عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

Ariel Finkielsztein; Lorraine Mascarenhas; Veronika Butin-Israeli; Ronen Sumagin

doi:10.3791/56949

مقالة منهجية

عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

DOI:

10.3791/56949

⸱

مارس 2, 2018

Ariel Finkielsztein¹ , Lorraine Mascarenhas¹ , Veronika Butin-Israeli¹ , Ronen Sumagin¹

¹Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات جديدة ويرد هنا لعزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من الإنسان والفأر العَدلات. استخدام هذه البروتوكولات تنبيذ فائق، والتدفق الخلوي والتقنيات إيمونوبلوتينج لتحليل محتوى يمثل، ويمكن استخدامها لدراسة دور المجهرية الدقيقة المستمدة من مختلف أنواع الخلايا في وظيفة الخلوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهرية الدقيقة النوى المستمدة من العَدلات (المجنحة)-MPs) الدهن بلير، ميكروفيسيكليس كروية بأحجام تتراوح بين 50 – 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر. نحو النواب الناشئة حديثا، وجزءاً هاما من خلية إلى خلية الاتصال وإرسال الإشارات إليه. بسبب حجمها وطبيعة الإفراج عنهم، تم إغفال وجود النائب حتى وقت قريب. ومع ذلك، مع تحسين التكنولوجيا والأساليب التحليلية الآن يبرز وظيفتها في الصحة والمرض. هي البروتوكولات المقدمة هنا تهدف إلى عزل ووصف النواب المجنحة التدفق الخلوي وإيمونوبلوتينج. وعلاوة على ذلك، يتم إعطاء أمثلة عدة على التنفيذ. هذه البروتوكولات لعزل النائب سريعة ومنخفضة التكلفة، ولا تتطلب استخدام معدات باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، أنها تسمح لتسمية أعضاء البرلمان بعد العزلة، فضلا عن وضع العلامات مسبقاً من الخلايا المصدر قبل الإفراج عن النائب، استخدام صبغة فلورسنت الخاصة بغشاء للتصور والتحليل عن طريق التدفق الخلوي. ومع ذلك، قد هذه الطرق، العديد من القيود بما في ذلك النقاء بمنس وأعضاء البرلمان والحاجة إلى الأدوات التحليلية المتطورة. Cytometer تدفق الراقية مطلوب لتحليل MPs موثوق بها والتقليل من قراءة إيجابية كاذبة بسبب الضوضاء أو السيارات-الأسفار. البروتوكولات وصف يمكن استخدامها لعزل وتعريف النائب نشوء حيوي، وتميز علامات والاختلاف في تكوين ظروف محفزة مختلفة. تباين حجم يمكن استغلالها للتحقيق في ما إذا كان محتوى جزيئات الغشاء مقابل اكسوسوميس مختلفة، وما إذا كان أنها تفي بأدوار مختلفة في الأنسجة التوازن. وأخيراً، يمكن استكشاف عزل وتوصيف لأعضاء البرلمان، ووظيفتها في الاستجابات الخلوية ونماذج مختلفة من المرض (بما في ذلك، اضطرابات الالتهابات المرتبطة المجنحة، مثل أمراض الأمعاء الملتهبة أو إصابة الرئة الحاد) التالية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة، أصبحت "المجهرية الدقيقة/ميكروفيسيكليس" مصدرها سيتوسول الخلية أو غشاء البلازما ذات أهمية علمية كبيرة، كما تشير البيانات الناشئة أن هذه الهياكل، وتتراوح بين 50-1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في القطر، ويمكن أن تحمل المعلومات البيولوجية و بمثابة وسيلة غير مقبول للاتصالات الخلوية. المناعية الخلية المستمدة من أعضاء البرلمان، ولا سيما تلك التي تنتجها العَدلات النوى (بمنس) ذات أهمية كبيرة نظراً للدور الهام بمنس في المضيف الدفاع¹^،²، الردود الملتهبة³، والتئام الجروح ⁴-الفضول، حتى الآن، أظهرت تقارير عديدة وظائف كل برو-التهابات والالتهابات من النواب المجنحة⁵، مما يوحي سياق المحتملة-والمرض-والأنواع-والدور الخاصة بالجهاز من أعضاء البرلمان.

