ويصف هذا البروتوكول تلفيق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية تمتز مع المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة التي يمكن استخدامها لرصد الانصهار بلعم من العينات الحية وتمكن مجهرية فائقة القرار العينات الثابتة .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اختﻻق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية لدراسة الانصهار بلعم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تم تحدي تصور تشكيل الخلايا العملاقة مولتينوكليتيد (مجكس) من العينات الحية يرجع ذلك إلى حقيقة أن يعيش أكثر من تقنيات التصوير تتطلب نشر الضوء من خلال الزجاج، ولكن على الزجاج بلعم فيوجن حدث نادر. ويقدم هذا البروتوكول تلفيق العديد من الواجهات الزجاجية الجودة البصرية حيث يتحول امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة الزجاج في سطح فوسوجينيك. أولاً، يتم وصف إعداد الأسطح الزجاجية النظيفة كابتداء من المواد لتعديل السطح. ثانيا، ينص طريقة امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة لتحويل الزجاج غير فوسوجينيك إلى الركازة فوسوجينيك. وثالثاً، يصف هذا البروتوكول تلفيق ميكروباتيرنس السطحية التي تشجع على درجة عالية من الرقابة الزمانية المكانية على تشكيل MGC. وأخيراً، يرد اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج. وترد أمثلة لاستخدام هذا النظام الخلايا في المختبر كنموذج لدراسة الانصهار بلعم وتشكيل MGC.
المقدمة
ويرافق تشكيل مجكس عددا من الحالات المرضية في جسم الإنسان المتميز بالتهاب مزمن1. وقد أظهرت الدراسات القليلة من المستغرب على الرغم من الاتفاق الذي مونونوكليتيد الضامة الصمامات على شكل مجكس2، الانصهار في سياق مع المعيشة العينات3،4. هذا سبب الأسطح الزجاجية النظيفة المطلوبة لمعظم تقنيات التصوير لا تعزز الانصهار بلعم عندما فعل السيتوكينات الالتهابية5. في الواقع، إذا كان الزجاج نظيفة كركيزة للانصهار بلعم، ثم منخفضة للأهداف المتوسطة التكبير (أي، 10-20 X) وأكثر من 15 ح المستمر غالباً ما مطلوبة تصوير الاحتفال بحدث واحد انصهار.
في اليد، والأسطح البلاستيكية فوسوجينيك (مثلاً، بيرمان) أو البلاستيك الصف البكتريولوجية الأخرى تعزيز الانصهار2. بيد أن التصوير من خلال البلاستيك يثير إشكالية لأن الركيزة سميكة وينثر الضوء. وهذا يزيد من تعقيد التصوير منذ فترة طويلة عامل المسافة (LWD) أهداف مطلوبة. ومع ذلك، عادة ما يكون أهداف LWD الإضاءة الخافتة جمع القدرات مقارنة بنظيرتها ساترة لتصحيح. علاوة على ذلك، تقنيات استغلال التغييرات في القطبية للضوء الذي يمر من خلال العينة مثل التدخل التفاضلية على النقيض من المستحيل نظراً للبلاستيك بيريفرينجينت. العوائق المرتبطة باستخدام البلاستيك هي أكدت حقيقة أن من المستحيل التنبؤ بحيث يحدث تشكيل الانصهار/MGC بلعم على السطح. معا، هذه القيود تحد من تصور الانصهار بلعم إلى مرحلة التباين البصريات، تمديد المدد التصوير الكلي (> 15 ساعة متواصلة)، ودقة منخفضة.
وقد حددنا مؤخرا سطح زجاج فوسوجينيك العالية أثناء إجراء الفحص المجهري جزيء واحد سوبر القرار مع الضامة الثابتة/مجكس4. هذه الملاحظة كان مفاجئاً نظراً لتنظيف زجاج الأسطح تعزيز الانصهار بمعدل منخفض جداً ~ 5% بعد 24 ساعة حضور انترلوكين-4 (إيل-4) كما تحددها الانصهار مؤشر4. لقد وجدنا أن القدرة على تعزيز الانصهار كان بسبب التلوث أوليميدي. أدلى الامتزاز أوليميدي أو مركبات أخرى وبالمثل الوارد الهيدروكربونات سلسلة طويلة فوسوجينيك الزجاج. فوسوجينيك معظم مجمع (شمع البارافين) ميكروباتيرنيد، وهو إضفاء درجة عالية من السيطرة الزمانية المكانية على الانصهار بلعم وإلى زيادة إضعاف في عدد الأحداث الانصهار لاحظ داخل نفس المقدار من الوقت مقارنة مع بيرمان. وقدمت هذه السطوح البصرية الجودة أول لمحة في الخصائص المورفولوجية والحركية التي تحكم تشكيل مجكس في العينات الحية.
