يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

17K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56863

⸱

ديسمبر 22, 2017

1Department of Dermatology, Aarhus University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

جلد الإنسان يعمل كخط أول للدفاع ضد البيئة الخارجية. نحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. هذه الخلايا الكيراتينيه معزولة هي مفيدة في الأجهزة التجريبية العديدة، وهي نموذج مناسب جداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

الملخص

والوظيفة الرئيسية للخلايا الكيراتينيه توفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي الحفاظ على حاجز ميكانيكية على العالم الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً أساسيا في البدء، والصيانة، وتنظيم الاستجابات المناعية البشرة بكونها جزءا من نظام المناعة الفطرية الاستجابة للمحفزات مستضدي بطريقة سريعة وغير محدد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، وتبين أن هذه الخلايا تستجيب للتمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم، الذي يقاس بتعبير زيادة من إينفولوكرين علامة تمييز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تبين أن الخلايا الكيراتينيه معزولة تستجيب لتفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها 1β إيل مقاسا بتنشيط p38 MAPK المسار. أخذت معا، يصف لنا طريقة للعزل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. لأن الخلايا الكيراتينيه نوع الخلية الغالبة في البشرة، يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

المقدمة

الجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان، ويعمل كحاجز وقائي ضد البيئة الخارجية. ويتألف الجلد من طبقتين الرئيسية: الأدمة والبشرة، حيث يشكل البشرة الطبقة الخارجية من الجلد. نوع الخلية الأكثر وفرة في البشرة من الخلايا الكيراتينيه تتألف من أكثر من 95% من الخلية الجماعية1،2. يتم الاحتفاظ بمراحل مختلفة من التمايز في البشرة الخلايا الكيراتينيه ويتم تنظيمها في الطبقات القاعدية والشائكة والحبيبية، وكورنيفيد التي تتوافق مع مراحل محددة من التمايز3. الوظيفة الأساسية للخلايا الكيراتينيه لتوفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي إنتاج حاجز سليمة للعالم الخارجي.

الخلايا الكيراتينيه أيضا تمثل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة في الجلد، وذلك دوراً هاما في الاستجابة المناعية الفطرية4،5. تعرض الخلايا الكيراتينيه للمنبهات الخارجية يؤدي إلى تفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا، وفي وقت لاحق، إنتاج عدد من الوسطاء التهابات مختلفة بما في ذلك السيتوكينات والمستقطبات الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه البروتينات المشتقة من keratinocyte المشاركة في الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية، العَدلات، وخلايا T محددة6،7. وهكذا، لأن الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً حاسما في العديد من العمليات البيولوجية، كان الأساس المنطقي لهذه التقنية المقدمة هنا لإنشاء نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا الجلد. كثيرا ما تستخدم الثقافات keratinocyte الأولية التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة القلفة لدراسة البيولوجيا الجلد8،9. ومع ذلك، مع الأسلوب الموصوفة هنا، الكيراتينيه من كلا الجنسين يتم الحصول عليها أدى تنوع البيولوجي أعلى من الخلايا.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لعزله وجيل من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، بما في ذلك الصيانة وتجميد الخلايا الكيراتينيه. والهدف العام لهذا الأسلوب هو توليد الكيراتينيه البشرية الأساسية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدي في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جمع عينات الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل يتطلب موافقة من اللجنة الأخلاقية في المؤسسات المضيفة. وأقر هذا البروتوكول الإقليمية الأخلاقية اللجنة من منطقة Midtjylland، الدانمرك (M-20110027). الأسلوب الموصوفة هنا هي المستمدة من دراسات مماثلة من ماسياق et al. ليو وكاراسيك11و 10 .