توفر البروتوكولات الموصوفة في هذه الاتصالات وسيلة فعالة من حيث التكلفة ومبتكرة وقابلة للتكيف لدراسة وظيفة البرلمان في الصحة والمرض. وتنطبق على العديد من الكائنات النموذجي، والأجهزة، وشروط التحفيز. أنها تسمح للتعرف على أنواع عدة من أعضاء البرلمان، ويمكن استخدامها في المستقبل للتصدي لمهامها برو-التهابات والالتهابات. على سبيل مثال، وصف هنا كيف يمكن لدراسة وظيفة MPs المجنحة في الجرح الظهارية الشفاء في المختبر و في فيفو. البروتوكول المقدم لعزل الماوس بمنس المشتقة من نخاع العظم تم تكييفها مع بعض التعديلات من أسلوب هو موضح سابقا⁶.

وعلاوة على ذلك، تسمح البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة لكشف وتوصيف علامات محددة التي يمكن العثور على أعضاء البرلمان المجنحة بطريقتين تكمل: الغربية لطخة والتدفق الخلوي. ونجد أن إيمونوبلوتينج من أعضاء البرلمان باستخدام البروتوكولات القياسية⁵ سهلة ويمكن الاعتماد عليها، إلا أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في حساسية أدوات قياس التدفق، ونسبة الضجيج إلى إشارة أفضل تسمح الآن لمزيد من التحليل لأعضاء البرلمان باستخدام هذا الأسلوب. تتضمن البروتوكولات الموصوفة في هذه الدراسة التطورات الأخيرة والتوصيات من المقالات والبحوث الأصلية، بما في ذلك إدخال تعديلات على سرعة الطرد المركزي، والوقت، إضافة نموذج التصفية وتجميد/تخزين شروط⁷ ^, ⁸، وكيفية الحد من "ضجيج الخلفية"، وتحسين حد الكشف لأعضاء البرلمان المجنحة، وتميز بين الأحجام المختلفة لأعضاء البرلمان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأقر جميع أعمال الحيوان IACUC شمال غرب البلاد. وأنجزت جميع التجارب وفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة. للبشر التبرع بالدم، قدمت موافقة واعية ووقعت؛ وباﻹضافة إلى ذلك، تعامل جميع البشر في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية والمؤسسية لرفاهية الإنسان.

ملاحظة: يتم سرد الخطوات البروتوكول تحت الأقسام الفرعية التالية: (ط) "عزل خلية نخاع العظم الماوس"؛ (ثانيا) المجنحة "العزلة" من نخاع العظام مورين؛ (ثالثا) المجنحة "في معزل" عن "الدم البشري"؛ (رابعا) النائب في معزل عن Supernatants المجنحة (بواسطة تنبيذ فائق)؛ (v) الوصف من أعضاء البرلمان من "النشاف الغربية"؛ (سادسا) وصف لأعضاء البرلمان بالتدفق الخلوي؛ (ثامنا) تطبيق MPs معزولة "الجرح شفاء الدراسة"

1-الماوس عزل خلية نخاع العظام

تشريح عظم الفخذ والساق من الخلفيتين الماوس
1. إعداد مربع القتل رحيم (مثلاً، شكل مربع تلميح فارغة 1 مل) لاستنشاق للتخدير. إضافة بضع قطرات من إيسوفلوراني 100% على قطعة قماش معقمة مسجلة إلى داخل غطاء علبة بلاستيكية. وفقا للمبادئ التوجيهية الجديدة في إياكوك، ينبغي أن لا تأتي في اتصال مباشر مع إيسوفلوراني الحيوانات، وبالتالي وضع حامل نصيحة بين الماوس والشاش الذي يحتوي على إيسوفلوراني.
  ملاحظة: إيسوفلوراني مخدر استنشاق قوية وينبغي التعامل معها بحذر شديد داخل غطاء دخان.
2. Euthanize الفئران وفقا للتوصية إياكوك. ضع ماوس داخل مربع القتل الرحيم الموصوفة في الخطوة 1 – 5 دقائق 1.1.1 حتى أنه قد توقف عن التنفس. التأكد من وفاة الحيوان بأداء اضطراب عنق الرحم.
3. رفع الجلد البطن باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ، 12 سم منحنى، ملاقط 0.17 ملم × 0.1 ملم وقطع الجلد في منتصف الطريق بين الأطراف العليا والسفلي. قشر الجلد من هنا إلى قسم آخر القاصي الماوس الجسم بما في ذلك السفلية. مع 10 سم طويل، مستقيم تشريح مقص، إزالة العضلات من الخلفيتين وانخلاع الورك المساس برأس عظم الفخذ.
4. استخدام مقص لتشريح العضلات من عظم الفخذ والساق وفصل عظم الفخذ من الساق. تأكد من نهايات العظام تبقى على حالها كما أنها تحتوي على كميات كبيرة من نخاع العظام.
5. إزالة جميع اللحم المتبقية قبل المتداول العظام داخل منشفة ورقية. ضع عظام نظيفة في طبق بتري يحتوي على "المتوسط" خالية من المصل (الإدارة المستدامة للغابات، أي، المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) دون المصل أو المضادات الحيوية).
6. شطف العظام في الإيثانول 70%، ومن ثم في الإدارة المستدامة للغابات.
7. إعداد 50 مل من الإدارة المستدامة للغابات في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تحميل 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في حقنه 10 مل وإرفاقه بإبرة قياس 25 و 5/8 بوصة.
8. تقليم نهاية العظام مع مقص حتى مرئياً افتتاحي لنخاع العظام (حمراء اللون).
9. مسح خلايا نخاع العظام في أنبوب 50 مل جديدة. استخدم حقنه 10 مل بإبرة قياس 26 و 5/8 بوصة مع حوالي 3 مل/العظام للإدارة المستدامة للغابات. عند الانتهاء من التنظيف، ريسوسبيند الخلايا في الأنبوب من بيبيتينج (استخدام المتاح 1 مل نصائح البلاستيك) لكسر المجاميع الخلية.