في هذا البروتوكول وصف نحن تصنيع مجموعة متنوعة من الواجهات الزجاجية التي يمكن استخدامها لرصد تشكيل مجكس من العينات الحية. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن هذه الأسطح قابلة لتقنيات حل فائقة بعيدة الميدانية. تلفيق السطحية يعتمد على هدف التجربة، وهو وصف كل سطح مع الأمثلة ذات الصلة في نص الدعوى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافق الإجراءات التي تستخدم الحيوانات بالعناية بالحيوان واستخدام اللجان في عيادة مايو كلينيك ومجمع البحوث جانيليا، وجامعة ولاية أريزونا.
1. إعداد تغطية حمض تنظيف الزجاج
ملاحظة: قد لا تكون تغطية الزجاج التي تم شراؤها من العديد من الشركات المصنعة نظيفة كما هو متوقع. النظر بشكل روتيني التنظيف دفعات زجاج غطاء قبل أي إجراء وتشارك فيها الفحص المجهري.
- شراء الزجاج غطاء صرامة عالية. عناية خاصة لاختيار سمك الصحيح (0.15 أو 0.17 ملم).
ملاحظة: اختيار سمك الغطاء الزجاج اعتماداً على الهدف المجهر ويتم سرد مباشرة على برميل موضوعية. - احتضان الزجاج غطاء في حمض الهيدروكلوريك 12 مترا في غطاء الأبخرة كيميائية جيدة التهوية ح 1 مع سونيكاتيون (42 كيلو هرتز، 70 ث). كرر هذه الخطوة لمرتين إضافية مع طازجة 12 M HCl.
- ملء كوب منفصلة مع الماء عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
- احتضان الزجاج غطاء في الأسيتون النقي في غطاء كيميائية جيدة التهوية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة لأوقات إضافية اثنين.
- ملء كوب منفصلة مع الماء المعقم عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
- احتضان الزجاج غطاء في الكحول الاثيلي 100% في غطاء كيميائية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة مرتين إضافية.
ملاحظة: من المهم نقاء الكحول الاثيلي. الملوثات في شكل المواد الصلبة الذائبة سوف يجف على الزجاج، ويمكن تعزيز الانصهار بلعم. - للتخزين على المدى الطويل، مكان الزجاج غطاء تنظيف حمض في حاوية مليئة بالكحول الاثيلي النقي. وبدلاً من ذلك، جاف الزجاج غطاء مع غاز النيتروجين ومخزن في مجفف فراغ.
2-إعداد السطوح البصرية فوسوجينيك الجودة
- حل خالية من [دمس] شمع البارافين نقطة انصهار عالية في التولوين عالي النقاوة.
ملاحظة: تركيزات الأسهم مصنوعة في 10 ملغ/مل، والمخفف 1:9 في التولوين عالي النقاوة جعل 1 ملغ/مل حل عملي.
تنبيه: تولوين ينبغي التعامل معها بعناية تناسليا. التخلص من التولوين وفقا لخطة النظافة الكيميائية المؤسسية. - تطبيق البرافين يعمل حل لجفاف تنظيف حمض تغطية زجاج في وحدة تخزين التي تغطي بشكل متساو على سطح الزجاج. صب حل الزائدة والزجاج غطاء مع غاز النيتروجين أو الهواء الجاف. لإعداد الجزء الأكبر، استخدام جرة كوبلين مصممة لاستيعاب زجاج الغطاء.
- تلميع الزجاج غطاء 3 جلدات في المحور س، وبعد 3 جلدات في المحور y مع مسح خالية من الوبر (انظر الجدول للمواد).
- فورا قبل إجراء التجربة، يغسل زجاج الغطاء بالماء عالي النقاوة العقيمة، ولاحقا تعقيم لمدة 15-30 دقيقة مع الأشعة فوق البنفسجية في غطاء سلامة بيولوجية. وبدلاً من ذلك، تعقيم الزجاج غطاء تشعيع جاما أو أكسيد الإثيلين.
3-ميكروباتيرنينج الهيدروكربونية المحتوية على مركبات قصر الانصهار لمناطق محددة سلفا
- الجاف لتنظيف حمض تغطية الزجاج وشل الزجاج على سطح مستو.