1-عزل الخلايا الكيراتينيه من جلد الإنسان

  1. ابدأ بتقديم الحلول التالية: حل 50 مل من 0.25% جلوكوز التربسين و 0.1 في المائة في دببس. ميكس وتصفية تعقيم (0.2 ميكرومتر) الحل. إعداد 10 مل ربمي-1640 + 2% FBS الحل، 50 مل من دببس و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كسفم). إضافة ملاحق كسفم و 250 ميليلتر مع الجنتامايسين إلى 500 مل كسفم. قبل الحارة الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. جمع الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل. عينات الجلد المستخدمة هي حوالي 10 سم × 15 سم، ولكن يمكن أن تختلف في الحجم. الحفاظ على الجلد باردة تحت بند النقل بنقل عينات الجلد في مربع الستايروفوم التي تحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينة الجلد عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. إزالة الدهون من أسفل المقطع الجلد باستخدام مقص معقم والمشارط، وملقط.
  4. مشبك بالمقطع الجلد (حوالي 10 × 15 سم) على غلاف عقيمة على رأس لوحة باستخدام الإبر. أولاً، قم بتنظيف الجلد بوسادة شاش معقم جاف. ثم قم بتنظيف الجلد باستخدام وسادة شاش معقم مع الإيثانول 70%.
  5. استخدام استواء سيرا على أقدام، قطع من الطبقة العليا (البشرة) قسم الجلد ووضعها في سم 9 طبق بيتري. ثم فورا إضافة 25 مل الحل دببس/التربسين/الجلوكوز (إعداد في الخطوة 1، 1) إلى طبق بيتري. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. استخدام ماصة إزالة الحل دببس/التربسين/الجلوكوز من طبق بيتري وإضافة 10 مل من RPMI 1640 + 2% FBS لإلغاء تنشيط التربسين.
  7. استخدام الملقط اثنين، الآن إطلاق خلايا البشرة في المتوسط بلطف كشط والتحريض البشرة والمقصورة الجلد من أقسام الجلد.
  8. تصفية تعليق خلية البشرة من خلال عامل تصفية معادن (حجم فجوة 1 ملم)، وجمع في أنبوب 50 مل. إضافة المقاطع الجلد المتبقية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل 1640 RPMI دون FBS ودوامه لتصفية س. 10 التعليق من خلال المعدن تصفية في أنبوب 50 مل الذي يحتوي على تعليق خلية البشرة. إضافة دببس إلى إجمالي حجم 50 مل.
  9. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
  10. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية البشرة في حوالي 10 مل من 37 درجة مئوية كسفم تبعاً لحجم الخلية بيليه. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ الأسلوب تحت المجهر. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من قسم جلد 10 × 15 سم من حوالي 50-100 × 106 خلايا. لكل قارورة الثقافة2 75 سم، نقل 8 × 106 خلايا جنبا إلى جنب مع 12 مل 37 درجة مئوية كسفم. بلطف يهز قوارير الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا.
  11. احتضان الخلايا الكيراتينيه في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO2. تغيير في المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا. مرور الخلايا عند الثقافة روافد 70-80 ٪، التي تستغرق حوالي 2 أسابيع تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه.

2-باساجينج من الخلايا الكيراتينيه

  1. الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 4.5 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% قارورة ثقافة2 75 سم.
  2. إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة 4.5 مل/75 سم2 الثقافة قارورة استعد قبل حل يدتا التربسين 0.05% للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
  3. عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد لتخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 6 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 75 سم ثم نقل تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
  4. شطف قوارير الثقافة مع 3 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي خلايا لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
    1. ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 10 مل كسفم (37 درجة مئوية). عد الخلايا ونقل 3 × 106 خلايا 150 سم2 ثقافة قارورة جنبا إلى جنب مع 20 مل كسفم (37 درجة مئوية). بلطف يهز قارورة الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا. تجميد الخلايا عند الثقافة روافد 80-90 ٪، الذي يستغرق حوالي 4-6 أيام تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه (انظر القسم 3، تجميد البروتوكول أدناه). توسيع نطاق الخلايا الكيراتينيه لتوليد الأرصدة المجمدة المناسبة.

3-تجميد الخلايا الكيراتينيه

  1. الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 9 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% 150 سم2 ثقافة قارورة.
  2. إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة2 مل 9/150 سم الثقافة قارورة استعد قبل 0.05% يدتا التربسين حل للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
  3. عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد من أجل تخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 12 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 150 سم ثم نضح تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
  4. شطف قوارير الثقافة مع 6 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 450 غ س في 4 درجات مئوية. تعد الخلية المثلج تجميد المتوسطة (كسفم + 10% [دمس]).
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في كسفم + 10% [دمس]، عد الخلايا، وتجميد الخلايا في كثافة 6 × 106 خلايا/مل باستخدام أساليب تجميد تجميد بطيء القياسية12.
  6. تخزين الخلايا الكيراتينيه في النتروجين السائل (مرحلة البخار) حتى جاهزة للاستخدام.

4-ذوبان الجليد واستزراع الخلايا الكيراتينيه المجمدة

  1. سرعة ذوبان الجليد القنينات المجمدة المناسبة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدام الإيثانول 70% لتنظيف الجزء الخارجي من كريوفيال. نقل العدد المناسب من الخلايا (خلايا/سم تقريبا 15,0002) قارورة ثقافة وفورا إضافة النمو قبل حرارة متوسطة (كسفم) إلى قارورة الثقافة.
    ويمكن استخدام أي حجم من قوارير الثقافة تبعاً للإعداد للتجربة.
  2. استخدام 5 مل الثقافة المتوسطة قارورة ثقافة 25 سم2 .
وأضاف العدد الخلايا قارورة الثقافة قد تختلف نظراً لنمو الخلايا تختلف من مانح إلى. احتضان خلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO2.
  • تغير المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا استخدام الطازجة كسفم المعالجون مسبقاً.
    ملاحظة: البيانات المتوفرة لدينا قد أثبتت أن 95% الخلايا المعزولة ببروتوكول الموصوفة هنا إيجابية بالنسبة لل 14 سيتوكيراتيني keratinocyte ماركر13في المتوسط.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    تمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم
    الكيراتينيه البشرية تخضع للتمايز المحطة الطرفية عند المعاملة بالكالسيوم14،،من1516. الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة ومثقف كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. عندما حفز الخلايا مع الكالسيوم (1.2 مم) حوالي 50-60% روافد، أو أخذت السيارة وصور للخلايا في اليوم 0 و 1 و 2. ويبين الشكل 1 التغيرات المورفولوجية للخلايا الكيراتينيه ولاحظ عند تنشي...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    هنا، نحن تصف كيفية عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار بسهولة، وكيف أن الثقافة لهم في المختبر. هذا النموذج يمكن أن يكون أحد تطبيقات واسعة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا البشرة، ويمكن أن يكون مفيداً للباحثين المهتمين بدراسة الأمراض الجلدية.

    بعض المزايا للبروتوكول هو موضح هنا على النقيض من الخلايا الكيراتينيه معزولة عن الولدان القلفة التي تم الحصول عليها من الذكور حديثي الولادة تمر بالختان، الكيراتينيه البشرية الأولية من المرضى البالغين معزولة من الرجال والنساء على حد ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    . وقد صاحب البلاغ لا تضارب في المصالح.

    شكر وتقدير

    المؤلف يود أن يشكر أنيت بلاك راسموسن ومولر كريستين على دعمها التقني

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    KSFMThermoFisher Scientific17005-034مكملات زراعة الخلايا المتوسطة
    KSFM مكملاتThermoFisher Scientific37000-015ل KSFM
    DPBSThermoFisher Scientific14190-144DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
    DMSOسيجما ألدريتشD8418ثنائي ميثيل سلفوكسيد
    جنتاميسينThermoFisher Scientific15710-049ثقافة الخلية مرشح التعقيم المضاف المتوسط
    Sartorius16534مرشح حقنة بحجم مسام 0.2 وميكرو ؛ م
    التربسينسيجما-ألدريتشT7409يستخدم لتربسين الخلايا
    الجلوكوزسيجما ألدريتشG7528-RPMI-1640
    ThermoFisher Scientific61870-010-FBS
    ThermoFisher Scientific16000044يستخدم لتعطيل ملقط التربسين
    -استخدام
    مقص-يمكن استخدام مقص من أي شركة
    يمكن استخدام مشرطسوان مورتون0501من أي شركة
    70٪ إيثانول---
    يمكن استخدام وسادات الشاشNOBAMED875420وسادات الشاش من أي مزود
    يمكن استخدام
    يمكن استخدام أطباق بتريTPP93100أطباق بتري من أي مزود
    فلتر معدني-فلتر معدني بحجم 1 مم بحجم
    ثقب 75 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافةNUNC156499-150
    سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافةTTP90151-0.05
    ٪ محلول تريبسين EDTAThermoFisher Scientific25300-062يستخدم لتربسين الخلايا عند المرور
    يمكن الملقط من أي شركة مسوي القدم Credo Solingen 1510 Foot مسوي من أي مزود

    المراجع

    1. Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
    2. Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
    3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
    4. Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
    5. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
    6. Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
    7. Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
    8. Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
    9. Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
    10. Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
    11. Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
    12. Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
    13. Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
    14. Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
    15. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
    16. Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
    17. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
    18. Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
    19. van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
    20. Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    عزل الخلايا الكيراتينيةزراعة الخلايا البشرويةالتمايز المستحث بالكالسيومتحفيز إنترلوكين-1 بيتاتنشيط p38 MAPKالهضم بالتريبسينوسط KSFMتجميد الخلايانموذج البيولوجيا الجلدية
    جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.