مقالة منهجية

الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك

8.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56913

⸱

أبريل 3, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

في هذه المقالة

ملخص

هنا يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام الفرز [رني] الفائق لكشف أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن على وجه التحديد رهابودفيروس واللقاحيه العلاج بالفيروسات، ولكن سهولة تكييفها للأخرى أونكوليتيك برامج الفيروسات أو لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل النسخ المتماثل الفيروس عموما.

الملخص

الفائق على نطاق الجينوم [رني] (تدخل الجيش الملكي النيبالي) فحص تكنولوجيا تستخدم على نطاق واسع لاكتشاف العوامل المضيفة التي تؤثر على فيروس النسخ المتماثل. نقدم هنا تطبيق هذه التكنولوجيا لكشف أهداف المضيف التي تعدل على وجه التحديد النسخ المتماثل من فيروس مارابا، رهابدوفيروس أونكوليتيك، وفيروس اللقاحية بهدف تعزيز العلاج. حين تم اختبار البروتوكول للاستخدام مع وفيروس مارابا أونكوليتيك أونكوليتيك اللقاحية، هذا النهج ينطبق على غيره من الفيروسات أونكوليتيك، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد أهداف المضيف أن تعدل النسخ المتماثل الفيروس في خلايا الثدييات في العامة. ويصف هذا البروتوكول التنمية والتحقق من الصحة للفحص للفرز الفائق [رني] في خلايا الثدييات، والاعتبارات الرئيسية وإعداد خطوات هامة لإجراء شاشة [رني] الفائق الأولية، ودليل خطوة بخطوة إجراء شاشة [رني] الفائق الأولية؛ وباﻹضافة إلى ذلك، وهو يجمل على نطاق واسع أساليب لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والدراسات الجامعية التحقق من الصحة. الاستفادة من الفحص هو أنه يسمح لأحد الكتالوج، بطريقة شاملة وغير متحيزة، عوامل المضيف أن تعدل أي جانب من النسخ المتماثل الفيروس الذي واحد يمكن أن تتطور فحص في المختبر مثل العدوى، [رني] الفائق انفجر الحجم، وسيتوتوكسيسيتي. لديه القدرة على كشف biotherapeutic أهدافا غير متوقعة استناداً إلى المعرفة الحالية.

المقدمة

الفرز الفائق على نطاق الجينوم [رني] ثبت أن تكون أداة لا تقدر بثمن للكشف عن رؤى البيولوجي في مجالات متنوعة للدراسة بما في ذلك فيروس البيولوجيا. على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك، قامت العديد من الجماعات يستند إلى الخلية الفرز [رني] على نطاق واسع على نطاق واسع في تحديد الجينات المضيفة التي تعدل فيروس النسخ المتماثل (المراجعة في1،2،3،4 , 5 , 6 , 7)-من المثير للاهتمام، وعدد كبير من هذه الشاشات أجريت في الخلايا السرطانية والعديد من فيروسات الحالي أونكوليتيك الفيروسات المرشحة بما في ذلك اللقاحية الفيروسات8،9،10 ، ميكسوما الفيروسات11فيروس الحلأ البسيط12،13،فيروس التهاب الفم الحويصلي14ومارابا الفيروس15. بينما كان تركيز معظم هذه الدراسات على تحديد العوامل المضيفة التي تؤثر على بعض جوانب فيروس النسخ المتماثل وليس على تحديد أهداف بيوثيرابيوتيك لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك، يمكن أن تستخرج بيانات قيمة من هذه المجموعات من البيانات في هذا الصدد. فمن الواضح أن إمكانات قوية لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج لم تستغل بالكامل.

ويجري حاليا اختبار عدد كبير منصات فيروس أونكوليتيك في الدراسات السريرية والسريرية بما في ذلك فيروس القوباء الفيروسات، ريوفيروس واللقاحيه البسيط، الذي كان النجاح الملموس في وقت متأخر من مرحلة التجارب السريرية. لغالبية هذه المنابر، توجه الجهود نحو تغيير جينومات الفيروس لتعزيز العلاج. على سبيل المثال، لزيادة نوعية الورم، جينات الفيروس محددة تم حذف أو تحور لتحد بشكل كبير الفيروسية النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية، ولكن ليس في الخلايا السرطانية. في بعض الحالات، تم إضافة المتسلسلات مثل GM-CSF (عامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات) تحفيز الاستجابة المناعية أو شيكل (سيمبورتير يوديد الصوديوم) لتمكين فيفو في التصوير، وامتصاص راديويوديدي الخلوية للعلاج الأغراض. ومع ذلك، كان هناك القليل جداً العمل ركزت على التلاعب بالجينات المضيف/الورم واستكشاف أثر الجينات المضيف/ورم في أونكوليتيك فيروس النسخ المتماثل. ومع ظهور تكنولوجيا الفرز الفائق، فمن الممكن للتحقيق التفاعلات المضيف الفيروس على نطاق جينوم وفك فرصاً للتلاعب جينوم مضيف لتعزيز أونكوليتيك الفيروس العلاج الآن (استعرض في16، 17،18).

أبلغنا أول دراسة تبين دليل على المفهوم لاستخدام الفائق الوراثية الفحص لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. لاكتشاف الجينات المضيفة التي تعدل مارابا فيروس أونكوليسيس، رهابدوفيروس أونكوليتيك يجري اختباره حاليا في المرحلة الأولى والثاني المحاكمات، أجرينا شاشات [رني] على نطاق الجينوم عبر ثلاثة خطوط الخلايا الورم المختلفة في تكرار مع siRNA (التدخل في الجيش الملكي النيبالي قصيرة) مكتبة استهداف جينات 18,12015. كشف تحليل مسار الزيارات المحددة في الشاشات إثراء الأعضاء في مسارات استجابة الإجهاد ER (هيولى). اخترنا 10 مرات داخل هذه المسارات للثانوي التحقق من الصحة باستخدام siRNA مع تسلسل استهداف مختلفة عن تلك الخاصة بالشاشة الرئيسية. وكجزء من التحقق من التعليم العالي، وقد أجرينا تجربة إنقاذ مع IRE1α (التي تتطلب اينوزيتول ألفا إنزيم 1) للتأكد من أنه الضرب على الهدف. في المختبر و في فيفو الاختبار باستخدام مثبط جزيء صغير من IRE1α أسفرت عن فعالية أونكوليتيك زيادة هائلة.