- استخدام الملقط، تزج بعناية شبكة نقل الذهب مكتشف مجهر الإلكتروني في إيجاد حل عملي ل compound(s) الهيدروكربونية. اختر مركب هيدروكربون يفي بالهدف النهائي لهذه التجربة (انظر الجدول 1). فتيلة الحل الزائدة بعيداً بلطف التنصت على الشبكة على ورق الترشيح، وفورا بوضع الشبكة في مركز الزجاج غطاء. تسمح التولوين لتجف لمدة 2 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- تأكد من الشبكة هو الرهينة للزجاج بعكس الزجاج بلطف. إذا كانت الشبكة يفصل كرر الخطوة 3.2 استخدام زجاج غطاء جديد.
ملاحظة: إذا لم يتوفر بلازما أنظف، حذف الخطوة 3.4. - بلازما تنظيف زجاج الغطاء بالعلاج بالبلازما الغاز فراغ.
ملاحظة: الشبكة الباحث يعمل كقناع لحماية السطح الأساسي تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة من البلازما. يتم تقديمها في المناطق التي لا تحميها الشبكة غير فوسوجينيك بالتعرض للبلازما. وينبغي تحديد مقدار الوقت الزجاج غطاء فضح للبلازما تجريبيا. - استخدام الملقط نصيحة الجميلة، بعناية إزالة الشبكة من سطح الزجاج لفضح ميكروباتيرن.
4-اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج
- حفر حفرة دائرية 6-10 مم في الجزء السفلي من البلاستيك 35 ملم طبق بيتري استخدام مثقاب خطوة.
ملاحظة: من الضروري استخدام مثقاب خطوة لإنشاء حواف ناعمة. إذا كانت حواف خشنة للغاية، وسوف لا السندات الزجاج غطاء شقة إلى الجزء السفلي من الطبق. الأسطح المسطحة ناقص من صعوبة الفحص المجهري. - المزيج بعناية وديغا سيليكون الاستومر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (أي، بولي دايمثيل سيلوكسان؛ PDMS).
- تطبيق طلاء رقيقة من الاستومر فقط قريب من الحافة (أي، وقصر) الحفرة.
ملاحظة: يجب أن تظهر الاستومر فرقة مستمرة رغم رقيقة المحيطة بالحفرة. - بلطف تطبيق الزجاج غطاء فوسوجينيك (كما هو موضح في القسم 2)، أو الزجاج الجافة غطاء تنظيف حمض (كما هو موضح في القسم 1) على الطبق من أجل تغطية الحفرة محاطة الاستومر. ضمان أن الزجاج غطاء يظهر تدفق مع الجزء السفلي من الطبق ويمتد خارج قطر الحفرة حيث يكون جزء كبير من الزجاج على اتصال بالبلاستيك. علاج الاستومر واسطة الخبز عند 50 درجة مئوية ح 2-3.
- إذا كان الزجاج فوسوجينيك المفضل، الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الخلايا طبق والثقافة وفقا للبروتوكولات القياسية. ومع ذلك، إذا كان ميكروباتيرن المفضل، انتقل إلى الخطوة 3.2 لإعداد ميكروباتيرن (البلازما الغاز المستخدمة أثناء ميكروباتيرنينج يعقم الطبق والأزواج PDMS بشدة للزجاج).
5-جمع الضامة أثارت ثيوجليكولاتي
- حقن الفئران C57BL/6 8 عاماً في الأسبوع مع 0.5 مل محلول معقم من ثيوجليكولاتي 4% بروير كما هو موضح سابقا3،،من46.
- الاثنتين والسبعين ساعة في وقت لاحق، euthanize الحيوان طبقاً للرعاية الحيوانية المعتمدة واستخدام المبادئ التوجيهية، وجمع الضامة البريتوني الغسل مع المالحة المثلج مخزنة الفوسفات وتستكمل مع اتهيلينيديامينيتيتراسيتاتي 5 مم.
- الطرد المركزي الضامة في 300 غرام x لمدة 3 دقائق وريسوسبيند في 1 مل DMEM:F12 وتستكمل مع 15 ملم حبيس، 10% FBS، و 1% المضادات الحيوية (مستنبت).
ملاحظة: يتم عد الخلايا لاحقاً مع هيموسيتوميتير نويباور. الضامة المخفف بتركيز مناسب وتطبيقها على السطوح. عدد الخلايا لتطبيقه على سطح معين ينبغي ستنظر بعناية المحقق غرض مسألة تجريبية. التشاور مع المعايير المعروفة في الأدب الأساسي. - بعد 30 دقيقة تغسل السطوح بحبس وتستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1% إزالة الخلايا غير ملتصقة، واستبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة. العودة الثقافات للحاضنة (5% CO2 في الهواء عند 37 درجة مئوية).
