمكننا وصف طرق لإدخال أداة يعيد epigenome كيميائية إيندوسيبلي (عصير التفاح)، استناداً إلى إنزيم هندسيا سبليت--TET2، في خلايا الثدييات، والتحديد الكمي لإنتاج المواد الكيميائية إيندوسيبلي 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) مع إيمونوستاينينج، والتدفق الخلوي أو مقايسة دوت-وصمة عار. سوف تجد هذه الأداة epigenome الكيميائية إيندوسيبلي يعيد استخدام واسع النطاق في استجواب النظم الخلوية دون تغيير الشفرة الجينية، وكذلك في استكشاف العلاقات epigenotype−phenotype في مختلف النظم البيولوجية.
المقدمة
مثلايشن الحمض النووي، معظمها يشير إلى إضافة مجموعة الميثيل بموقف السيتوزين الكربون 5 لتشكيل 5-ميثيلسيتوسيني (5mC)، وهو تحفزها الحمض النووي الميثيل-ترانسفيراسيس (دنمتس). 5mC بمثابة علامة جينية رئيسية في الجينوم الثدييات التي غالباً ما إشارات للقمع النسخي والمنظمة X-chromosome ينقول إسكات1. عكس مثلايشن الحمض النووي هو توسط الأسرة البروتين إزفاء (TET) 10-الجان. الإنزيمات التيت تنتمي للحديد (II) و 2-أوكسوجلوتاراتي ديوكسيجيناسيس تعتمد الذي حفز الأكسدة المتعاقبة من 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيسيتوسيني (5caC). ويفرض أكسدة 5mC تيت بوساطة طبقة إضافية من سيطرة جينية على الجينوم الثدييات. وقد آثار اكتشاف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الخلية الثقافة، تعداء بلازميد والحث الكيميائي
- ثقافة خلية ملتصقة خط (مثلاً، البشرية الجنينية الكلي خلية HEK293T) في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم)، تستكمل مع إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري، 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
- ترانسفيكت الخلايا مع بلازميد عصير التفاح.
- على الأقل 18 ح قبل تعداء، البذور 0.3 × 106 خلايا في 2.5 مل دميم المناسبة الواحدة في لوحة 6-جيدا واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها يصل إلى 60-80% كونفلوينسي.
- قبل حارة الكاشف تعداء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
- مكان 250 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن التحقق من صحة التحويل 5mC إلى 5hmC إيندوسيبلي الكيميائية التي إيمونوستاينينج على مستوى خلية واحدة، والتدفق الخلوي التحليل على السكان ترانسفيكتيد (متشيري-إيجابي) الخلية أو كمية أكثر مقايسة دوت-وصمة عار كما هو مبين في الشكل 1. المجال الحفاز من TET2، أو TET2CD، استخدمت طوال فترة الدراسة كعنصر إيجابي. راجع مراجع 18-20 لمزيد من التفاصيل فيما يتعلق برسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للتغيرات المستحثة ربمسن في الوصول إلى 5hmC والكروماتين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا أننا قد يتضح استخدام إنزيم TET2 انقسام هندسيا لتحقيق التحكم الزمني للحمض النووي هيدروكسيميثيليشن. عقب اكتشاف عائلة تيت ديوكسيجيناسي 5-ميثيسيتوسيني، تم إجراء العديد من الدراسات فك الوظائف البيولوجية تيت البروتينات وعلى المنتج الحافز الرئيسي 5hmC1،2،3، 4،5،،من67،،من<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
ونحن نشكر المالية منح يدعم من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01GM112003 إلى YZ)، مؤسسة ولش (BE-1913 إلى YZ) وجمعية السرطان الأمريكية (TBE RSG-16-215-01 إلى YZ)، والوقاية من السرطان ومعهد تكساس للبحث (RR140053 إلى YH، RP170660 إلى YZ)، جمعية القلب الأمريكية (16IRG27250155 إلى أي إتش)، والبرنامج جائزة جون س. دن مؤسسة البحوث التعاونية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ليبوفيكتامين 2000 كاشف الإرسال | الحراري فيشر العلمي | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde ، 16٪ Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| حمض الهيدروكلوريك | Amresco | 0369-500ML | |
| الألبومين ، بوفين | أمريسكو | 0332-100G | |
| توين 20 | أمريسكو | 0777-1 لتر | |
| 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5-hmC) الجسم المضاد (pAb) النشط | 39769 | ||
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4،6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| فرن فراغ اقتصادي SVAC1E SHEL LAB ، 0.6 قدم مكعب (17 لتر) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC ، جهاز النقاط الحيوية 15557036 الحيوي 20X | Thermo Fisher Scientific | ||
| BIO-RAD | 1706545 | ||
| الأجسام المضادة المضادة ل 5-methylcytosine (5mC) ، استنساخ 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| IgG المضاد للفأر ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP | 7076S | ||
| المضادة للأرانب IgG ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة | ب HRP 7074S | ||
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
المراجع
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