ووركينهي et al. كما أجرى 12 شاشة [رني] على نطاق جينوم شرنا لينتيفيرال مجمعة (دبوس الشعر القصير الرنا) باستخدام مكتبة استهداف جينات 16,056 لتحديد العوامل المضيفة تقييد البشرية فيروس الهربس البسيط نوع 1 (هامبورغ-1) متحولة بوساطة KM100 أونكوليسيس من الثدي الخلايا السرطانية. في الشاشة الرئيسية، وحددوا الجينات 343 ضربة قاضية لتؤدي إلى سيتوتوكسيسيتي المعززة للخلايا المصابة KM100 عبر الخلايا المصابة وهمية؛ أنها اختارت 24 من هذه الجينات للتحقق من الثانوي. وتأكدت من أصل 24 الجينات، الجينات 8 في الشاشة الثانوية مع واحد منهم يجري SRSF2 (الربط سيرين/ارجينين--الغنية بعامل 2) الذي أكد في وقت لاحق باستخدام تجربة إنقاذ وراثية أثناء التحقق من التعليم العالي. توجهت المجموعة تحديد مثبط topoisomerase الحمض النووي التي العلاج الكيميائي التي خفضت الفسفرة SRSF2 وأظهرت أن علاج تركيبة KM100 هامبورغ-1 مع هذا المانع يؤدي إلى بقاء تمديد أنبوب الفئران الحاملة للورم.

وتلت في الدراسات السالفة الذكر، سير عمل مشابهة. وبدأت كل مع شاشة [رني] على نطاق جينوم أساسي متبوعاً شاشة ثانوية في عدد مختار من الزيارات المحددة في الشاشة الرئيسية. وتلت ذلك دراسات التعليم العالي التحقق من الصحة، التي تضمنت تأكيد أنه الضرب على الهدف قبل تنفيذ الوراثية الإنقاذ تجارب في المختبر مع التحقق من الصحة في نهاية المطاف يؤديها التلاعب المنتج الجينات المستهدفة في فيفو. في هذه المقالة، نحن نقدم أولاً بروتوكول عام للتنمية والتحقق منها مقايسة siRNA-الفرز الفائق، الذي ينطوي على تحديد شروط تعداء الأمثل، كمية الفيروس، وطول مدة الإصابة. نحن نقدم أيضا بروتوكول مفصلة لإجراء أولى شاشة siRNA الفائق، فضلا عن وصف عام لطريقة لإجراء التحقق من صحة الشاشة الثانوية والثالثية التحقق من صحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-التنمية والتحقق من siRNA الفائق فحص الإنزيم

ملاحظة: لجميع التجارب، استخدام وسائط النمو حبيس مخزنة المناسبة لكل خط الخلية. انظر الشكل 1 لمحة عامة لسير العمل من التحليل الأمثل للتحقق من التعليم العالي.