2-المجنحة في معزل عن مورين نخاع العظام

تحلل الخلايا الحمراء
1. بيليه نخاع العظام التي تم جمعها من سينتريفوجينج في 350 x ز لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل من 0.2% كلوريد الصوديوم لحوالي 20-30 ثانية في كسر كرات الدم الحمراء. لا تتجاوز 30 ثانية كهذا سيؤدي إلى تفسخ المجنحة. إضافة 20 مل من 1.6% كلوريد الصوديوم لاستعادة أوسمولاليتي.
  ملاحظة: قد تؤدي هذه الخطوة إلى تنشيط المجنحة القليل جداً.
3. تغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.1.1 أعلاه. إزالة المادة طافية.
4. المضي قدما لعزل بمنس بكثافة التدرج الطرد المركزي.
عزل العَدلات بكثافة التدرج الطرد المركزي
1. الحارة بوليسوكروسي والصوديوم دياتريزواتي الحلول، مع كثافة 1.119 غ/مل و 1.077 غ/مل (انظر الجدول للمواد)، إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
2. إعداد بوليسوكروسي والصوديوم دياتريزواتي تدرجات جديدة، مباشرة قبل تطبيق خلية نخاع العظام ببطء طبقات مل 3 من محلول كثافة 1.077 غ/مل أكثر من 3 مل حل الكثافة 1.119 غ/مل في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
  ملاحظة: سيؤدي إلى إعداد الحل التدرج بعيداً جداً في وقت مبكر في الخلط بين الطبقات ونقاء العَدلات الفقيرة والانتعاش.
3. ريسوسبيند بيليه خلية نخاع العظام في 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج وتراكب تعليق الخلية الناتجة على رأس دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم التدرج (ببطء، لتجنب الخلط بين الطبقات).
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 850 x ز عند 25 درجة مئوية في الرايت، دون الفرامل. الحفاظ الكواشف في RT للفصل الفعلي العَدلات من الخلايا الأخرى الموجودة في نخاع العظام. تعيين أجهزة الطرد المركزي في التباطؤ بطيء للسماح للتدرج شكلت كفاءة والحفاظ عليها بعد خطوة الطرد المركزي.
5. موقع بصريا طبقة خلايا وحيدات النوى في واجهة برنامج تلفزيوني وحل الكثافة 1.077 غ/مل (الطبقة العليا). إزالة هذه الطبقة وبقية الحل الكثافة دون إزعاج الفرقة المجنحة.
6. جمع طبقة المجنحة بأكملها وبعض بوليسوكروسي الأساسية والحل 1.119 غ/مل دياتريزواتي الصوديوم في 15 مل أنابيب استخدام ماصة نقل.
  ملاحظة: نقاء بمنس معزولة سيتوقف على إزالة كاملة من الطبقة العليا.
7. أعلى الأنابيب مع المصفاة PBS (التي تمت تصفيتها من خلال مرشح حجم مسام 0.1 ميكرومتر) وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
8. أغسل بمنس الأعلاف مع 2 مل من برنامج تلفزيوني استخدام شروط الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.2.7.
9. ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني تم تصفيتها وتعول بمنس معزولة من هيموسيتوميتير.
  ملاحظة: لاستخدام هذا الأسلوب في العزلة، نقاء المجنحة الناتجة عن المبالغ إلى ~ 85-90 في المائة، كما كان يقيمها التدفق الخلوي. تلوث الكسور الباقية يتكون أساسا من اللمفاويات وحيدات النوى.
التحفيز المجنحة للحث على الإفراج عن النائب
ملاحظة: يمكن حفز بمنس للإفراج عن أعضاء البرلمان باستخدام شروط تفعيل مختلف، بما في ذلك نفورميللميثيونيلليوسيللفينيلالانيني (فملف)، فوربول-12-ميريستاتي-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) أو الانترفيرون غاما (IFNγ). ومن المهم قبل المحاكاة، ينبغي إبقاء بمنس على الجليد في جميع الأوقات.
1. تصفية بمنس بيليه (300 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية) وريسوسبيند في 0.1 ميكرومتر "موازنة الملح" الحل (حبس) الحل هانك، التي تحتوي على عامل حفز للاختيار. للتحفيز الأمثل، واستخدام 100 ميليلتر التحفيز الحل الواحد بمنس 10 مليون لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنابيب 15 مل.
  ملاحظة: استخدمت تركيزات التالية لتفعيل بنجاح في أعمالنا السابقة: فملف (0.5-1 ميكرومتر للإنسان و 2-5 ميكرومتر للماوس بمنس)، سلطة النقد الفلسطينية (200 nM)، و IFNγ (100 نانوغرام/ملليلتر). إذا كان المطلوب هو إطلاق سراح أعضاء البرلمان السابق المسمى، احتضان بمنس unstimulated (1-5 × 10⁶) مع N-(2-aminoethyl) ماليميدي-فيتك (انظر الجدول للمواد) (1 ميكرومتر في 100 ميليلتر هبس، 15 دقيقة، 37 درجة مئوية). المضي قدما في خطوات 2.3.1-2.3.3.
2. تدور في 850 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية، لإزالة بمنس ونقل supernatants خالية من الخلية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة.
3. للنائب في معزل عن سوبيرناتانتس الخلية الحرة، تابع إلى الخطوة 4، 2.