- نضح المتوسطة 2 ح في وقت لاحق، واستبدل بالثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10 نانوغرام/مل إيل-4. صورة الخلايا كما هو موضح في مكان آخر من4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البارامترات الفيزيائية للمواد آثاراً مأساوية على مدى بلعم فيوجن7،،من89،10. وعلاوة على ذلك، من المعروف الملوثات السطحية لتعزيز الانصهار بلعم11. ولذلك، من المهم نظيفة للبدء بتغطية الزجاج كعنصر تحكم سلبية للانصهار بلعم. عند تنظيفها كما هو موضح في البروتوكول 1، الزجاج غطاء استثنائي شقة مع أي ميزات سطحية واضحة، بينما امتزاز المواد الهيدروكربون...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الحاجة إلى تحديد ووضع بعد ذلك الأسطح الزجاجية الجودة البصرية التي تعزز الانصهار بلعم تنبع من حقيقة أن تصور بلعم الانصهار في الإطار العيش حتى لا نشرت مؤخرا دراسة مباشرة العينات3، 4. وهذا يرجع إلى أن فوسوجينيك الأسطح البلاستيكية التي تستخدم عادة تتطلب أهداف LWD وتقتصر إلى حد كبير على مرحلة التباين البصريات. تم التغلب على هذه الحواجز بالهندسة سطح زجاج الجودة البصرية التي شجعت معدلات استثنائية من الانصهار بلعم، بل وإضفاء درجة الدهشة من السيطرة المكانية على تشكيل مجك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
نود أن نشكر أعضاء المختبر أوجاروفا والمحققين في المركز الأيض وبيولوجيا الأوعية الدموية لمناقشة مفيدة لهذا العمل. جيمس فاوست يود أن يعرب عن امتنانه للمدربين في دورة "مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي سوبر قرار الفحص المجهري" في عام 2015. نود أن نشكر ساتيا يذكر في جانيليا للمساعدة في إعداد نموذج للسم. أثناء استعراض وتصوير أجزاء من هذا العمل وأيد جيمس فاوست زمالة T32 (5T32DK007569-28). عنصر "الورقة الضوء شعرية" في هذا العمل أيده HHMI ومؤسسة غوردون مور وبيتي. وتمول تريبهيوفان المعاهد الوطنية للصحة منح HL63199.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| منظف البلازما | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder شبكة | علوم المجهر الإلكتروني | G400F1-Au | أي شبكة ذهبية TEM ستعمل |
| غطاء زجاجي (22 × 22 مم) | تستخدم Thor Labs | CG15CH | فقط غطاء زجاجي عالي الصرامة |
| شمع البارافين | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | يجب أن تكون خالية من ألفا توكوفيرول إذا تم استبدالها |
| أولياميد | سيجما ألدريتش | O2136 | تحضير |
| الأيزوبروبانول | الطازج سيجما ألدريتش | 278475 | |
| التولوين | سيجما ألدريتش | 244511 | |
| الأسيتون | VWR الدولية | BDH1101 | |
| علوم الفحص المجهري الإلكتروني | للإيثانول | 15050 | استخدام منخفض الذوبان المواد الصلبة الإيثانول |
| حمض الهيدروكلوريك | فيشر Scientific | A144C-212 | تستخدم لغسل زجاج الغسيل الحمضي |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | مزيج بنسبة 1:10 وعلاج عند 50 درجة ؛ C لمدة 4 ساعات |
| و 35 مم طبق بتري | سانتا كروز Biotech | sc-351864 | |
| Dumont رقم 5 ملقط | علوم المجهر الإلكتروني | 72705 | مثالي لإزالة شبكة TEM في القسم 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM: F12 | Corning | 10-092 | يحتوي على 15 ملي مولار |
| قلم HEPES / Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA حل | Sigma Aldrich | A9576 | يستخدم بنسبة 0.1٪ في HBSS لغسل البلاعم غير الملتصقة |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot عند 10 & mu ؛ جم / مل وتخزينها عند -20 درجة ؛ C |
| C57BL / 6J | مختبر جاكسون | 000664 | استخدامه للعينات الثابتة أو التقنيات التي لا تتطلب عوامل تباين |
| eGFP-LifeAct الفئران | n / a | n / a | استخدام للتصوير الفلوري الحي |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | تستخدم لتلميع الأسطح الممتصة الهيدروكربونية |
المراجع
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