  1. تحديد شروط تعداء الأمثل
    1. حدد خط خلية ورم أو مثالي خلايا الورم عدة خطوط لتحسين ظروف تعداء (مثلاً س 786، NCI-H226، SF268، U373، واوفسار-8، U20S؛ انظر النقاش لمزيد من المعلومات حول اختيار خطوط الخلايا).
    2. حدد كاشف تعداء أو عدة لاختبار. قد يكون ضروريا لاختبار عدة تعداء الكواشف، كما قد تكون بعض السمية أو أكثر كفاءة من غيرها في خط خلية معينة. أيضا، ضع في اعتبارك أن بعض قد تؤثر على الإصابة بعدوى الفيروس أو قد تولد إشارة خلفية عالية عند التصوير.
    3. تقرر على الإيجابية [ه. غ. siRNA استهداف مرناً PLK-1(Polo Like Kinase 1)، مما يؤدي إلى موت الخلية] وسلبية تعداء عناصر تحكم (مثل عدم استهداف siRNA).
    4. يتبع البروتوكول تعداء العكسية للكاشف تعداء خاصة، ولكن تختلف كمية تعداء كاشف (مثل 0.05، 0.1، 0.15 و 0.2 جيدا/ميكروليتر) وخلية البذر الكثافة (مثل 625، 1250، 2500 خلايا/جيد). وتشمل replicates الشروط التالية: دون علاج الخلايا، صورية transfected الخلايا (أي الخلايا بالإضافة إلى كاشف تعداء)، والخلايا transfected مع siRNA التحكم تعداء الإيجابية والسلبية (انظر الشكل 2 ألف للوحة عينة التخطيط).
      1. وبصفة عامة، تعد 80 نانومتر تخفيف من كل siRNA لتركيز نهائي في البئر من 10 نانومتر (تبعاً للمكتبة، وتركيز أعلى من siRNA قد تكون مطلوبة). ما لم يذكر خلاف ذلك، يضعف siRNA مع الكاشف تعداء مادة. إعداد تخفيف الكاشف تعداء.
      2. بيبيت 5 ميكروليتر siRNA كل بئر تليها 5 ميكروليتر من كاشف تعداء المخفف. لتسهيل هذه الخطوة، توزع على طول عمود لوحة 96 يو-أسفل بئر ويمزج siRNA ومخفف siRNA وحدها (لغير المعالجة وصورية transfected الخلايا). توزيع على طول عمود ثاني وكاشف تعداء المخفف تعداء كاشف مخفف وحدها (للخلايا غير المعالجة).
        1. استخدام بيبيت الإلكترونية، بيبيت 5 ميكروليتر/جيدا من محتويات العمود الأول الذي يحتوي على siRNA أو siRNA مادة إلى الآبار المقابلة للوحة 384-جيدا تليها 5 ميكروليتر/بئر كاشف تعداء المخفف أو كاشف تعداء مادة من العمود الثاني.
      3. الطرد المركزي اللوحات في غ س 1026 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واحتضان للوقت المحدد للكاشف تعداء (مثلاً 5-20 دقيقة).
      4. بينما هي تفرخ اللوحات، إعداد تعليق خلية من كثافات مختلفة. بيبيت 30 ميكروليتر تعليق الخلية الواحدة وكذلك. قبل وضع اللوحات في الحاضنة، واسمحوا لوحات الجلوس لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتسوية موحدة من خلايا19.
        ملاحظة: إذا كانت فترة الحضانة المنصوص عليها للكاشف تعداء مع siRNA قصيرة، إعداد تعليق خلية قبل الحضانة.
      5. احتضانها ح 48 إلى 72 حسب الطول المطلوب لضربة قاضية المختار للشاشة.
    5. تعد إصلاح وتلطيخ حل يتكون من فورمالدهايد، هويشت 33342 وبرنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) لتركيز نهائي في كل بئر من 4% فورمالدهايد و 5 ميكروغرام/مل من هويشت 33342. حسب الحاجة، حاول أحد أعلى (مثلاً 7.5 ميكروغرام/مل) أو تركيز أقل (مثل 2 ميكروغرام/مل) من هويشت إذا كانت الإشارة ضعيفة جداً أو قوية جداً، على التوالي.
    6. الاستغناء عن 30 ميكروليتر المصبوغة وتحديد الحل مباشرة في جميع الآبار. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية. في حالة استخدام مجهر غير [كنفوكل]، يغسل اللوحات مع برنامج تلفزيوني استخدام غسالة لوحة؛ وفي معظم الحالات، الغسل غير ضرورية عند استخدام مجهر [كنفوكل].
    7. تطوير برنامج نصي لقياس عدد الخلايا كل بئر.
      ملاحظة: هناك عدة أجنحة البرمجيات المتاحة لهذا الغرض، وفي حين قد يكون لكل طرق مختلفة لإنشاء البرامج النصية، لديهم كل شيء عموما وسيلة لتحديد الأنوية والخلايا والمناطق ذات الاهتمام، فضلا عن حساب الكثافات و الخصائص المورفولوجية. عند تطوير البرنامج نصي فرز، من المهم النظر في الوقت المطلوب لتشغيل البرنامج النصي للوحة الواحدة وربما تشمل القياسات الأساسية فقط لتقليل الوقت اللازم للتجهيز. على سبيل المثال، لتحديد عدد الخلايا، واحد قد حساب مساحة هويشت كل بئر أعلاه كثافة محددة؛ وتحديد حجم انتشار الفيروس، واحد قد حساب المنطقة (بروتين فلوري أخضر) التجارة والنقل في كل بئر أعلاه كثافة محددة. البرنامج النصي "انخفاضها إلى أسفل" ستحتاج إلى مقارنة بالسيناريو أكثر تفصيلاً لضمان يتم فقدان أية معلومات أساسية.
    8. تحليل النتائج تحديد شروط تعداء الأمثل لكمية كاشف تعداء والخلية البذر الكثافة يؤدي إلى موت الخلية كبيرة (0-30% بقاء الخلية)، وهو الحد الأدنى السامة للخلايا (مثل 90-100% بقاء الخلية). ملاحظة: قد يستغرق وقتاً أطول لمراقبة النمط الظاهري موت الخلية في خطوط الخلايا بإضعاف مضاعفة فترة طويلة. انظر الشكل 2 ج 2 لنتائج تمثيلية. أيضا، ضمان أن الخلايا transfected مع عدم استهداف siRNA حوالي 90-100% روافد في وقت التثبيت كما في وقت لاحق واحدة تريد أن تصيب الخلايا الموجودة في هذا كونفلوينسي.
  2. تحديد كمية الفيروس الأمثل وطول الإصابة
    1. نفذ الخطوات تعداء عكس نفسه كما هو موضح أعلاه (انظر 1.1.4.1 إلى 1.1.4.4)؛ ومع ذلك، استخدام الشروط المثلى تعداء فقط (انظر 1.1.8) (مثلاً للخلايا 786-س: 1500 خلايا/حسنا ومن رنيم 0.05 ميكروليتر/جيدا)، وعلاوة على ذلك، تشمل آبار إضافية للإصابة بالفيروس [مثل الآبار مع الخلايا غير المعالجة، وهمية transfected الخلايا، خلايا transfected مع عدم استهداف siRNA وخلايا transfected مع عناصر إيجابية الفيروس إذا كانت تلك معروفة (أي siRNA استهداف الجينات المضيفة التي سوف تمنع أو تحسين النسخ المتماثل)].
      1. انظر الشكل 3 ألف لتخطيط لوحة عينة. احتضانها ح 48-72.
    2. يصيب الآبار فيروسات إضافية بفيروس أونكوليتيك التعبير عن بروتين مراسل فلورسنت (مثل التجارة والنقل) مع طائفة من التعدديات العدوى (MOIs) (مثلاً 0.001 إلى 10؛ النطاق المختار أن سيتوقف على مستوى المقاومة أو التعرض لخط الخلية.). وتشمل الآبار غير مصاب كذلك. بيبيت 40 ميكروليتر من كل تمييع الفيروس كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 80 ميكروليتر. الطرد المركزي كل لوحة في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. العدوى التالية، الصورة الخلايا العيش مع عالية--محتوى، الآلي المجهر على فترات منتظمة (مثلاً كل ح 4-8). انظر الشكل 3 و ج 3.
    4. تطوير برنامج نصي تحديد حجم انتشار الفيروس (مثل التجارة والنقل في المنطقة الواحدة وكذلك) (انظر 1.1.7). تحليل الصور وحدد وقت نقطة ووزارة الداخلية التي تسمح بالكشف عن الزيادة والنقصان في انتشار. ضمان النقطة الزمنية وسقوط وزارة الداخلية ضمن نطاق خطي لتيسير الكشف عن التغيرات الصغيرة في انتشار. تقدير Z-عامل (أو Z ') للنقطة وقت معين ووزارة الداخلية.
      ملاحظة: تشير التقديرات إلى Z-عامل = 1-3 (σف + σن)/| μ-μفن| وحيث σف هو الانحراف المعياري للعينة من عناصر إيجابية الفيروس و σn هو الانحراف المعياري للعينة من الفيروس سلبية الضوابط؛ وهو μف متوسط العينة عناصر إيجابية الفيروس و μن متوسط العينة من عناصر سلبية. عامل زي ما يقدر 0.5-1.0 تعتبر مقايسة ممتازة ومناسبة لفحص20،21.
    5. وتؤكد أن siRNA مكافحة الفيروسات السلبية ليس له أي تأثير على فيروس النسخ المتماثل بمقارنته الآبار ترانسفيكتيد وغير المعالجة صورية. من الضروري غالباً لاختبار عناصر سلبية متعددة كبعض siRNA سلبية يمكن أن تؤثر عناصر التحكم في النسخ المتماثل الفيروس.
  3. التحقق النهائي من مقايسة الفرز الفائق
    1. كرر الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 أعلاه، ولكن هذا الوقت تصيب الخلايا فقط مع موي الأمثل. بدلاً من تصوير حية، إصلاح ووصمة عار اللوحة (كما هو موضح في 1-1-5 و1-1-6) في أفضل وقت نقطة (انظر 1.2.4).
    2. صورة اللوحة. تحليل النتائج باستخدام البرنامج النصي نفسه الذي سيتم استخدامه للشاشة (انظر 1.1.7 و 1.2.4). تأكيد الشروط تعداء (أي جيدة ضربة قاضية في آبار transfected مع التحكم تعداء الإيجابية وسمية الحد الأدنى في آبار transfected مع التحكم تعداء السلبية). تقدير Z-عامل لتحديد مدى متانة التحليل (انظر 1.2.4).
  4. إجراء المزيد من التجارب واعتبارات لإجراء الفرز الفائق
    1. اختبار متانة لوحات microtiter قد الكراك بعض لوحات أثناء الطرد المركزي، لا سيما عندما يتم الاحتفاظ الأغطية على وهي فصل لوحات متعددة في وقت واحد. للحد من تكسير، الطرد المركزي دون الأغطية (قدمت اللوحات بالأختام)، أو إنقاص عدد اللوحات تثفيل كل دلو.
    2. اختبار استقرار خليط كاشف تعداء على مر الزمن. حالما تتم إضافة الكاشف تعداء إلى اللوحات، قد يكون هناك تأخير كبير قبل إضافة الخلايا؛ ولذلك، من المهم أن تعرف الفترة الزمنية التي ستظل خليط كاشف تعداء فعالة. على الشاشة، قد يكون من الضروري إعداد الخلايا قبل إضافة خليط كاشف تعداء إلى اللوحات.
    3. التحضير لاستخدام موزع السائلة. تحديد وحدات التخزين اللازمة للاستغناء عن كاشف تعداء، والخلايا، والفيروسات، وإصلاح آخذا في الاعتبار حجم أن يحمل الأنابيب، الحجم فقدت قبل الاستغناء عن (إذا كان للوحدة هذه الميزة)، وحجم المتبقية المطلوبة في زجاجات تستخدم الاستغناء عن.
      1. وضع واختبار البرامج التي سيتم استخدامها للاستغناء عن كاشف تعداء الخلايا والفيروسات. لتقليل خسائر كاشف تعداء، الحد، إذا كان ذلك ممكناً، العدد سلفا يوزع. وضع بروتوكول لمعايرة موزع السائلة، والاختبار، والدقة.
    4. إعداد للاستغناء عن معظم كاشف تعداء والخلايا والفيروسات
      1. أولاً تحديد عدد اللوحات بحيث تتم معالجتها في دفعة واحدة نظراً لعدد لوحات خلايا التي يمكن عمليا أن يكون تريبسينيزيد في وقت واحد، وفصل عدد لوحات ميكروتيتير التي يمكن أن تكون مرة واحدة، طول الوقت اللازم لتجهيز دفعة واحدة من لوحات مع موزع السائلة، وكذلك الوقت اللازم للتصوير. ملاحظة: عموما، تجهيز لوحات 30 تقريبا في وقت واحد مجد للغاية وتجهيز دفعات 3 لوحات التحكم في يوم واحد.
      2. تحقق من حجم الكاشف تعداء اللازمة لعملية دفعة واحدة من لوحات تجريبيا. الاختبار أن هذا الحجم كاف بالاستغناء عن ميكروليتر 5 من الماء المقطر عدة مرات عبر لوح واحد يعادل عدد المرات التي ستكون مطلوبة للعملية دفعة واحدة.
      3. لضمان التوزيع العادل للخلايا، تقدير الوقت اللازم للاستغناء عن الخلايا عبر دفعة واحدة من لوحات. تحضير زجاجة تحتوي على حجم الخلايا المطلوبة لدفعة، والاستغناء عن الخلايا في أعمدة متعددة للوحة في وقت واحد، وعلى فترات منتظمة على مدى نفس الوقت سوف يستغرق للاستغناء عن عبر مجموعة لوحات. اختبار كم سيكون الضرورية لخلط الخلايا للاحتفاظ توزيع المتساوي للخلايا.
      4. لضمان التوزيع حتى للفيروس، كرر نفس الإجراءات أعلاه (انظر 1.4.4.3)، ولكن هذه المرة الاستغناء عن الفيروسات على الآبار المتلاقية. إذا كان الفيروس لا توزع بالتساوي، النظر في إعداد الفيروس في الأنابيب المخروطية وفورتيكسينج كل أنبوبة قبل صرفها.
    5. تتبع نمو الخلايا لتحديد الفترة الزمنية لنمو خلايا كافية للشاشة. كما أن تحديد متوسط عدد الخلايا التي يمكن أن تحصد كل لوح خلايا تنمو في مرحلة تسجيل لكي تتمكن من تقدير العدد المطلوب للشاشة.
  5. خطوات التحضير النهائي للفرز الفائق
    1. تصل إلى شهر واحد قبل بدء الفحص، تحديد جميع المواد اللازمة للشاشة. ترتيب أي الكواشف المطلوبة (انظر المواد). تأمين المبلغ المطلوب للفيروس من ناحية (ويفضل استخدام نفس الرصيد الذي تم استخدامه أثناء الأمثل.).
    2. تصل إلى أسبوعين قبل بدء الفرز، ذوبان الجليد ويكبر الخلايا المطلوبة للشاشة. ضمان توافر أجهزة الطرد المركزي ودلاء مربعا أجهزة الطرد المركزي.
    3. خلال الأسبوع الذي يسبق بدء الفرز، إعداد زجاجات وسائل الإعلام لعكس تعداء والعدوى، بمخزون إيثانول 70 ٪، تعداء X 2 كاشف مخفف (مثلاً 2 X غروب-الفنزويلية)، إذا كان اللازمة (مثلاً إذا كانت المكتبة siRNA هو المخفف في رناسيفري المياه، واحد سوف تحتاج إلى استخدام 2 X ترانسفيكت الخلايا)، ومختبرين للفيروس (واحد لكل مجموعة لوحات). التحقق من حالة الخلايا.
      1. إعداد حل أسهم من وصمة هويشت 33342 (مثلاً 5 ملغ/مل). إعداد لوحة توازن إذا كان أحد سوف تكون مطلوبة من أجل سينتريفوجينج.
      2. تأمين لوحة الغسالة في حالة عمل جيدة إذا كان سيتم استخدامه. ضمان موزع السائل معايرة بشكل صحيح والاستغناء عن الدقة والتحديد. أيضا، تأكد من البرامج التي يتم تعيين بشكل صحيح على موزع السائلة.

2-إجراء الشاشة الأولية عالية الإنتاجية

ملاحظة: قبل البدء في الشاشة [رني]، لوحات ميكروتيتير (مثل لوحات 384-جيدا) يلزم أن صفت مع مكتبة siRNA وفحص عناصر التحكم. الخطوات التالية هي أفضل أجرتها شخصين مع شخص واحد (أي شخص أ) يجري المسؤولة أساسا عن الاستغناء عن كاشف تعداء والخلايا عبر اللوحات، ويجري الشخص الثاني (أي شخص ب) المسؤولة عن سينتريفوجينج لوحات فورا قبل تعداء وإعداد الخلايا. بين قوسين هي بعض التفاصيل لتجهيز دفعة واحدة من لوحات 33 (أي نصف المكتبة) مع خط الخلية 786-O.

  1. إعداد لعكس تعداء
    1. الشخص ألف: وضع ما يكفي من وسائل الإعلام، التربسين وبرنامج تلفزيوني اللازمة للعملية دفعة واحدة من لوحات في حمام مائي 37 درجة مئوية. اختياري: تريبسينيزي صفيحة خلايا، وحساب عدد الخلايا للوحة الواحدة بغية تقديم تقدير في الوقت الحقيقي لعدد اللوحات المطلوبة كل دفعة.
    2. الحصول على دفعة لوحات (مثلاً 33 اللوحات) من الثلاجة وانتظر 20-30 دقيقة للسماح باللوحات إذابة الثلج. بينما يتم إزالة الجليد اللوحات، تابع مع الخطوات التالية.
      1. الشخص ألف: بيبيت إلى 50 مل مخروطية أنابيب مبلغ تعداء كاشف مخفف اللازمة لتجهيز دفعة واحدة من لوحات (مثل مل 2 × 37.125) ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. ملء زجاجتين مع 70% إيثانول (مثل زجاجات 250-500 مل). شغل اثنان من أنابيب مخروطية 50 مل مع برنامج تلفزيوني وواحدة مع الماء المقطر.
      2. الشخص ألف: تزج موزع السائلة الأنابيب في زجاجة الإيثانول 70%. إذا لن يتم استخدام كل من النصائح للاستغناء عن الكاشف تعداء (مثلاً إذا لم يتم استخدام الآبار الخارجي اللوحة)، فصل الأنابيب لا لزوم لها أولاً. ضع قطعة من إخفاء الشريط حول الأنابيب وضع علامة على هذه النقطة أدناه والتي يمكن أن تعتبر في الأنابيب معقمة. رئيس الوزراء مع حوالي 25 مل. صب الإيثانول إضافية في زجاجة لاستبدال وحدة التخزين المفقودة. الأنابيب واسمحوا الجلوس في الإيثانول لمدة 5 دقائق على الأقل.
      3. الشخص باء: التحضير تريبسينيزي الخلايا. رذاذ هود زراعة الأنسجة (TC) مع الإيثانول 70%. رذاذ ويوضع بيبيتس اللازمة والنصائح، والزجاجات و [ميكروفوج] أنابيب لإعداد الخلايا في هود (انظر 2.2.1.1 و 2.2.1.2). الطرد المركزي لوحات مختومة في مجموعات في غ س 1026 لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأغطية من اللوحات في غطاء TC، إذا قرر سابقا أن اللوحات قد صدع أثناء الطرد المركزي عندما يتم الاحتفاظ الأغطية على (انظر 1.4.1).
    3. الشخص ألف: إزالة الأختام من اللوحات. قبل أو أثناء أو بعد الأختام قد أزيلت (تبعاً لطول مدة الحضانة المطلوبة)، بيبيت المبلغ المطلوب من تعداء كاشف (مثلاً 375 ميكروليتر/أنبوب لتركيز 0.05 ميكروليتر رنيم/بئر نهائية) في أنابيب مخروطية تتضمن مخفف كاشف تعداء المعالجون مسبقاً (مثلاً 37.125 مل/أنبوب).
    4. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة للوقت المحدد للكاشف تعداء قيد الاستخدام (مثل 0-10 دقيقة).
  2. عكس تعداء
    1. وقد "ب الشخص" إكمال المهام التالية.
      1. تبدأ تريبسينيزينج الخلايا (مثل 3 ألواح الخلايا 786-O). نضح وسائط الإعلام من كل لوحة. شطف مع مل 9 من برنامج تلفزيوني. بيبيت 3 مل التربسين للوحة الواحدة. احتضان في 37 درجة مئوية لحوالي 5 دقيقة ريسوسبيند الخلايا مع مل 22 من وسائل الإعلام. بيبيت صعودا وهبوطاً 10 مرات.
      2. الجمع بين تعليق خلية من كل لوحة زراعة الأنسجة في زجاجة معقمة. مزيج من تعليق خلية بالعكس. بيبيت مختبرين 1 مل من تعليق خلية في اثنان منفصلة [ميكروفوج] أنابيب. إزالة عينة من كل [ميكروفوج] أنابيب وحساب الخلايا. حساب حجم تعليق الخلية المطلوبة للكثافة المطلوبة (مثلاً 1500 بئر/الخلايا)، وإعداد ما يكفي تعليق خلية المخفف (مثلاً 500 مل) الاستغناء عن عبر دفعة واحدة من لوحات.
    2. وقد ألف شخص بإكمال المهام التالية بالتوازي مع "الشخص باء"
      1. إفراغ السائل موزع أنابيب من الإيثانول. رئيس الوزراء الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني، ثم قم بإفراغ الأنبوب. كن حذراً عند التعامل مع الأنابيب التأكد من أن الجزء الأنابيب أدناه إخفاء الشريط الذي سوف تكون مغمورة في الكاشف تعداء وتظل عقيمة لاحقاً في تعليق خلية. تفصل الصفائح التي يمكن أن يتم بأمان مع أنبوب مخروطي واحد من تعداء كاشف الحل.
      2. بيبيت الحلول كاشف تعداء أعلى وأسفل 10 مرات. رئيس الوزراء الأنبوب مع الحل كاشف تعداء. لتقليل خسائر كاشف تعداء، رئيس الوزراء بحل ما يكفي الكاد مسح النصائح. حدد البرنامج الصحيح على موزع السائلة والاستغناء عن 5 ميكروليتر من تعداء كاشف كل بئر.
        تنبيه: ترصد عن كثب مستوى الكاشف تعداء حيث أن ذلك هو تجديد قبل أن يفوت. الإنجاز اللوحات التي مجموعة وبصرف النظر ينبغي أن توفر تلميحاً إضافة مزيد من حل الكاشف تعداء.
      3. الطرد المركزي اللوحات في 1026 x ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هذه المرة سوف تكون الأغطية، حيث قد يكون من الضروري الطرد المركزي لوحات أقل في وقت واحد لمنع تكسير (مثل 2 لوحات كل دلو). احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة للوقت المحدد للكاشف تعداء قيد الاستخدام (مثل 10-20 دقيقة).
      4. أثناء الاحتضان، إفراغ الأنبوب الحل كاشف تعداء، ووضعه في أنبوب مخروطي كامل 50 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني. شطف الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني فتيلة وإفراغ.
        1. إذا كان أكثر من النصائح ذاهبون لاستخدامها للاستغناء عن الخلايا مما كانت تستخدم للاستغناء عن كاشف تعداء، إعادة إرفاق الأنابيب غير مستخدمة، وإعادة تعقيم جميع الأنابيب مع الإيثانول 70% قبل الشطف الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (انظر 2.1.2.2).
      5. مزيج من الزجاجة التي تحتوي على تعليق خلية مرة واحدة وقد تم إعداده. ضع الأنابيب في تعليق خلية، ورئيس الوزراء ما يكفي لمعرفة أن يتم الاستغناء عن كل نصيحة بشكل صحيح. الاستغناء عن 30 ميكروليتر كل بئر تعليق خلية عبر جميع لوحات. إذا لزم الأمر، مزيج من تعليق خلية في فترات منتظمة لتجنب تسوية.
        تنبيه: في بعض الأحيان قد عصا قطرات تعليق الذي يحتوي على وسائط الإعلام للجانبين من النصائح. عندما يلاحظ هذا، نضح في أقرب وقت ممكن أو مسح بواسطة أنسجة خالية من الوبر صب في الإيثانول 70%.
      6. إفراغ الأنبوب تعليق خلية. شطف الأنبوب مع حوالي 25 مل من برنامج تلفزيوني، تليها حوالي 50 مل ماء المقطر.
    3. السماح لوحات للجلوس لمدة 45-60 دقيقة من الوقت خلية البذر في درجة حرارة الغرفة قبل أن تعود اللوحات للحاضنة. احتضان اللوحات في حاضنة دون عائق للطول المطلوب للجينات إسكات (مثلاً ح 48) (انظر 1.1.4.5).
  3. العدوى
    1. لتوفير الوقت، اليوم قبل إصابة الخلايا، وزجاجات بيبيت إلى العقيمة المبلغ الدقيق للوسائط المطلوبة لتصيب كل دفعة من لوحات بما في ذلك وسائط الإعلام للآبار غير مصاب (مثل 2 × 350 مل و 2 × 50 مل لوحات 33). وبالإضافة إلى ذلك، اختبار موزع السائلة للضبط والدقة، وإعادة معايرة إذا لزم الأمر.
    2. الحارة وسائط الإعلام على 37 درجة مئوية. ملء زجاجتين مع الإيثانول 70%، واثنين من أنابيب مخروطية 50 مل مع برنامج تلفزيوني، وواحدة مع الماء المقطر. تحقق من أجهزة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة.
    3. تعقيم الأنابيب مع الإيثانول 70%، وشطف مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا (انظر 2.1.2.2 و 2.2.2.1). بينما الأنبوب يجلس في الإيثانول، بيبيت حجم الدقيق للفيروسات المطلوبة في زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام سابقا استعداد للعدوى (انظر 2.3.1). شطف الأنبوب مع برنامج تلفزيوني فتيلة مع 25 مل وثم إفراغ.
    4. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها في غطاء TC. رئيس الوزراء الأنبوب مع وسائل الإعلام. الاستغناء عن 40 ميكروليتر من وسائل الإعلام في آبار مراقبة غير مصاب. إفراغ الأنبوب لوسائط الإعلام وشطف مع 25 مل برنامج تلفزيوني. (انظر 2.2.2.5 لتنبيه)
    5. بعد خلط الفيروس، وضع الأنابيب في زجاجة تحتوي على الفيروس. الاستغناء عن 40 ميكروليتر من الفيروسات عبر اللوحات. الطرد المركزي لوحات لمدة 30 دقيقة في 400 غرام x في درجة حرارة الغرفة. العودة اللوحات للحاضنة. احتضان اللوحات لطول الفترة الزمنية (مثلاً ح 24) سبق تحديدها (انظر 1.2.4).
  4. تحديد، وتلطيخ الخلايا
    1. توفيرا للوقت، في اليوم السابق لتحديد، تحضير زجاجة من إصلاح وتلطيخ محلول يحتوي على الفورمالديهايد، وبرنامج تلفزيوني (مثل مل 179 من 37% فورمالدهيد ومل 270 من برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 4% فورمالدهايد) لكل دفعة من اللوحات، ولكن تجاهل هويشت وصمة عار. تخزين في الاشتعال مجلس الوزراء بعيداً عن الضوء.
    2. شطف الأنبوب مع الإيثانول 70% وبرنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا (انظر 2.1.2.2 و 2.2.2.1). إضافة حجم هويشت المطلوبة (على سبيل المثال. 2.5 مل من 5 ملغ/مل هويشت لتركيز نهائي في البئر 7.5 ميكروغرام/مل) لتحديد وتلطيخ الحل ومزيج.
    3. الاستغناء عن 30 ميكروليتر من تحديد وتلطيخ الحل عبر جميع لوحات. وضع اللوحات في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. وبعد الحضانة، تطبيق الأختام على اللوحات وتخزين اللوحات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. غسل الأطباق إذا لزم الأمر (انظر 1.1.6).
  5. تصوير وتحليل الصور
    1. صورة اللوحات مع مجهر الآلي، وارتفاع محتوى. استخدام إعدادات محددة مسبقاً، ولكن أول اختبار الإعدادات للتأكد من إدخال أي تعديلات بحاجة إلى بذل.
    2. التحديد الكمي التجارة والنقل (أو أخرى مراسل الفلورسنت) ومنطقة هويشت الواحدة وكذلك باستخدام البرنامج النصي السابق المتقدمة (انظر 1.3.2). اختبار البرنامج النصي مع حفنة من لوحات أولاً لتحديد إذا كان أي تعديلات طفيفة تحتاج إلى قبل دفعة تحليل جميع اللوحات.
    3. تحديد عدد الزيارات. ملاحظة: الأسلوب Z-نقاط/جنون (متوسط الانحراف المطلق) قوية هو أسلوب الذي يستخدم عادة في تحقيق هذه الغاية. بشكل عام، عشرات > 2 أو <-2 تم تعيينها كانقطاع. يتم استخدام هذه الطريقة أفضل عندما تكون موزعة بشكل عشوائي عبر اللوحات عينات siRNA وليس، على سبيل المثال، مجمعة حسب وظيفة حسب العينات التي تستخدم كعناصر تحكم السلبية الفعلية . تصفية سيرناس السامة للخلايا كهذه سيكون من المتوقع أن الانخفاض غير تحديداً الفيروس ينتشر (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل عن تصفية يضرب السامة للخلايا).

3-التحقق من صحة الشاشة ثانوية مرات مع مكتبة شرنا لجنة الحقيقة والمصالحة (اتحاد [رني])

ملاحظة: انظر المناقشة للحصول على تفاصيل حول تحديد مرات للتحقق الثانوي وإمكانية فحص التكنولوجيات. إذا تم تحديد التكنولوجيا siRNA للتحقق من صحة الثانوية، يمكن استخدام بروتوكول التنمية والتحقق من صحة المقايسة نفسه كما كان يستخدم للشاشة الرئيسية (انظر 1).

  1. الحصول على مكتبة شرنا لجنة الحقيقة والمصالحة مخصصة استهداف الجينات المرشحة للفائدة كمخزون الجلسرين.
  2. إعداد تعداء نوعية بلازميد الحمض النووي من مخزونات والغليسيرول. ملاحظة: بروتوكول مفصل (أي "شرنا/سجرنا/ORF والغليسيرول وإعداد بلازميد الحمض النووي") يمكن الاطلاع على هنا: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. إنتاج lentiviruses الإعراب عن شرنا استهداف جينات الفائدة مع والبلازميدات الحمض النووي. ملاحظة: بروتوكول مفصلة لإنتاج لينتيفيروس في لوحات 96-بئر [أي "شرنا/سجرنا/ORF إنتاجية عالية الإنتاج الفيروسية (96 جيدا)"] يمكن الاطلاع هنا: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. تصيب الخلايا التي تحتوي لينتيفيروسيس. ملاحظة: بروتوكول مفصل للإصابة لينتيفيرال في لوحات 96-جيدا (أي "الإصابة لينتيفيرال") متاحة على الإنترنت في http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. تصيب الخلايا بفيروس أونكوليتيك أما التحديد بوروميسين التالية (انظر 3.4 للبروتوكول الاختيار) من الخلايا ترانسدوسيد بنجاح أو توصيل التالية مباشرة (بدون تحديد بوروميسين). لتحديد كمية الفيروس الأمثل ومدة حضانة الفيروس، استخدم نفس الطريقة المستخدمة للشاشة الرئيسية.

4-التعليم العالي التحقق من الصحة

ملاحظة: الغرض من التحقق من التعليم العالي أساسا تأكيد أن الضرب الهدف، ورم معين، ويعزز فعالية المجراة في. اختبار واحد يمكن أيضا عما إذا كان ينظم انتشار عبر طيف خطوط الخلايا السرطانية

  1. تأكيد أن ضربة قاضية للجينات المرشحة على الهدف
    1. أولاً التأكد من أن هناك علاقة بين النمط الظاهري وإسكات الجينات. استخدام التحليل نفسه تم تطويره للشاشة أو تعديله لصيغة 6-جيدا لتقييم تعزيز أو إعاقة انتشار المرض بشكل أكبر. إجراء دورة وقت مع خلايا transfected مع siRNA استهداف gene(s) اهتمام زائد وناقص الفيروس.
    2. صورة الآبار التي تحتوي على الخلايا المصابة بالفيروس، وجمع ليساتيس الخلية من الآبار غير مصاب في فترات زمنية منتظمة. تحديد ما إذا كان هناك ارتباط بين إسكات الجينات وتعزيز أو إعاقة انتشار. تقييم إسكات الجينات "الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل" (qPCR) و/أو النشاف الغربية.
    3. إجراء تجربة إنقاذ وراثية للتأكد من الضرب على الهدف. ملاحظة: في تجربة إنقاذ نموذجية، الجينات المرشحة هي طرقت إلى أسفل مع [رني] بينما في الوقت نفسه هي transfected خلايا عابر مع كدنا مقاومة [رني] (مثلاً أورثولوج من الجينات) التعبير عن الجينات المرشحة لتحديد ما إذا كان استعادة النمط الظاهري الجينات أو "إنقاذ". يمكن أيضا أن تستخدم خطوط الخلايا مستقرة overexpressing كدنا مقاومة [رني] من الجينات المرشحة للفائدة.
    4. بدلاً من ذلك، بدلاً من تجربة إنقاذ وراثية، استخدام فحوصات المتعامدة متعددة للتأكد من أن الضرب على الهدف [مثل تحديد ما إذا كان يتم الحصول على النمط الظاهري نفسه عند ضربة قاضية للجينات المستهدفة مع سيرناس متعددة، عند ضربة قاضية ل الجينات المستهدفة في عدة أسطر الخلية مستقر معربا عن شرنا ضد الجينات المستهدفة، وعند خروج المغلوب مع كريسبر (متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار)-التكنولوجيا Cas9 في خطوط الخلايا متعددة.].
  2. تأكيد أن الضرب ورم على حدة وينظم انتشار عبر مجموعة من خطوط الخلايا السرطانية
    1. القيام مقايسة مماثلة كما هو الحال في 4.1.1، لكن مع الخلايا الطبيعية فضلا عن أخرى خطوط الخلايا السرطانية.
  3. تأكيد أن التلاعب بالجينات مرشحة يعزز فعالية في فيفو
    ملاحظة: هو موضح أدناه ثلاثة طرق ممكنة للتلاعب الجينات المستهدفة في فيفو.
    1. العثور المخدرات للتلاعب بالجينات المستهدفة. إذا كان هناك دواء مثل مثبط جزيء صغيرة التي تستهدف نفس الجين، إدارة مع فيروس أونكوليتيك في فيفو. من المهم تحديد التوقيت الأمثل لإدارة المخدرات.
    2. مهندس الفيروس لتمنع أو أوفيريكسبريس الهدف الجينات اعتماداً على ما إذا كان أحد يرغب أن تعوق أو تعزز الهدف الجينات. لكبح الجين، مهندس الفيروس أونكوليتيك للتعبير عن مهيمن سلبية من الجينات أو للتعبير عن شرنا استهداف الجينات. تعزيز التعبير عن الهدف الجينات، استنساخ الفيروس أونكوليتيك مع التحوير overexpressing الجينات.
    3. مهندس خطوط الخلايا مع الجين طرقت إلى أسفل أو من طرقت استخدام شرنا أو التكنولوجيا كريسبر-Cas9، على التوالي. زرع خط الخلية هندسيا والبرية-النوع الخلية خط في فيفو وبعد ذلك تصيب بفيروس أونكوليتيك. ملاحظة: هذا الأسلوب بمثابة دليل لمبدأ ويمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كان استثمار المزيد من الوقت والموارد لتطوير دواء للتلاعب الجينات في فيفو، على سبيل المثال، سيكون من المفيد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن سير العمل لتحديد أهداف المضيف لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك.

كما هو موضح في الشكل 1، هو الخطوة الأولى الحاسمة لإجراء شاشة [رني] الفائق التنمية المقايسة. يوفر الشكل 2A تخطيط لوحة عينة للفحص الأمثل تعداء. الشكل 2B يتكون من صور الممثل للنتائج المتوقعة، و الشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم هنا بروتوكولا لتوظيف الفرز الفائق [رني] لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج فيروس أونكوليتيك. وهذا قد تم اختباره بنجاح مع أونكوليتيك مارابا فيروس وفيروس اللقاحية أونكوليتيك، ولكن، كما ذكر، فإنه يمكن تكييفها للاستخدام مع غيره من الفيروسات أونكوليتيك أو غيره من الفيروسات عموما تحديد الجينات المضيفة التي تعدل النسخ المتماثل الفيروس. بروتوكول الفحص يهدف أيضا تحديد الجينات التي تزيد أو تقلل انتشار، ولكن من الممكن تعديله سهولة لقراءات أخرى. شاشاتنا مع الفيروس مارابا، على سبيل المثال، صممت لتحديد الجينا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل منح مقدمة من معهد أونتاريو لبحوث السرطان، ومؤسسة كندا للابتكار، ومؤسسة مكافحة السرطان الإقليمي في أوتاوا، ومعهد أبحاث تيري فوكس. K.J.A. أيده على "كندا فانييه منحة الدراسات العليا"، المعهد الكندي لجائزة بحوث ماجستير من الصحة، و "منحة الدراسات العليا أونتاريو".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية >مستهلكات< / قوية >
مكتبة الحمضالنووي الريبي GE DharmaconG-005005-02
Corning 384-بئر لوحةCorning3985
Falcon 384-بئر صفيحةBecton Dickinson353962
WaterSigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars التحكم السلبي siRNAQiagenSI03650318
siGenome غير المستهدف siRNA Pool # 2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM / HIGH GlucoseGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
مصل الأبقار الجنينيSigmaF15051-500ML
محلول HEPES (1M)SigmaH3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solutionGE Healthcare LifeSciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25٪)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS / ModifiedGE Healthcare LifeSciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
OligofectamineThermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Resazurin ملح الصوديومSigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
الفورمالديهايد (37٪ بالوزن)زجاجات فيشر ScientificF79-4
500 ملCorningفيلم ختم لاصق 430282
للألواح الدقيقةExcel Scientific361006007
قابل للنزع رقائق الختم الحراريThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo حدد كاسيت موزعفيشر العلمي11-120-625
name< strong>الشركة< / strong>Catalog عدد< / قوي >< قوي > تعليقات < / قوي >
< قوي > معدات < / قوي >
MicroFlo Select (موزع سائل) FisherScientific11120621
BioTek Synergy HT قارئ لوحةBiotekN / A
Opera أداة التصوير والتحليلPerkinElmerHH10000115
تحليل وأتمتة ذروة الذراع الروبوتية KiNEDx(المعروفة سابقا باسم Peak Robotics)KX-300-660
Cytomat 24C سلسلة حاضنة آليةThermo Fisher Scientific50080227
محطة العمل الآليةJANUS PerkinElmerAJI4M01
ذروة التحليل والأتمتة (المعروفة سابقا باسم Peak Robotics)N / A
Alps 3000 لوحة السدادةثيرمو فيشر العلميAB-3000
لوحة لوحة دائري

المراجع

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431(2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة