Method Article

ربط القناة الصفراوية الجزئي في الماوس: نموذج الخاضعة لركود صفراوي معرقلة مترجمة

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، ربط القناة الصفراوية الجزئي كنموذج جراحية لإصابة الكبد والتجدد في القوارض.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القوارض، ربط القناة الصفراوية كاملة (كبدل) من القناة الصفراوية المشتركة أسلوب جراحية المتبعة لدراسة انتشار ركود صفراوي والقناة الصفراوية معرقلة. بيد أن التجارب الطويلة الأجل يمكن أن يؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات. في الماوس تحديد سلالات مع مرض الكبد الكامنة، يمكن إجراء مقارنات مفيدة حتى مع ربط فلقة واحدة من الكبد، والتي يمكن أن تقلل من الخسائر الحيوانية والنفقات. هنا، نحن تصف ربط القناة الصفراوية الجزئي (ببدل) في الماوس، والتي هي متصلة فقط القناة الصفراوية الكبدية اليسرى، مما تسبب في عرقلة الصفراوية في الفص الأيسر ولكن ليس الفصوص المتبقية. مع تقنية microsurgical حذراً، يمكن أن ببدل تجارب فعالة من حيث التكلفة، منذ الفص أونليجاتيد بمثابة رقابة داخلية على الفصوص الواصلة، عندما تعرض لنفس الظروف في نفس الحيوان. وخلافا كبدل، مجموعة مراقبة مستقلة تعمل بالشام غير ضروري. ببدل مفيد للغاية لمقارنة مباشرة مترجمة مقابل التأثيرات المنتظمة لركود صفراوي وغيرها من مكونات الصفراء المحتفظ بها. يمكن أيضا أن تكون أغراض أخرى ببدل كطريقة جديدة للتحقيق في الآليات المتعلقة بالأدوية والهجرة الخلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد استخدمت نماذج الجراحية لإصابة الكبد الحاد وإصلاحها، مثل ظهرت جزئية أو ربط القناة الصفراوية المشتركة (كبدل)، على مدى عقود في القوارض لدراسة تجديد الكبد وبل1،2. في كبدل، هو متصلة القناة الصفراوية المشتركة (التي تستنزف جميع الصفراوية تنتج في الكبد)، أسفر عن ركود صفراوي انسداد الشعب الهوائية والتهاب وتليف في أول 2-3 أسابيع بعد الجراحة، ومع التقدم في نهاية المطاف لتليف الكبد3. انتشار القناة الصفراوية، ترانسديفيرينتييشن، وتحريض الخلايا السلف الكبد المقيم أيضا ملامح كبدل4،5. على الرغم من أن التعريف كبدل آليات محددة للانسداد تشولانجيوباثي، وتتسم جيدا مع النتائج استنساخه في الفئران البرية من نوع وهذه السلالات مع كبد عادي6،،من78، الإجراء يمكن أن يطالب من الناحية الفنية في بعض نماذج الماوس المحورة وراثيا من أمراض الكبد، تتطلب الحيوانات أكثر مما كان متوقعا بسبب ارتفاع المراضة والوفيات من انسداد مراري مع مرور الوقت. هذا الأسلوب أيضا مفيدة لدراسة المرض الفئران المحورة وراثيا مع الكامنة في الكبد، الذي قد لا تتسامح مع خلاف ذلك الإجهاد من فترات طويلة من الوقت بالطبع تجارب عقب كبدل.

ببدل يمكن أن توفر بديلاً معقولاً للمساعدة في التغلب على بعض هذه التحديات. الدراسات الأولية ببدل في الفئران البرية من نوع تهدف إلى التمييز بين الوسطاء بالنيابة محلياً والجهازية لالتهاب9. في ببدل، هو تصور التقاء الصفراوية الرئيسية من اليمين واليسار الكبدية الصفراوية أعلاه القناة الصفراوية المشتركة بعناية على هيلم، وهي متصلة فقط القناة الصفراوية الكبدية اليسرى لتوليد ركود صفراوي معرقلة مترجمة. ببدل يوفر العديد من المزايا كبدل. في ببدل، أونليجاتيد الفص الأيمن بمثابة رقابة داخلية مطابقة مطابق تماما للفص الأيسر الواصلة، تعرض لنفس التأثيرات الجهازية، مثل الحالة التغذوية أو تعميم العوامل. على الرغم من أن الوسطاء المحترفين التهاب النظامية كانوا حاضرين، أوساوا et al. لاحظ التليف ونخر في الفصوص أونليجاتيد أقل، ولكن زيادة الخلايا التحريضية، وتحويل التعبير β عامل النمو في الفص الواصلة9.

في الآونة الأخيرة، تم إعادة تعريف ببدل لدراسة آثار متني الكبد من الصفراء المحتفظ بها10. باستخدام نفس الحيوان للمراقبة الداخلية (أونليجاتيد "صورية") والمجموعات التجريبية، نصفين ببدل فعالية عدد الحيوانات اللازمة للتجربة، والتي بدورها أكثر فعالية من حيث التكلفة. الفئران تحمل آثار ببدل أفضل بكثير، حيث الوقت المثالي بالطبع تجربة (إيه تو أسابيع) يمكن أن يتحقق في الفص الواصلة. الأهم من ذلك، يمكن التمييز بين الآثار المباشرة أحياناً من ركود صفراوي انسداد الشعب الهوائية ببدل والاحتفاظ بمكونات الصفراء في الفص الواصلة، مقارنة بالفص التحكم أونليجاتيد. عموما، ببدل وسيلة جذابة لدراسة الآثار الخاصة بفلقة من ركود صفراوي المترجمة في الكبد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة بيتسبرغ.

1. الأساسية تقنيات وإجراءات مشتركة

  1. اﻷوتوكﻻف جميع المعدات ميكروسورجيكال قبل الاستخدام.
  2. لتجنب قتل الفأرة بالتخدير، تحقق لها نمط التنفس بعناية.
  3. أجهزة تعمل باللمس والأمعاء أقل قدر ممكن لتجنب إتلاف الأجهزة وتسبب النزيف. الصحافة نزيف النقاط مع مسحات القطن الرطب أو الأسفنج الشاش.
  4. استخدام مسحات القطن الرطب للطيف التلاعب بالأجهزة. تستخدم الأسفنج الشاش الرطب، غير منسوجة بحجمين، 3.5 × 3.5 سم و 6.0 × 6.0 سم. استخدم أصغر واحد على التراجع عن الكبد كله. استخدام واحد أكبر التفاف الأمعاء الصغيرة والكبيرة.

2-إعداد بريسورجيكال

  1. استخدام الفئران الذكور c57/b6، 8-12 أسبوعا عمر (عندما يكون وزن الجسم حوالي 20-35 غ) لربط جزئي القناة الصفراوية.
  2. السماح بحرية الوصول إلى الماء والغذاء الفئران حتى تحريض التخدير.

3-الجزئية القناة الصفراوية ربط العملية

  1. تخدير الماوس عن طريق وضع الحيوان في دائرة للاستقراء مع مزيج أكسجين 1.5-2.0% إيسوفلوراني و 1 لتر في الدقيقة. مراقبة الحيوان بعناية عن طريق مراقبة معدل التنفس. عندما يكون معدل التنفس للحيوان نفسا واحدة في الثانية الواحدة، يكون الماوس أنيسثيتيزيد جيدا. حيث يختفي منعكس انسحاب الجبهة من أطرافهم أكثر سرعة، قرصه أطرافهم هند سيرا على الأقدام، وكذلك لتأكيد غياب منعكس الانسحاب الكامل. وينبغي أن مشحم العيون مع وكيل التشحيم العيون لمنع قرحة القرنية. علما أن الجرعة الأولى من مسكن يمكن أن تعطي بريوبيراتيفيلي لمنع تنشيط مستقبلات الألم.
  2. يحلق جدار البطن مع مقص الشعر، ووضع الماوس على طاولة العمليات الجراحية تحت المجهر الجراحي. إصلاح جميع الأطراف إلى طاولة المفاوضات مع الشريط. استخدم الاستنشاق isoflurane للاحتفاظ بالماوس تحت التخدير العام.
    1. ضبط المبخر isoflurane واستخدام isoflurane 2.0-3.0% للاستقراء.
  3. استخدام مسحات معقمة، تطهير جدار البطن أولاً مع 0.3-0.5 مل بوفيدون يطبق موضعياً، تليها إيثانول 70%. ينبغي أن تغطي الحيوان مع ثني عقيمة.
  4. جعل شق البطن خط الوسط طويلة من الرهابه إلى العانة باستخدام مقص وملقط أدزون. وبعد إجراء شق البطن، تقليل isoflurane إلى 0.8-1.0% للصيانة.
  5. كشف تجويف البطن باستخدام الصغرى-ضام. اضغط الرهابه مع الملقط البعوض والتراجع عن اتجاه رأس الماوس. إصلاح الملقط البعوض في مكان استخدام الطين الناعمة.
  6. 1-2 مل من حرارة (37 درجة مئوية) غرس المالحة مخزنة الفوسفات معقمة (PBS) في تجويف البطن لتجنب إصابة أجهزة البطن. عقد الأمعاء الصغيرة مع مسحات القطن الرطب وسحب منهم بلطف نحو رأس الماوس. قص الأربطة بين الأمعاء الصغيرة وريتروبيريتونيوم لتجنب إصابة الأمعاء الصغيرة (الشكل 1A).
  7. التفاف الأمعاء الصغيرة والكبيرة مع الأسفنج شاش الرطب، غير المنسوجة. وضعها الجانب والذيلية تجويف البطن. يمكن أن توضع الأمعاء ملفوفة في شاش معقم في ميدان رايات العقيمة لتجنب التلوث.
  8. بلطف سحب الكبد كله تجاه الرهابه باستخدام اسفنجة صغيرة رطبة من شاش منسوج لكشف هيلم الكبدي والرباط الكبدية الإثناعشرية (الشكل 1B).
  9. تحقق للتأكد من تشريح هيلم كبدي. القناة الصفراوية المشتركة يقع على الجانب البطني من الوريد البابي. تأكيد مواقع الحق والقناة الصفراوية الكبدية اليسرى، التي تصب في التقاء الصفراوية الرئيسية في هيلم الكبد.
  10. تحديد القناة الصفراوية الكبدية اليسرى التي تستنزف الفص الأيسر، وتطويق أنه مع خياطة نايلون 10-0 استخدام الجانب كليلة إبرة خياطة (الشكل 2A). تجنب إصابة الوريد البابي والشريان الكبدي، وسطح الكبد.
  11. سد القناة الصفراوية الأيسر مع النايلون 10-0. (الشكل 2).
  12. ضع الأمعاء الصغيرة والكبيرة في نفس الموقف قبل العملية باستخدام مسحات القطن الرطب.
  13. تأكيد لا يوجد التواء الأمعاء ونزيف داخل البطن، ثم أغلق في العضلات والجلد في طبقتين مع فيكريل 4-0. خياطة مجدول (فيكريل) كان يستخدم لإغلاق الجلد، ولكن شعيرات هو المفضل لتقليل احتمالات الإصابة.
    ملاحظة: اللفافة بخياطة المستمر من الرهابه إلى العانة أغلق، والجلد بخياطة المستمر من العانة إلى الرهابه.
  14. إيقاف التخدير بعد إغلاق الشق.

4-بعد العملية الجراحية العلاج والمتابعة

  1. بعد الجراحة، قرصه الجلد الظهرية الماوس فقط وحقن بوبرينيكس (0.1 مغ/كغ) وسيفازولين (100 مغ/كغ) تحت الجلد، يليه حقن بوبرينيكس كل ح 12 لمدة 3 أيام، وسيفازولين كل 24 ساعة لمدة 3 أيام على التوالي11،12 ،13. علما أن الجرعة الأولى من مسكن يمكن أن تعطي بريوبيراتيفيلي لمنع تنشيط مستقبلات الألم. سيفازولين والمضادات الحيوية المحيطة التعاونية الأخرى ضرورية فقط للحيوانات التي قمعت المناعي، مثل تلك التي استخدمت في دراسات الزرع.
    ملاحظة: إذا كان يتم إجراء الجراحة بنجاح، الماوس عادة يتعافى داخل 30 دقيقة سوف يكون نشاط الفئران تقريبا نفس الشرط قبل الجراحة.
  2. تحقق من الفئران يوميا بحثاً عن أي علامات الشدة.
    1. التضحية الفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العام لشراء كبد وعينات الأنسجة الأخرى عند نقطة زمنية محددة (أي، 7، 14، 21 يوما) بعد ببدل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجرى ببدل لهذه التجربة النموذجية، في PiZ ثلاث الفئران المعدلة وراثيا، التي الخص أمراض الكبد البشري وجدت في عوز ألفا-1 antitrypsin (A1AT). أوفيريكسبريسيس الماوس PiZ التحوير يتألف من عدة أجزاء الجينوم الحمض النووي التي تحتوي على مناطق الترميز متحولة الجينات البشرية A1AT والمروج، جنبا إلى جنب مع إينترونس وكيلوبس ~ 2 من المنبع والمصب المرافقة المناطق14، 15. A1AT عادي بروتين مصل يفرز المنتجة في الكبد. شكل المسخ A1AT يولد المجاميع برو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن كبدل هو الأسلوب التجريبية الأكثر شيوعاً لانسداد ركود صفراوي، فإنه يمكن أن يقدم تحديات متعددة في القوارض. اعتماداً على عدد الأيام بعد العمليات الجراحية المطلوبة لتحقيق نقطة نهاية، يمكن تجربة الحيوانات الكبيرة في معدلات الاعتلال والوفيات مع مرور الوقت. ويتفاقم درجة إصابة الأنسجة ونخر الصفراوية عند العمل مع بعض نماذج الماوس المحورة وراثيا لمرض الكبد، التي تبين لحمه الكبد غير طبيعي والدالة عند خط الأساس. بالمقارنة مع كبدل، تقارير ببدل محدودة، ولكن يمكن تطبيق هذا الأسلوب كبديل في تجارب مختارة للحد من النتائج ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب قد لا الكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتسلم الدكتور خان منحة الدعم من المعاهد الوطنية للصحة/NICHD K12HD052892 ومؤسسة ألفا-1، مؤسسة هيلمان، ومركز أبحاث الكبد بيتسبرغ. الدكتور ميكالوبولوس تسلم منحة الدعم من المعاهد الوطنية للصحة/نيدك P01DK096990. ونحن نقدر المساعدة التقنية الممتازة وكرم أور Anne. ونحن ممتنون أيضا للدكتور ديفيد ألف غيلر لتوفير الوصول إلى مختبر زراعة/القوارض "الجراحة الدقيقة".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجهر-لايكا البرية M650 ، 6 & ndash ؛ 40 ومرة ؛ التكبيرLeica Microsystemsn / a
Tec 3 isoflurane قمع ملء المرذاذالتخدير العامةn / a
Stevens Tenotomy مقصدقيق جراحي & شركة الأدوات العلميةASSI.9193
ملقط Adsonأدوات العلوم الدقيقة11006-12
ملقط مرقئ رقيق كلاسيكي للبعوضCodman30-4472
ضام صغيرموردوك ؛ Roboz Surgical InstrumentRS-6550
إسفنج شاش غير منسوجFisherband870-PC-DBL
Puritan 6 " مسحة قطنية صغيرة بمقبض خشبيشركة المنتجات الطبية البيوريتانية868-WCS
ملقط دومون SS - نصائح قياسية / مستقيمة / إينوكس / 13.5 سمأدوات العلوم الدقيقة11203-23
ملقط دومون SS - نصائح قياسية / بزاوية 45 درجة ؛ / إينوكس / 13.5 سمأدوات العلوم الدقيقة11203-25
مقص زنبركي Vannas - أدواتالعلوم الدقيقة15000-00
حامل إبرة دقيقةAesculap الأدوات الجراحيةFD231R
Micro AROSuture ، خياطة نايلون معقمة 10-0 ، 70 & مايكرو ؛ م ، نقاط TAPAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5 مل حقنةBD309646
طبق زراعة أنسجة فالكون ، 60 مرة 15 ملمكورنينج353002
إيزوفلوران ، سائل فارماكوبيا الأمريكية (USP) للاستنشاق ، 250 ملPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
بوبرينكس عن طريق الحقن (بوبرينورفين هيدروكلوريد)ريكيت بينكيزر للمستحضرات الصيدلانيةNDC 12496-0757-1
سيفازولين للحقن ، USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
محلول فرك PVP (povidone – اليود 7.5٪)MedlineNDC 12496-0757-1
70٪ الإيثانولDecon Labs2716
محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون كالسيوم أو مغنيسيومLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
هيماتولوكسيلينفيشر (ريتشارد آلان العلمي)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
الفورمالينفيشرSF100-20
خدمات 3 مم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  2. Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
  3. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  4. Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
  5. Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  6. Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
  7. Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
  8. Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438(2015).
  9. Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
  10. Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
  11. Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378(1973).
  12. Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
  13. Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
  14. Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
  15. Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
  16. Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
  17. Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
  18. Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
  19. Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
  20. Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. Madame Curie Bioscience Database. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2013).
  21. Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
  22. Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874(2017).
  23. Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
  24. Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
  25. Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Partial Bile Duct LigationBile Duct LigationObstructive CholestasisHepatic Bile DuctLiver RegenerationSurgical TechniqueMouse ModelLiver InjuryBile Duct ProliferationLocalized Obstruction

Related Articles