3-المجنحة في معزل عن الدم البشري

تجنيد متطوعين صحية لاستخراج الدم وفقا للمبادئ التوجيهية "الاتحاد الدولي للرجبى المؤسسية".
1. جمع الدم من الساعد من متطوعة صحية في الأنابيب التي تحتوي على سترات الصوديوم مل 5 متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
2. "الماصة؛" 5 مل حل دياتريزواتي ديكستران والصوديوم (كثافة 1.113 g/mL، انظر الجدول للمواد) في أنابيب معقمة 15 مل وطبقة 5 مل دم المحيطي البشري طازجة معزولة على أعلى من ذلك ببطء.
3. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 50 دقيقة على 400 × ز في الرايت (25 درجة مئوية) مع تسارع منخفضة ولا الفرامل.
4. في نهاية الطرد المركزي، إزالة البلازما والخلايا وحيدات النوى (الطبقة العليا) باستخدام ماصة شفط بلاستيكية معقمة.
5. نقل الطبقة السفلي (بمنس) في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة.
6. إضافة وحدة تخزين تساوي 0.45% كلوريد الصوديوم إلى بمنس (المزيج جيدا و بلطف بتدوير الأنبوب).
7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 غرام x عند 25 درجة مئوية.
تحلل الخلايا الحمراء
1. إضافة 10 مل الماء المثلج، والعقيمة إلى خلايا الأعلاف ل 45 s متبوعاً 10 مل من المثلج العقيمة 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم لاستعادة أوسمولاليتي.
  ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية لعزل المجنحة على الجليد لتجنب التنشيط المجنحة والإفراج عن النائب السابق لأوانه. خطوة تحلل نفسها النتائج في تفعيل المجنحة ضئيلة ولكن مهمة لا، ومع ذلك، من الضروري لعزل سكان المجنحة نقية لفحوصات فنية.
2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة على 250 غرام x عند 4 درجة مئوية مع تباطؤ الناعمة.
3. كرر الخطوتين 3.2.1 و 3.2.2.
4. ريسوسبيند بمنس في 5 مل حبس المثلج دون الكالسيوم أو المغنيسيوم. حساب مجموع الخلايا الحية (استخدام هيموسيتوميتير وجدوى تلطيخ في تمييع 1:2، انظر الجدول للمواد) قبل التحفيز.
  ملاحظة: يجب استخدام بمنس معزولة للتحفيز أو تجارب أخرى ضمن ح 2 من العزلة لتجنب التغييرات الوظيفية والخلوية وموت الخلايا.

4-النائب في معزل عن المجنحة تنشيط Supernatants

ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول مماثل لعزل أعضاء البرلمان من بمنس مورين والبشرية.

بمنس بيليه (300 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية) وريسوسبيند في 0.1 ميكرومتر تصفية الحل حبس، التي تحتوي على عامل حفز لاختيار (على سبيل المثال 1 ميكرومتر فملف، انظر الحاشية: 2.3.1). التحفيز الأمثل استخدام 100 ميليلتر التحفيز الحل الواحد بمنس 10 مليون لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنابيب 15 مل.
وتدور أسفل بمنس المنشط في 600 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية التحفيز التالي، نقل supernatants خالية من الخلية إلى أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة.
الطرد المركزي المادة طافية مسح المجنحة في 13,000 س ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية إزالة الحطام الخلية ونقل المادة المطهرة طافية في أنبوب أولتراسينتريفوجي جديدة.
أجهزة الطرد المركزي ح 1 في 100,000 س ز، في 4 درجات مئوية. إزالة supernatants قبل تخزين MP. حسب الحاجة، مخزن القريبون من أعضاء البرلمان في البارافين مختومة أنابيب أولتراسينتريفوجي في-80 درجة مئوية حتى استخدامها في التجارب.

5-دراسة MPs المجنحة من النشاف الغربية

إضافة المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي 1% (50-200 ميليلتر مع الأس الهيدروجيني تريس 100 مم: 7.4) لأعضاء البرلمان بيليه (من الخطوة 4، 4)، نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة، وغلى ليسيد أعضاء البرلمان لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يجب تعديل عدد أعضاء البرلمان وحجم المخزن المؤقت لتحلل والأمثل للبروتين كل الاهتمام.
تحميل كميات متساوية من النواب المجنحة كل حارة في تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10% β-ميركابتو-الإيثانول.
ملاحظة: مع أسلوب لدينا نحن تحميل أعضاء البرلمان التي كانت معزولة من نفس العدد من حفز بمنس.
1. فصل ليساتيس من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على 10% بولياكريلاميدي هلام (استخدام V 50-100 ح 1-1.5) ونقل مجموع البروتينات على أغشية النيتروسليلوز ك وصف⁹.
كتلة الأغشية ح 1 مع الحليب غير الدسم 5% في المحلول الملحي مخزنة "تريس" توين-20 0.05%، واحتضان أنه مع ابتدائية مناسبة (بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية)، تليها الثانوية الأجسام المضادة مترافق برنامج الصحة الإنجابية.
تصور العصابات بإضافة الحل تشيمولومينيسسينسي للغشاء والتعرض الأشعة سينية فيلم داخل كاسيت واقية من الضوء (ح 1-24).

6-دراسة MPs المجنحة بالتدفق الخلوي

لتلوين الأجسام المضادة، تضعف الأجسام المضادة على النحو المناسب في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 0.1 مم يدتا، أزيد الصوديوم 0.1%). ريسوسبيند القريبون المجنحة-MPs (المستمدة من 1-3 × 10⁶ بمنس/شرط) في 100 حل جسم ميليلتر.
1. إذا تلطيخ "الخامس أنيكسين"، ريسوسبيند القريبون MPs المجنحة في المخزن المؤقت "أنيكسين الخامس" الذي يحتوي على 5 ميليلتر مترافق FITC الخامس أنيكسين. إذا شاركت تلطيخ مع الأجسام المضادة، إضافة الأجسام المضادة المطلوبة (بالنسبة مثال انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الحل "الخامس أنيكسين". إضافة صبغة الفلورسنت الدهن، ماليميدي N-(2-aminoethyl) (انظر الجدول للمواد)، في تركيز ميكرومتر 1 في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لتسمية وتحديد أعضاء البرلمان.
تبني أعضاء البرلمان في تلطيخ الحل لمدة 20 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
أغسل أعضاء البرلمان واسطة تنبيذ فائق (ح 1 في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية)؛ تجاهل المادة طافية.
ريسوسبيند في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتشغيل العينات على سيتوميتير مكان مخصص تدفق مزودة بوحدة إلكترونية محسنة لزيادة الحساسية (انظر الجدول للمواد).

