يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا

18.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56921

⸱

فبراير 15, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام ثقافة انتيرويد من الماوس الولدان أو الأمعاء البشرية المبكرة، فضلا عن طريقة فعالة لجمع الحليب من الفئران.

الملخص

البشرية الصغيرة انتيرويدس المعوية مستمدة من الأقبية وعندما تزرع في خلايا الجذعية متخصصة تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية. القدرة على وضع انتيرويد البشر السابقين فيفو ثقافة نظم مهمان لنموذج المعوية الفيزيولوجيا المرضية ودراسة الاستجابات الخلوية خاصة المعنية. في السنوات الأخيرة، انتيرويدس من البشر والفئران التي تستزرع، باساجيد، وراهن بعيداً لاستخدامها في المستقبل في عدة مختبرات عبر العالم. يمكن استخدام هذا النظام الأساسي انتيرويد لاختبار آثار مختلف العلاجات والأدوية، وما هي الآثار التي تمارس على أنواع مختلفة من الخلايا في الأمعاء. هنا، على بروتوكول لإنشاء الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة المعوية انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة ويتم توفيرها من الأمعاء البشرية سابقا لأوانه. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا النظام الثقافي انتيرويد لاختبار آثار حليب الثدي إبلاغها. حليب الثدي الماوس يمكن الحصول على كفاءة استخدام مضخة الثدي البشري معدلة ويمكن بعد ذلك استخدام الماوس أعرب الحليب لتجارب بحثية أخرى. نحن الآن إثبات آثار الماوس المعرب عنها، والبشرية، ولبن الثدي من معط على نمو وانتشار انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة أو الأمعاء البشرية سابقا لأوانه.

المقدمة

التهاب الأمعاء النّاخر (NEC) هو السبب الرئيسي للوفاة من الأمراض المعوية الخدج، التي تؤثر على ما يقرب من 1 في 10 الرضع المولودين قبل 29 أسبوعا من الحمل1،،من23. نصف الرضع مع تقدم اللجنة الوطنية للانتخابات بشكل أشد، حيث البقاء على قيد الحياة هو فقط 10-30 ٪4،5. في الولايات المتحدة، ما يقدر 2 بیلیون دولار أمريكي سنوياً تنفق علاج الرضع مع اللجنة الوطنية للانتخابات6،7، ولكن معدل البقاء على قيد الحياة ولا العلاج قد تغيرت على مدى السنوات ال 30 الماضية. الآلية المرضية للجنة الوطنية للانتخابات تتميز بإصابة الأمعاء وضعف الأغشية المخاطية الشفاء8،9،10،11، ومع ذلك، مما يشير إلى الممرات المؤدية إلى تفاقم الاستجابة الالتهابية وآليات لعكس الالتهاب ما زالت مفهومة.

إدارة لبن الثدي البشري قد وجد أن تكون استراتيجية وقائية فقط ضد NEC الخدج. وقد أظهرنا سابقا أن لبن الأم يحمي ضد تطوير اللجنة الوطنية للانتخابات عن طريق تثبيط مستقبلات عدد القتلى مثل مستقبلات المناعة الفطرية 4 (TLR4) في ظهارة الأمعاء عن طريق مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) مما يشير إلى مسار11. مكملات حليب الثدي لصيغة تجريبية NEC يخفف الاستجابة الالتهابية في NEC كما يتبين من تثبيط استموات enterocyte وإعادة الانتشار انتيروسيتي بطريقة تعتمد على نمو البشرة EGFR11وعامل (مماثلة). وفي دراسة أخرى، تبين أن النترات، عنصرا آخر من حليب الثدي، ويساهم في طبيعته الواقية من خلال تحوير التروية المعوية، بالمقارنة مع الرضع، التي تفتقر إلى نترات وقد تسهم في زيادة تواتر NEC في صيغة تغذية الرضع12،13. وتشمل المركبات الأخرى الموجودة في لبن الأم التي أظهرت أن تشارك في الحماية ضد لجنة الانتخابات الوطنية oligosaccharides اللبن البشري، ارجينين، الجلوتامين، و lactoferrin14،،من1516، 17،،من1819. هذه العناصر المفيدة من لبن الثدي تكشف عن ضرورة استخدامه في الوقاية من اللجنة الوطنية للانتخابات، ولكن أيضا التشديد على أهمية دراسة الآليات، مما يشير إلى مسارات، والتأثيرات الخلوية تشارك في كيف حليب الثدي هو التوسط للحماية من NEC .

من أجل إجراء مزيد من الدراسة الخصائص الواقية من لبن الثدي في نموذج الفأر من اللجنة الوطنية للانتخابات، قمنا بتطوير تقنية مبتكرة وسهلة الاستخدام عن طريق الماوس التي يمكن استخراج حليب الثدي من سد أنيسثيتيزيد استخدام الثدي البشري كهربائية مضخة11،12 . هذه الاستراتيجية للحصول على حليب الثدي الماوس مفيد، ليس فقط لأن مضخات الثدي البشري متاحة وفعالة في الحصول على حليب الثدي، بل أيضا لأن هذا الأسلوب يسمح بتحليل حليب الثدي إبلاغها. نتيجة لذلك نحن يمكن مقارنة آثار الماوس حليب الثدي حليب الثدي البشري المعرب عنها، فضلا عن المبستر المتبرع البشري الحليب من بنك حليب في نماذج إبلاغها. يسمح هذا الأسلوب لدراسة مكونات لبن الثدي فيما يتعلق بمساهمتها في منع اللجنة الوطنية للانتخابات. غيرها من المحققين قد وضعت أساليب استخراج حليب الثدي، ولكن هذه التقنيات اليدوية، وعادة ما تتطلب أكثر من مختبر الأعضاء20،،من2122. ويرد هنا أسلوب سهل التي يمكن استخدامها بواسطة تعديل مضخة الثدي كهربائية بشرية لجمع الحليب من ماوس. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية إلى أنواع أخرى.

استجواب الممرات مما يشير إلى المشاركة مع اللجنة الوطنية للانتخابات على نحو كاف، تلزم نظم نموذجية لتقييم جميع أنواع خلايا مختلفة من المعروف أن تتأثر في عملية المرض. هنا، نحن نناقش واحدة مثل هذا النظام النموذجي-انتيرويدس-وإنشائها من الماوس والأمعاء البشرية. انتيرويدس المعوية البشرية (هييس) وبخاصة تقديم وعود كبيرة، لأنها توفر مبتكرة ومتنوعة جينياً السابقين فيفو بشرية نموذجا للمساعدة في دراسة العمليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدث في الجهاز الهضمي 23-انتيرويدس تم العثور على أن تكون مثقف طويل الأجل ويمكن أن تجمد ل استخدام لاحق23، وخلافا "البشرية أورجانويدس المعوية" (هيوس)، يتم وضع الذين الثقافات من الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي، يتم إنشاء انتيرويدس من الخلايا الجذعية في24من الخبايا المعوية المعزولة. انتيرويدس تتطلب صيانة أقل، ويمكن أن تكون مصابة بسرعة25، ويمكن أن تنشأ بسهولة نظراً الخبايا المعوية هي أكثر تمايزاً من هيوس23. ولذلك، نقدم هيس العديد من المزايا على التقنيات الموجودة لأنه يمكن تطويرها ليحمل الخصائص التركيبية والوظيفية الخاصة بالمنطقة ل ظهارة المعدة والأمعاء البشرية23. استخدام انتيرويدس خيار فعال للغاية عندما تحتاج إلى نموذج الإنسان من الأمعاء، مع التقيد بالقيود الخاصة بالمنطقة وسهولة الاستخدام. هنا نظهر تقنية عزل والحفاظ على الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة الأمعاء انتيرويدس من الفئران والإنسان الخدج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ووافق جميع الإجراءات الحيوان في هذه الدراسة أما جامعة واشنطن في سانت لويس رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (بروتوكول 20160187) أو مؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة بيتسبرغ واستخدام اللجنة (بروتوكول 14103918). تم الحصول على الأمعاء الدقيقة الجنين البشري في أقل من 24 أسبوعا من الحمل وفقا للمبادئ التوجيهية جامعة بيتسبرغ الأنسجة التشريحية الشراء بعد موافقة "مجلس المراجعة المؤسسية" (بروتوكول PRO14100537) من جامعة بيتسبرغ بنك الأنسجة العلوم الصحية من خلال نظام وسيط النزيه. تم الحصول على لبن الثدي البشري الشطب المحددة أو لبن الثدي من معط المبستر مع التنازل عن موافقة من جامعة "بيتسبرغ مجلس المراجعة المؤسسية".

1-سرداب العزلة وإنشاء انتيرويدس من الفئران حديثي الولادة أو السابق لأوانه الأمعاء البشرية

  1. إعداد الوسائط
    ملاحظة: وسائط الإعلام وينبغي إعداد في هود اليوم قبل عزل سرداب.
    1. إعداد 1.11 L ثقافة وسائل الإعلام. تبدأ مع 1 لتر المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر ولام الجلوتامين وإضافة 110 مل مصل البقر الجنين (FBS) (تركيز نهائي 10%)، 11 مل الأنسولين المعقمة البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%)، و 1.1 مل (النهائي تركيز 0.1%).
    2. إعداد الخليط 500 مل برنامج تلفزيوني-المضادات الحيوية. تبدأ مع 500 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) بنسبة 10% FBS وإضافة 5 مل الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، 1 مل الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%)، و 5 مل البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%).
    3. إعداد 30 مل خلية تعطيل وسائط #1. أولاً إعداد 30 مل ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 600 حمض الإيثيلين 0.5 M ميليلتر (يدتا) (تركيز نهائي 10 ملم)، 300 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، و 60 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%).
    4. إعداد 30 مل خلية تعطيل وسائط #2. أولاً إعداد 30 مل ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 300 يدتا 0.5 M ميليلتر (التركيز النهائي 5 مم)، 300 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، و 60 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%).
    5. إعداد 50 مل سرداب ثقافة وسائل الإعلام دون عوامل النمو. قياس 33.4 مل 1 x المتقدمة دميم/و-12 وإضافة 10 مل FBS (التركيز النهائي 20%).
      1. إضافة 500 ميليلتر البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر لام الجلوتامين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، 100 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%)، ميليلتر 2.5 1 م N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane حمض السلفونيك (حبيس) (تركيز النهائي 0.05 مم)، 500 ميليلتر 100 مم ن-أسيتيل (التركيز النهائي 1 ملم)، 500 ميليلتر 100 x N-2 الملحق، 1 مل 50 س خالية من المصل الملحق (مثلاً، B-27) ناقص فيتامين (أ)، و 500 ميليلتر 1 مم 100 × Y-27632.
    6. إعداد 1 مل سرداب ثقافة وسائل الإعلام مع عوامل النمو. أولاً إعداد 1 مل من "وسائط الثقافة سرداب دون عوامل النمو". إضافة 2.5 ميليلتر 40 ميكروغرام/مل Wnt3a (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر)، 1 ميليلتر 100 ميكروغرام/مل رأس (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر) و 2 ميليلتر 250 ميكروغرام/مل R-سبوندين (تركيز نهائي 500 نانوغرام/ملليلتر) 0.5 ميليلتر 100 ميكروغرام/مل لو (التركيز النهائي 50 نانوغرام/مل).
  2. عزل سرداب
    1. مكان solubilized استخراج غشاء الطابق السفلي (انظر الجدول للمواد) على الجليد الذوبان قبل بداية.
      ملاحظة: سوف بلمرة الغشاء الحفاظ على الجليد أو أنها.
    2. امتثالا لبروتوكول رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة للفئران أكثر من 14 يوما عمر، euthanize الفئران مع اثنين من الأساليب للقتل الرحيم مع الثانية يجري إجراء مادية لضمان الموت.
      ملاحظة: للفئران أقل من 14 يوما عمر، قطع الرأس هو الإجراء القياسي باستخدام مقص.
    3. باستخدام المقص والملقط، جعل شق عمودي أسفل خط الوسط من البطن، عن طريق الجلد والصفاق، لطول البطن. المكوس في الأمعاء من المعدة للأعور مع المقص وإزالة في مساريق مع الملقط.
      ملاحظة: استخدمت عمرها يومين الأسبوع الذكور والإناث C57BL/6J الماوس الجراء، كل وزنها 5.5-7 غ، لعزل سرداب. يمكن استخدام أي عمر أو حجم الماوس لعزل سرداب.
    4. لتحضير الأمعاء المقطوع حديثا لعزل سرداب، ضع الأمعاء مباشرة، وقطع الأمعاء طوليا طول كامل باستخدام مقص.
      ملاحظة: الماوس والأمعاء البشرية يمكن إعداد المثل.
    5. تنظيف البراز من الأمعاء بلطف تهز الأمعاء ذهابا وإيابا في طبق بتري مملوءة "خليط" PBS-المضادات الحيوية باستخدام الملقط.
    6. إضافة 30 مل من الخلية تعطيل وسائط #1 إلى أنبوب مخروطي 50 مل. يقتطع 0.5 سم طول القطع مباشرة في الأنبوب الأمعاء. تعيين الأنبوب دلو الجليد وتحرض بلطف على شاكر على أقل سرعة لمدة 15 دقيقة.
    7. بينما الأنسجة على شاكر، الحصول على لوحات 24 أو 48 جيدا تنمو الأقبية إذا انتيرويدس التي ستستخدم للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو عزل البروتين. استخدام الدائرة 8-بئر الشرائح تنمو الأقبية إذا انتيرويدس التي ستستخدم لكل جبل تصوير [كنفوكل].
    8. في هود، إضافة 15 ميليلتر من الغشاء إلى الجزء السفلي من كل بئر من لوحة كذلك 24 أو 48. في حالة استخدام شرائح الدائرة، إضافة 9 ميليلتر من الغشاء إلى الجزء السفلي من كل دائرة.
      ملاحظة: ضبط حجم الغشاء وفقا لحجم اللوحة إذا لزم الأمر.
    9. انتشر بسرعة الغشاء الطابق السفلي مع طرف ماصة حيث أن الغشاء الطابق السفلي ويشكل طبقة رقيقة على الجزء السفلي من البئر. ضع اللوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة مدة 30 دقيقة للسماح بلمرة الغشاء الطابق السفلي.
      ملاحظة: سوف لا نعلق الأقبية إذا لم يكن الغشاء طبقة رقيقة أو إذا كان الغشاء يحتوي على فقاعات الهواء.
    10. وبعد 15 دقيقة على شاكر، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر. تجاهل في التدفق من خلال.
    11. إضافة 30 مل خلية تعطيل وسائط #2 إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. إزالة الأنسجة من مصفاة وإضافة إلى الأنبوب.
    12. تعيين الأنبوب دلو الجليد وتحرض بلطف على شاكر على أقل سرعة لمدة 15 دقيقة.
    13. وبعد 15 دقيقة على شاكر، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر. الحفاظ على التدفق من خلال في هذه الخطوة، في حالة منخفضة الغلة في خطوات لاحقة.
      ملاحظة: يجب أن تظل جميع التدفق عبر أنابيب على الجليد.
    14. إضافة 15 مل دميم مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر ولام الجلوتامين إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. إزالة الأنسجة من مصفاة وإضافة إلى الأنبوب. قوة هزة الأنبوبة باليد لتصفية س. 10 من خلال مصفاة 100 ميكرومتر وجمع التدفق من خلال. كرر حتى يتضمن التدفق من خلال لا الجسيمات.
    15. في هود، تصفية التدفق من خلال من الخطوة السابقة في أنبوب مخروطي 50 مل جديدة باستخدام 70 ميكرومتر مصافي للأنسجة الماوس أو 100 ميكرومتر مصافي للأنسجة البشرية.
      ملاحظة: مصافي إضافية على أهبة الاستعداد، وصب ببطء كما سوف تسد مصافي بالحطام.
    16. الطرد المركزي الأنبوب في ز 200 x دقيقة 8 في 4 درجات مئوية والمكان مباشرة دلو الجليد في غطاء محرك السيارة. إزالة المادة طافية ماصة دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه مع إجمالي المبلغ المطلوب من "وسائل الإعلام ثقافة سرداب دون عوامل النمو".
      ملاحظة: أقبية المخصب هي طبقة 'الرملية' بيليه. يتطلب كل 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب دون عوامل النمو".
  3. إنشاء انتيرويدس
    1. لوحة الخليط سرداب وسائل الإعلام مباشرة على الغشاء السفلي.
    2. راجع الأقبية مجهر لضمان عزل العملية كانت ناجحة.
      ملاحظة: خلايا وكرات من الخلايا المرغوب فيها. يتم مطلي الأقبية الفردية حوالي 100 كل بئر.
    3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 3 السماح الأقبية على التمسك بالغشاء الطابق السفلي.
      ملاحظة: هذا الاحتضان مع "وسائل الإعلام ثقافة سرداب دون عوامل النمو".
    4. ببطء قم بإزالة وسائط الإعلام والاقبية الزائدة التي فشل في إرفاق باستخدام ماصة P-200.
      ملاحظة: عدم الإزعاج في الغشاء كما يمكن أن تصبح فكها الأقبية المرفقة.
    5. إضافة 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب مع عوامل النمو" ببطء لكل بئر.
      ملاحظة: 24-، لوحات 48، حسنا، أو دائرة الشرائح، 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب مع عوامل النمو" غير كافية.
    6. استبدال وسائط الإعلام كل يومين مع الطازجة "سرداب وسائط الثقافة مع عوامل النمو" لمدة 5 أيام قبل العلاجات للسماح لمرفق الأمثل وتحقيق النمو.

2. الماوس جمع حليب الثدي

  1. فصل سد C57BL/6J المرضعات بعد الولادة 7-12 يوما من الجراء لها ح 6 قبل الحلب.
  2. تخدير السد المرضعات مع إيسوفلوراني عن طريق مخروط الآنف وإدارتها حقن تحت الجلد من الاوكسيتوسين في 0.15 وحدة دولية/كغ من وزن الجسم. انتظر 3 دقائق قبل محاولة حلب الداخلي.
  3. تنظيف قناني مع الإيثانول 70% قبل الحلب الداخلي واسمحوا جافة.
  4. استخراج الحليب من قناني واحد في وقت واحد باستخدام مضخة الثدي البشري كهربائية بأنابيب سيليكون الحجم لتناسب قناني الماوس إلى أنبوب جمع 5 مل.
    ملاحظة: قد مضخات الثدي الأمثل إعدادات اثنين، أحدهما للسرعة وواحد لشفط. فمن الأفضل أن تبدأ مع الإعدادات الأدنى لكل وزيادة سواء ببطء حتى يتم استخراج الحليب. ومن الناحية المثالية، سوف يكون العائد الإجمالي ~ 500 ميليلتر-1 مل حليب الثدي الماوس كل المرضعات السد.
  5. حليب الثدي فورا اليكووت ومخزن في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب تجميد/ذوبان دورات.
  6. علاج انتيرويدس في يوم 5 مع 50 ميليلتر/ملليلتر من حليب الثدي الماوس كل مل "سرداب الثقافة الإعلامية" مع عوامل النمو عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

3-أسرة جبل تلطيخ من انتيرويدس

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد برنامج تلفزيوني 1 x 16 مل كل 8 آبار.
    2. إعداد 2 مل 4% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني x 1 الواحدة 8 آبار.
    3. إعداد 2 مل 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x الواحدة 8 آبار.
    4. إعداد مل 24 توين PBS (ببست هو 0.1% توين 20 س 1 في برنامج تلفزيوني) كل 8 آبار.
    5. إعداد 2 مل 10% حمار عادي المصل (NDS) في 0.1% ببست (10% NDS/ببست) كل 8 آبار.
    6. إعداد مل 4 1% NDS في 0.1% ببست (1% NDS/ببست) كل 8 آبار.
  2. تلوين يوم 1
    1. نضح إيقاف العلاجات وتغسل انتيرويدس مع برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميليلتر 4% منهاج العمل كل بئر. مكان في الدوار ح 1-2 في 4 درجات مئوية. إزالة 4% منهاج عمل بيجين مع ماصة.
    2. أغسل 4 مرات مع 250 ميليلتر/البئر 1 × برنامج تلفزيوني. مكان في الدوار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: من الممكن تخزين اللوحة لمدة 1-2 يوما في 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر.
    3. إضافة 250 ميليلتر/بئر 0.1% X-100 تريتون. احتضانها ح 1 في إزالة الرايت 0.1% X-100 تريتون مع ماصة.
    4. أغسل 4 مرات مع 250 ميليلتر/البئر 1 × برنامج تلفزيوني. مكان في الدوار لمدة 15 دقيقة في الرايت
    5. إضافة 250% 10 ميليلتر/بئر NDS/ببست. احتضان لمدة 45 دقيقة في إزالة الرايت 10% NDS/ببست مع ماصة.
    6. إضافة جسم ميليلتر/البئر الرئيسي 250، 1/250 المخفف في 1% NDS/ببست، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: إضعاف جسم الأمثل يختلف وفقا للشركة المصنعة.
  3. تلوين يوم 2
    1. غسل 5 مرات على الأقل لمدة 4-5 ح مع 250 ميليلتر/بئر ببست. ضع على محور دوار الساعة 4 درجات مئوية بين كل غسل.
    2. إضافة الأجسام المضادة الثانوية ميليلتر/بئر 250، 1/1,000 المخفف في 1% NDS/ببست. التفاف اللوحة في إحباط واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. تلوين يوم 3
    1. إضافة 250 ميليلتر/بئر النووية وصمة عار 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: الاحتفاظ اللوحة في الظلام.
    2. أغسل 6 مرات مع 250 ميليلتر/بئر ببست. مكان في الدوار لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بين كل غسل.
    3. جبل ساترة في دائرة الشريحة مع تركيب وسائط.
    4. التقاط صور مع 40 × مجهر [كنفوكل] موضوعية وتقديم المثل في محرر رسومات نقطية (انظر الجدول للمواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سعينا أولاً للتحقيق عما إذا كانت أعربت عن لبن الثدي البشري أو لبن الثدي من معط المبستر أثرا في انتيرويدس الأمعاء الصغيرة. وفي الواقع، حليب الأم ولبن الأم المانحة زيادة نمو الماوس الولدان (الشكل 1A) والسابق لأوانه المشتقة البشرية انتيرويدس (الشكل 1B).

منذ لبن الثدي البشري زيادة نمو انتيرويدس المعوية صغيرة، نحن التحقيق التالية إذا كان حليب الثدي أثرا في انتشار انتيرويدس ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ظهارة الأمعاء تتكون من العديد من الأنواع الفرعية الخلوية التي هي مسؤولة عن توفير الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض والمحافظة على سلامة جدار الأمعاء، ويمكن أن تكون خرقت في الآلية المرضية للعديد من الأمراض. بينما نماذج حيوانية ويمكن إيجاز بعض جوانب هذا المرض، النموذج السابقين فيفو انتيرويدس المستمدة من الأمعاء الدقيقة للفئران والبشر منبرا لاختبار تأثيرات العلاجات المختلفة. أهمية طراز انتيرويد يسمح للباحثين الثقافة، والتفريق بين الخلايا الجذعية المعوية في جميع أنواع فرعية الخلايا الظهارية من السذاجة أو الحيوانات المر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد الكتاب شيئا للكشف ولا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

مغ معتمد من قبل منح K08DK101608 و R03DK111473 من مستشفى المعاهد الوطنية للصحة وآذار/مارس من الدايمات مؤسسة منحة رقم 5-FY17-79، جامعة "معهد واشنطن اكتشاف" الأطفال والأطفال سانت لويس، وإدارة طب الأطفال في جامعة واشنطن مدرسة الطب، سانت لويس. كجل معتمد من قبل R01DK104946 (PI: سيلفرمان)، مستشفى سانت لويس للأطفال وجامعة "معهد واشنطن اكتشاف" الأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-GlutamineLonza12-604F
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Gibco26140-079
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Humulin N (الأنسولين)Eli Lilly and Company0002-8315
1x Dulbecco's Dulbecco's Frozen Bubble-Fusioned Spice ( DPBS)سيجما ألدريتشD8537
جينتاميسينجيبكو15750-060
أمفوتريسين بجيبكو15290-026
0.5 م حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، درجة الحموضة 8.0Invitrogen15575-020
1x Advanced DMEM / F-12Invitrogen12634-028
200 ملي مولار L-GlutamineGibco25030-081
1 م N-2-هيدروكسي إيثيل بيبرازين-N-2-حمض السلفونيك الإيثان (HEPES)سيجما-ألدريتشH3537
N-أسيتيل سيستينسيجما-ألدريتشA9165
100x N-2 مكملغذائي جيبكو17502-048
50x B-27 مطروحا منه فيتامين أجيبكو08-0085SA
100x مثبط الصخور Y-27632 ، ثنائي هيدروكلوريدSigma-AldrichY0503
ماوس مؤتلف Wnt3a بروتينR & D Systems1324-WN
Murine NogginPeproTech250-38
ماوس مؤتلف R-Spondin 1R & D Systems3474-RS
عامل نمو البشرة المؤتلف للفأر (EGF)PeproTech315-09
عامل نمو Matrigel مخفضة مصفوفة الغشاء القاعديCorning356231
35 × 10 مم طبق بتري لزراعة الخليةEppendorf0030700112
24 بئرا لوحة ثقافة الخلاياEppendorf0030722116
خلية 48 بئر لوحة الثقافةEppendorf0030723112
8 آبار Nunc Lab-Tek II نظام شرائح الغرفةالحرارية العلمية154534
50 مل أنبوب مخروطيCorning352070
100 & مصفاة الخلايا المعقمةM فيشر العلمية22-363-549
70 & مصفاة الخلايا المعقمة Mفيشر Scientific22-363-548
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.2Invitrogen20012-027
16٪ بارافورمالدهيد (PFA)علوم المجهر الإلكتروني15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
حمار عادي مصل (NDS)سيجما ألدريتشD9663
4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)InvitrogenD1306
غطاء مجهرزجاج فيشر علمي12-544-D
مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 XLeica MicrosystemsN / A
Photoshop CS6Adobe SystemsN / A
18 G 1.5 بوصة إبرةبيكتون ديكنسون305196
إيزوفلورانسيجما ألدريتش792632
أوكسيتوسينسيجما-ألدريتشO3251
مضخة الثدي الكهربائية المزدوجةلانسينوه044677530163
5 مل أنبوب اختبار القاعالمستدير كورنينج352058
سدادات مطاطيةفري 560761 العلمي
Ki67 الأجسام المضادةAbcamAB15580
الإنسان Mki67 التمهيدي F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGGAAAG-3'تقنياتالحمض النووي المتكاملةN / A

المراجع

  1. Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
  2. Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
  3. Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
  4. Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
  5. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
  6. Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
  7. Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
  8. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  9. Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
  10. Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
  11. Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
  12. Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  13. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  14. Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
  15. Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
  16. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  17. Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
  18. Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
  19. Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
  20. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  21. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
  24. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  25. Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
  26. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.