7-طلبات النواب المجنحة معزولة لدراسة وظيفة المجنحة في التئام الجروح

في فيفو الإدارة لأعضاء البرلمان المجنحة للجروح colonic
1. تخدير الفئران بحقن داخل خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). تأكيد التخدير بدواسة ريفلكس (قرصه إصبع ثابتة) وضبط حسب الضرورة.
2. ضع الماوس على المعدة واستخدام الملقط خزعة 28 سم والمنظار مجهزة بكاميرا عالية الدقة (مثل المنظار بيطرية لاستخدام الحيوانات الصغيرة، انظر الجدول للمواد)، تولد 3-5 إصابات سطحية بجانب الظهرية القولون. عند الانتهاء من إصابة، وضعت الفئران العودة إلى قفص على حصيرة التحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) حتى استردادها.
3. تخدير الفئران (كما هو الحال في الخطوة 7-1-1). استخدام المنظار الحصول على الصور من الجروح التي يتعرض لها ح 24 (1 يوم) بعد إصابة. واسمحوا الفئران استعادة كما هو الحال في الخطوة 7.1.2.
4. في نفس الوقت (24 ساعة بعد إصابة)، إدارة مورين MPs المجنحة المستمدة من 2 × 10⁶ بمنس في 100 ميليلتر من حبس + مباشرة إلى كل موقع الجرح باستخدام نظام (استخدام إبرة ز 29) على أساس تنظير القولون microinjection⁹. ثلاثة أيام فيما بعد (يوم 4 بعد إصابة) تخدير الفئران (كما هو الحال في الخطوة 7.1.1) واستخدم المنظار للحصول على الصور من التئام الجروح. واسمحوا الفئران استعادة كما هو الحال في الخطوة 7.1.2.
5. استخدام برنامج تحليل الصور المفضلة (انظر الجدول للمواد)، مناطق المخطط التفصيلي مرئية الجرح في الصور المكتسبة، وتدبير مجال نفس الجرح في أيام 1 و 4 بعد إصابة، وحساب النسبة المئوية لإغلاق الجرح.
الإنسان طلائي الخلايا في المختبر التئام
1. BBe كربونات الكالسيوم-2 العد أو T84، الخلايا الظهارية المعوية البشرية التي هيموسيتوميتير والبذور 5 × 10⁵ خلايا/بشكل جيد في لوحات الثقافة 24-جيدا. احتضان الخلايا الموجودة في غرفة حضانة قياسية في 37 درجة مئوية و 5% CO₂. كربونات الكالسيوم-2 BBe أو T84 تصل إلى كونفلوينسي داخل 48 ح⁹. الثقافة الخلايا الظهارية، استخدم دميم ودميم-F12 (50/50) مع ملاحق كما سبق وصف⁹.
2. توليد الجروح الصفر الميكانيكية في أحادي الطبقة باستخدام تلميح ماصة وشفط منخفضة كما هو موضح سابقا⁴^،⁹. الحصول على صور مناطق الجرح فورا بعد خدش استخدام مجهر مقلوب مرحلة-على النقيض تدخل تفاضلية (استخدام 5 X أو 10 X أهداف)، لاستخدامها كوقت = النقطة المرجعية 0.
3. إضافة أعضاء البرلمان (مشتقة من 2-4 × 10⁶ بمنس) إلى مونولاييرس خدش-إصابة الخلايا الظهارية، واحتضانها لإضافية 24 ساعة (48 ساعة بعد إصابة، في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂). وفي هذا الوقت إعادة الحصول على الصور من الصفر-الجروح.
4. استخدام برنامج تحليل الصور المفضلة (انظر الجدول للمواد) لقياس المجالات الجرح في t = 0 و t = 48 حاء حساب النسبة المئوية لإغلاق الجرح بواسطة تحديد الفرق في منطقة الجرح عند نقطة زمنية محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سيتوميتريك تحليل لتدفق التمثيلية MPs التي كانت معزولة من الإنسان والفأر بمنس مبينة في الشكل 1. يمكن تقييم تباين حجم النواب المجنحة بالمقارنة بالخرز الحجم المعروفة كما هو مبين في الشكل 1أ، ب للبشرية MPs. ملاحظة، لوحظت لا اختلافات كبيرة في حجم التباين بين الفأر والإنسان من أعضاء البرلمان. وبالمثل، استخدام التدفق الخلوي ووسم الأسفار، التعبير عن البروتين/s اختيار النواب معزولة من الماوس أو البشرية المنشأ يمكن تحديده....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات لعزل وتوصيف المجنحة المستمدة من أعضاء البرلمان موصوفة في هذا البلاغ. ويجب مراعاة العديد من النقاط الحرجة الرئيسية لنجاح هذا الإجراء. أولاً، يجب عزل طازجة بمنس والمستخدمة في التجارب داخل ح 2 من العزلة لمنع التنشيط التلقائي وتحبب. يجب أن يتم التعامل مع جميع من بمنس خلال العزلة وحتى هذه النقطة من التحفيز على الجليد لمنع التنشيط و الإفراج عن النائب السابق لأوانه¹². وثانيا، تنبيذ فائق ح 1 أو أكثر يزيد من التكوير MPs. الثالثة، لتحليل التدفق الخلوي، الصك يجب أن تكون محسوبة بشكل صحيح مع مزيج خر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح من أي نوع تتعلق بهذه الاتصالات

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للمساعدة التقنية للدكتور سواميناثان سوشيترا الذي يدير الأساسية "شمال غرب فينبيرج مدرسة للطب التدفق الخلوي". تم توفير التمويل من خلال DK101675 (المعاهد الوطنية للصحة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM	Corning	10-041-CV
مصل الأبقار الجنيني (معطل حراريا)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin / Streptomycin (10,000 وحدة بنسلين / 10,000 مجم / مل البكتيريا)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
كلوريد الصوديوم	Sigma	S9888	معقم ومرشح من خلال 0.1 وحدة تصفية ميكرون
معقمة مفلترة Histopaque 1077	Sigma	10771
معقمة مفلترة Histopaque 1119	Sigma	11191	الكثافة 1.119 جم / مل. محلول عديد السكروز و ؛ دياتريزوات الصوديوم. إحضار
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى درجة حرارة الغرفة بدون كالسيوم ومغنيسيوم	Cellgro	210-40-CV
كحول إيثيلي (200 برهان)	مختبرات Decon	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪	Sigma	T8154 ؛ SIGMA	مخفف 1: 2 لعد جدوى الخلية
Isoflurane		Abbot 50033
مضاد للإنسان CD11b-APC مترافق	Biolegend	301350	استنساخ ICRD44 (التركيب النهائي: 1 & micro ؛ جم / مل)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N- (2-أمينوإيثيل) ماليميد ؛
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads لقياس التدفق الخلوي	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		دياتريزوات الصوديوم / ديكستران 500 ، الكثافة 1.113 جم / مل
C57BL / 6 فئران	جاكسون لابز
15 مل جهاز طرد مركزي أنابيب	Corning	430053
50 مل أنابيب الطرد المركزي	BD Falcon	352070
25 مل ماصات مصلية	Celltreat	229225B
10 مل ماصات مصلية	Celltreat	229210B
5 مل ماصات مصلية	Celltreat	229205B
ماصات باستور ؛	BD	Falcon 357575
25 جم × 5/8 بوصة. الإبر (إبر انزلاق دقيقة)	BD	305122
100 & micro ؛ مصافي الخلايا m	Celltreat	229485
أنابيب الفراغ	BD	367251
<قوية> المعدات< / قوي>
LSR Fortessa منتج أبحاث الطلب الخاص (SORP) BD		(SORP)
الطرد المركزي المتأرجح دلو	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultra Centrifuge	بيكمان	(L8-80 M)
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة	ThermoFisher Scientific	؛ VV-17703-15 (فريسكو 17)
جهاز طرد مركزي دلو متأرجح	ThermoFisher Scientific	ملقط خزعة 75004503 (Megafuge 40R
) ، 28 سم	Storz	27071zj
Software
Image J	المعهد الوطني للصحة	مفتوح المصدر

جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neutrophil Microparticles Microparticle Isolation Flow Cytometry Immunoblotting Density Gradient Centrifugation Ultracentrifugation Cell Debris Removal Fluorescent Labeling Wound Healing Assay Inflammatory Markers

عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة