الفئران تمثل نموذجا لا تقدر بثمن في فيفو لدراسة العدوى والأمراض التي تسببها الكائنات الدقيقة المعدية المعوية. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لدراسة الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في نماذج الماوس الملوية البوابية-المتعلقة بالمرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الملوية البوابية هو ممرض المعدة في نصف سكان العالم وهو سببا هاما للمراضة والوفيات لدى البشر. تم تطوير عدة نماذج الماوس المعدة الملوية العدوى دراسة الآليات الجزيئية والخلوية حيث H. pylori البكتيريا استعمار معدّة المضيفين الإنسان وتسبب المرض. هنا، يمكننا وصف البروتوكولات إلى: 1) تعد المعلقات البكتيرية للعدوى في فيفو من الفئران عن طريق إجراء تزقيمية مدتها؛ 2) تحديد مستويات الاستعمار الجرثومي في أنسجة المعدة الماوس، بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والعد قابلة للتطبيق؛ و 3) تقييم التغيرات المرضية، بعلم الأنسجة. لإنشاء هيليكوباكتer العدوى في الفئران، أولاً هي تلقيح الحيوانات (منتدى جنوب المحيط الهادئ) خالية من مسببات الأمراض خاصة مع تعليق (التي تحتوي على إيه وان زيرو5 الوحدات المكونة للمستعمرة، كفوس) من سلالات استعمار الماوس أما الملوية البوابية أو أخرى spp. الملوية المعدة من الحيوانات، مثل حطي الملوية. في العدوى بعد النقاط الزمنية المناسبة، اقتطعت بطون وتشريح ساجيتالي إلى أجزاء متساوية الأنسجة اثنين، كل منها يتألف من مناطق الجسم والتجويف. واحدة من هذه الشظايا ثم يستخدم للعد قابلة للتطبيق أو استخراج الحمض النووي، بينما الآخر يخضع لتجهيز غذائها. يمكن تقييم الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في المعدة بشكل روتيني في أقسام الأنسجة المعدة ملطخة ببقع (H & E) النجوم Warthin، جيمسى أو هايماتوكسيلين وويوزين، حسب الاقتضاء. التحاليل المناعية إضافية قد تضطلع أيضا إيمونوهيستوتشيميستري أو الفلورة على أبواب أنسجة المعدة الماوس. البروتوكولات المبينة أدناه مصممة خصيصا لتمكين تقييم أمراض المعدة تشبه تلك التي تتعلق بالإنسان H. pylori في الفئران الأمراض، بما في ذلك التهاب وضمور الغدة وتشكيل جريب اللمفاوية. إعداد العدوى والبروتوكولات تزقيمية إجراء يمكن تكييفها لدراسة أمراض أخرى تصيب الإنسان المعوية أن استعمار الفئران، مثل Typhimurium السالمونيلا أو رودينتيوم المضاداتأيضا.
المقدمة
الملوية البوابية ممرض المعدة على شكل دوامة، سلبية الغرام، والبشرية موجودة في جميع السكان عبر العالم، مع معدلات الإصابة في البلدان النامية وتقدر بحدود 80%1. على الرغم من أن معظم H. pylori-الأفراد المصابين بأعراض، ووضع بعض أشد الأمراض، بدءاً من تقرح الهضمية بسرطان المعدة2. H. pylori-تتميز السرطانات المرتبطة بها على نطاق واسع بتغييرات خبيثة في الخلايا الظهارية (جيكس) أو بتشكيل العقدي خارج الأنسجة اللمفاوية في المعدة، ونتج عنه غدية المعدة أو المرتبطة بالغشاء المخاطي الليمفاوي سرطان الغدد الليمفاوية الأنسجة (الشعير)، على التوالي. H. pylori هو تكييف عالية البقاء على قيد الحياة في مكانة الإيكولوجية القاسية في المعدة بسبب وجود عدة عوامل الفوعة واليات تيسير الانضمام، والنمو والايض في مكانة هذا. على وجه الخصوص، تمتلك خبثاً سلالات H. pylori كيلو بايت 40 كاج الجزيرة الإمراضية (cagPAI) الذي يشفر حوالي 30 الجينات المطلوبة للإنتاج من نوع 4 إفراز نظام (T4SS)3،4 . المساعدة النقدية PAI-إيجابية سلالات H. pylori المرتبطة بتنظيم دورات تعريفية لمستويات أعلى من التهاب مزمن في البلد المضيف، والذي كان متورطا باعتبارها مؤشرا أساسيا للمعدة غدية5.
وكانت في فيفو نماذج حيوانية، لا سيما من الفئران، الزاخر بالسماح للباحثين بالتحقيق في المساهمة النسبية للمضيف، والعوامل الجرثومية والبيئية على H. pylori العدوى والمرض نتيجة6. سبق وقد أثبتت الدراسات أن تطول H. pylori عدوى فئران على نتائج الخلفية الوراثية C57BL/6 في تطوير التهاب المعدة المزمن وغده ضمور، كلا من السمات المميزة ل عدوى H. pylori 7. وعلاوة على ذلك، قد تبين الإصابة بالأنواع البكتيرية القطط/الكلاب ذات الصلة، حطي حاء، للحث على تشكيل الشعير في الفئران مع أمراض مماثلة وتطور المرض كما رأينا في لمفوما مالت البشرية8،9. H. pylori الأكثر استخداماً هو عزل في دراسات الاستعمار الماوس "سيدني سلالة 1" (SS1) سلالة10الذي كاجالباي+ ولكن من T4SS غير وظيفية (T4SS−)11. السلالات الأخرى المستخدمة على نطاق واسع تشمل H. pylori B128 7.13 (كاجالباي+/T4SS+)12 و X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. للالتهابات حطي حاء ، سلالة CS1 ("القط دوامة 1"، كاجالباي–/T4SS−) هو عموما يستخدم14.
وهنا، نحن نقدم بروتوكول وصف إعداد لقاح الملوية للعدوى في الجسم الحي ، والإجراءات المتعلقة بإجراء تزقيمية الفئران، فضلا عن أساليب لمعالجة الأنسجة لدراسة التغيرات التشريحية المرضية في المعدة. على وجه الخصوص، هذه المادة سوف تركز على غذائها الأساليب المستخدمة لتصور الاستعمار الجرثومي وتقييم التغيرات التشريحية المرضية، بما في ذلك تشكيل الشعير، وفي الغشاء المخاطي المعدة من الفئران المصابة. قد تكون بعض الأساليب الموصوفة هنا تتكيف مع دراسة أخرى مسببات أمراض الأمعاء مثل س. تيفيموريوم أو C. رودينتيوم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-النمو وإعداد لقاح البكتيريا
- ذوبان الجليد الأرصدة والغليسيرول H. pylori أو H. حطي15 -80 درجة مئوية وثقافة فرعية على الحصان أجار الدم (HBA) لوحات تضم: "أجار الدم قاعدة رقم 2" (انظر الجدول للمواد)؛ تعديل "الملحق سكيرو انتقائية المضادات الحيوية" (تتألف من فانكومايسين، 10 ميكروغرام/مل؛ بوليميكسين ب، 25 نانوغرام/مل؛ ميثوبريم، 5 ميكروغرام/مل؛ الامفوتريسين ب 2.5 ميكروغرام/مل)؛ و 5-10% (v/v) حصان الدم15،16. البكتيريا تنمو جيدا في ظل ظروف ميكروايروبيك في 2.5 أو 3.5 L الجرار اللاهوائية التي تحتوي على حزم الغاز المناسبة (انظر الجدول للمواد)، عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن سوبكولتوريد سلالات H. pylori التي نمت في ظل هذه الظروف بعد 1 – 1.5 يوما حضانة، بينما حطي حاء، على الأقل 2 أيام الحضانة مطلوب عموما. وقد وصفت وسائل الإعلام الثقافة وتخزين مناسبة بالتفصيل قبل15. -
إعداد لقاح البكتيرية للإصابة الماوس من الثقافات المبكرة إلى منتصف المرحلة لوغاريتمي. حصاد البكتيريا بلطف من لوحات أجار بسبب الفيضانات كل لوحة مع 1-2 مل مرق التسريب (بهي) قلب المخ. نضح المعلقات من لوحات مع الممصات باستور.
- وبدلاً من ذلك، إعداد لقاح من البكتيريا الملوية التي قد تم نشرها في مرق بهي ل 16 – 18 ح15. وفي هذه الحالة، جمع البكتيريا بسرعة منخفضة الطرد المركزي في س 2,200 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تقييم الجدوى وحركية من البكتيريا بدراسة الاستعدادات جبل الرطب تحت الطوري (100 X الهدف). إعداد يتصاعد ويت من ريسوسبيندينج لوبفول بكتيريا في معالجة تجميعية 10 – 20 ميكروليتر من بهي مرق على شريحة الميكروسكوب زجاجية. في حالة حطي حاء، وبكتيريا أكبر كثيرا مما H. pylori، استخدم هايموسيتوميتير لعد دقة أرقام البكتيريا قادرة على البقاء. تأكيد نقاء الثقافة بأداء غرام-وصمة عار.
ملاحظة: فقط استخدام لقاح H. pylori إذا كان غالبية البكتيريا شكل العصوي أو حلزونية (مورفولوجية يمكن أن تختلف تبعاً للسلالة). لقاح حطي حاء الدرجة الأولى يجب أن تحتوي على البكتيريا على شكل حلزوني. يجب عدم استخدام لقاح إذا كان معظم البكتيريا التشكل كوككويد، هذه الأشكال ليست قابلة للاستمرار، ولن تقيم عدوى في الفئران. -
تقدير عدد البكتيريا في العدوى عن طريق العد تحت الطوري العدد التقريبي للبكتيريا في كل حقل (الهدف X 100) واستخدام الدليل التالي: 1 بكتيريا كل حقل = تقريبا 106 (الوحدات المكونة للمستعمرة زيمبابوي) من/mL الملوية؛ 10 البكتيريا كل حقل = تقريبا 107 زيمبابوي/مل؛ البكتيريا 100 كل حقل = تقريبا 108 زيمبابوي/mL، إلخ
- عند استخدام هايموسيتوميتير، حساب زيمبابوي/مل باستخدام الصيغة التالية:
زيمبابوي/مل = (متوسط عدد من البكتيريا في حقل 4 × 4) × (معامل التخفيف) x (104).
- عند استخدام هايموسيتوميتير، حساب زيمبابوي/مل باستخدام الصيغة التالية:
-
ضبط كثافة الخلايا البكتيرية من العدوى إلى حوالي 107–108 زيمبابوي/mL بالتخفيف في مرق بهي، إذا لزم الأمر.
- لضمان بقاء البكتيرية القصوى، استخدام لقاح تزقيمية إجراء أسرع بعد الإعداد.
- دائماً تأكيد كثافة الخلية H. pylori وقابليتها للبقاء عن طريق إجراء العد قابلة للاستمرار من لقاح فورا بعد الإجراء تزقيمية مدتها (انظر أدناه). هذا ليس دائماً ممكناً حطي حاء، كما أنها لا تشكل عادة المستعمرات المعزولة في ثقافة وسائل الإعلام. لا يمكن تحديد عدد s الملويةقادرة على البقاء في لقاح بقياس الكثافة البصرية (600) وحدة بهذا الأسلوب لا تميز بين قابلة للتطبيق (أي، عصوي/لولبية/حلزونية) وغير قابل للحياة ( أي، كوككويد) البكتيريا.
- استخدام قيم الكثافة الضوئية كوسيلة لتقدير أرقام قابلة للتطبيق H. pylori البكتيريا في لقاح، ولكن في هذه الحالة، هو الضرورة الأولى لإنشاء منحنى نمو. ولهذا الغرض، رصد مع مرور الوقت قيم الثقافات H. pylori 600 ألف ويرتبط ارتباطاً مباشرا ضد العدد البكتيريا قادرة على البقاء، تحدد عن طريق لوحة العد.
ملاحظة: طريقة ملائمة للقيام بمثل هذه القرارات منحنى نمو للبكتيريا الثقافة في المتوسط السائل (الجزء 1-2)، استخدام قوارير زراعة الأنسجة أسفل شقة قياسية توضع في حاضنة2 CO 10%. تتم مقارنة أرقام كفوس، تحدد من مختبرين الثقافات الحصول على كل ح 4-6 على مدى أيام 2-3، ثم إلى المناظرة قيم600 17. الأهم من ذلك، يجب إنشاء منحنيات النمو لكل سلالة H. pylori , كهذه يمكن أن تنمو بمعدلات مختلفة، وعلاوة على ذلك، ليست جميع سلالات تنمو جيدا في شركة 10%2.
2-إجراء تزقيمية الفئران مع الملوية
ملاحظة: يمكن تطبيق هذا الأسلوب من تزقيمية إجراء الأنواع البكتيرية الأخرى أن استعمار في القناة الهضمية مثل س. تيفيموريوم، رودينتيوم جيم، الليستريه المستوحدة.
- استخدم منذ 6 – 8 أسابيع، ومحددة خالية من العوامل الممرضة (منتدى جنوب المحيط الهادئ) و الملوية-مجاناً الفئران الذكور أو الإناث. استخدام الحيوانات مع خلفية وراثية C57BL/6 للتجارب العدوى مع H. pylori أو H. هوز. في هذه الدراسة، استخدمنا البرية من نوع (WT) والكائنات المعدلة وراثيا C57BL/6 الفئران التي تفتقر إلى مستقبل المناعة فطرية رئيسية (يطلق عليها المغلوب أو الحيوانات كو).
ملاحظة: الفئران في خلفيات وراثية أخرى يمكن أن تستخدم أيضا للعدوى الملوية ، ومع ذلك، قد تتأثر مستويات الاستعمار وشدة المرض نوع المضيف الخلفية،من18إلى19. - نضح العدوى البكتيرية (الخطوة 1.5) في المحاقن القابل للصرف 1 مل واستبدال الإبر التي تم توفيرها مع الإبر قياس 23 التي هي البولي إيثيلين المتاح ملحقة بالقسطرة (الطول، 6 – 8 سم؛ قطرها الداخلي، 0.58 mm). ربط بالقسطرة للابر من تطبيق شرائح صغيرة من البلاستيك فيلم (انظر الجدول للمواد). وبدلاً من ذلك، استبدال الجمعية إبرة/القسطرة باستخدام البلاستيك العقيمة تغذية أنابيب (قياس 20 x 38 ملم).
- كبح جماح جسديا الفئران مع أحكام قبضتهم على القفا من العنق والذيل.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء دون تخدير، أو بدلاً من ذلك، باستخدام التخدير المستنشقة، مثل ميثوكسيفلوراني أو إيسوفلوراني15. - أدخل القسطرة في وسط الفك المفتوح والدليل في اتجاه والذيلية نحو المريء. تمديد رقبة الماوس للسماح بسهولة الوصول إلى المعدة عن طريق المريء (وبعيدا عن القصبة الهوائية) حتى معظم أو كل من القسطرة لم تعد مرئية وهو شعر مقاومة، المقابلة لقاعدة للمعدة. تسليم قاسمة محددة، عادة ما تكون 100 ميكروليتر للواحدة تلقيح (الشكل 1).
ملاحظة: يجب أن تكون الفئران جافاجيد مع ≥ 105 زيمبابوي لضمان المثلى الباثولوجيا الاستعمار والمرض. - بيت الفئران في منشأة حيوان منتدى جنوب المحيط الهادئ طوال فترة التجربة.
ملاحظة: فقط هو لاحظ أمراض شديدة وغديه الفئران WT C57BL/6 في حوالي 24 شهرا بعد الإصابة20. ومع ذلك، قد تسارع هذا التأثير في بعض الحيوانات المحورة وراثيا، أو في الفئران مع خلفيات وراثية أخرى. - عند انتهاء الإجراء تزقيمية مدتها، إجراء تعديل أسلوب كم وميسرا لتحديد أرقام قابلة للتطبيق H. pylori البكتيريا التي تديرها للفئران. لهذا، العدوى هو متسلسل المخفف (من 10 من1 إلى 10−5) في بهي باستخدام الطريقة الموضحة بالتفصيل قبل15.
ملاحظة: لضمان عزل المستعمرات واحدة، لوحات HBA ينبغي استعد والمجففة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء أو 37 درجة مئوية حاضنة لقبل 10 – 15 دقيقة لاستخدام.
3-الأنسجة من الفئران تجربة ما بعد الحصاد
- Euthanize الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون أو التفكك سرطان عنق الرحم، وفقا للجنة الأخلاقيات ذات الصلة للتجارب الحيوانية.
- فتح التجويف البطني والمكوس المعدة باستخدام مقص جيد، منحنى.
ملاحظة: الأمصال يمكن أيضا جمع من ثقب القلب للمساعدة في تحقيق الاستجابات النظامية لعدوى الملوية . بالإضافة إلى ذلك، يتم جمع الطحال والعقد الليمفاوية باراجاستريك مفيدة في دراسة الاستجابات المناعية التكيفية. - قص المعدة على طول انحناء أكبر وإزالة بقايا الطعام بلطيف الغسيل في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في أنابيب 50 مل.
- تغسل المعدة مرة أخرى في برنامج تلفزيوني العقيمة وثم تسجيل الوزن الرطب استخدام أطباق بيتري البلاستيك تاريد 6 سم.
- تسطيح المعدة وتشريح ساجيتالي إلى أجزاء الأنسجة تساوي اثنين، تتألف من كل: التجويف الجسم والمناطق فغير غدي (الشكل 2). إزالة المنطقة غير غدي وتزن واحد من كل نصف المعدة قبل إضافة إلى أما 1 مل من بهي العقيمة (لعد قابلة للتطبيق) أو المفاجئة التجميد في النيتروجين السائل (لاستخراج الحمض النووي/الحمض النووي الريبي).
ملاحظة: يجب تخزين الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة في بهي على الجليد حتى أنهم على استعداد لمعالجتها. يمكن أيضا استخدام أنسجة المعدة المجمدة المفاجئة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتينات قبكر (PCR الكمي) أو التحليلات الغربية النشاف، على التوالي. - إضافة المعدة الأخرى نصف إلى أنبوب 15 مل تحتوي على الفورمالين 10%. تزج الأنسجة في الفورمالين 10% لمدة 10 ق وتتسطح ثم إلى الجانب العلوي من الأنابيب. تسمح الأنسجة إصلاح قبل إعادة غمر في حل الفورمالين 10% لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن أن تبقى الأنسجة في الفورمالين 10% لعدة أسابيع قبل تجهيزها لعلم الأنسجة. التخزين المطول للأنسجة يؤثر الهندسة المعمارية و/أو أنتيجينيسيتي أدى إلى نتائج دون المستوى الأمثل في تحليل المتلقين للمعلومات.
4-تأكيد استعمار البكتيريا في المعدة بعد انتهاء العدوى
-
عد قابلة للاستمرار من H. pylori في المعدة
- الملحق لوحات HBA العقيمة مع المضادات الحيوية إضافية (200 ميكروغرام/مل باسيتراسين وحمض نالاديكسيك 10 ميكروغرام/مل) قبل أداء التهم مستعمرة من الماوس المصابة بطون16.
- مجانسة أقسام المعدة أما يدوياً أو استخدام ميكروبيستليس البولي بروبلين أوتوكلافابلي، أو باستخدام أداة ميكانيكية الانفصال (انظر الجدول للمواد).
- إعداد تخفيف المسلسل مكررة (10 من1 إلى 102) من هوموجيناتيس المعدة الناتجة في بهي العقيمة.
ملاحظة: تخفيف ينبغي أن يتقرر بناء على الأحمال البكتيرية النموذجية التي تم الحصول عليها لمعين H. pylori السلالة المستخدمة للإصابة، فضلا عن مدة الإصابة. يمكن أيضا استخدام عينات غير مخفف. - تقسيم لوحات HBA المجفف مسبقاً (انظر الملاحظة أعلاه) إلى قطاعات ثلاثة أو أربعة. استخدام تكييف أسلوب كم وميسرا، إضافة 10 – 100 مل من كل تمييع على شريحة من لوحة أجار وانتشار استخدام حلقات بلاستيكية معقمة15.
- السماح لوحات الجافة وثم وضعها في وضع مقلوب (غطاء الجانب الأسفل) في عبوات الغاز أهوائي. للاحتفاظ بالرطوبة في الزجاجات، تشمل طبق بتري يحتوي على الماء.
- احتضان الجرار في 37 درجة مئوية حتى تشكل مستعمرات (عادة 4-7 أيام).
- تعداد المحتوية على segment(s) بين 10 و 100 من المستعمرات المعزولة.
ملاحظة: ويمكن تمييز المستعمرات H. pylori ونمو حطي حاء على ألواح من أولئك الأعضاء الآخرين الحجمية المعدة مورين استخدام الاختبارات القياسية آريس، الكاتالاز واوكسيديز. H. pylori و حطي حاء إيجابية بالنسبة لكافة الاختبارات الثلاثة. - حساب الأحمال البكتيريا ك (زيمبابوي/غرام أنسجة)، استخدام الصيغة التالية:
[(متوسط عدد المستعمرات عد) × (عامل إضعاف) x (حجم مطلي)]/(المعدة الوزن).
-
الكشف عن الإصابة حطي حاء في "أنسجة المعدة" بسلسلة من ردود الفعل بوليميريز (PCR)
- استخراج الحمض النووي من بطون الماوس باستخدام البروتوكولات القياسية في عزل الحمض النووي، أو مجموعة متاحة تجارياً.
- تحديد تركيز الحمض النووي للعينات باستخدام تقنية كوانتيتيشن فلوروميتريك (انظر الجدول للمواد).
- قم بإعداد ردود فعل PCR استهداف 325-قاعدة أزواج (bp) جزء من الجينات (أوريب) حطي H. urease ب21. وينبغي أن تتضمن كل رد فعل: 100 نانوغرام من الحمض النووي؛ 1 ملم من الأمام (5 '-AAA المنسوجات والملابس CAC جا GAC تج زز-3')، وعكس (5 '-ضريبة تحويل العملة نقل واكتساب التكنولوجيا TCC AAG تج تج CAC لجنة التنسيق الإدارية-3') الإشعال؛ دنتبس 200 ملم؛ وحدات 0.5 بوليميراز Polymerase والمبالغ المناسبة من المخزن المؤقت والمياه خالية من نوكلياسي.
ملاحظة: قد تم تصميم هذا الزوج اليغنوكليوتيد للتعرف وربط تسلسل مثلى في الجينات أريب H. pylori و حطي حاء ولكن عندما تتعرض لظروف PCR أدناه، ليست تلك الموجودة في أريب جينات enterohepatic الملوية spp. - إجراء PCR التضخيم باستخدام التشكيل الجانبي الحرارية التالية: تدفئة في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها دورات 35 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 61 درجة مئوية عن 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، قبل عقد في 20 درجة مئوية.
- تشغيل المنتجات بكر على 2% [اغروس] هلام لمدة 30 دقيقة في 100 V.
5-نسيجية تحليلات الملوية-إصابة "أقسام المعدة الماوس"
- التجهيز لانسجة المعدة
- إزالة أنسجة المعدة من الفورمالين ومكان في أطباق بتري نظيفة.
- قطع أنسجة المعدة مع مشرط إلى عدة شرائط طولية متساوية الحجم (كل 2 – 3 مم) وفي أشرطة الكاسيت التضمين توسم تتضمن الحشو رغوة.
- إصلاح أنسجة المعدة بوضع أشرطة الكاسيت التضمين في جرة مليئة الإيثانول 80%.
ملاحظة: يمكن معالجتها فورا بطون أو تخزينها لمدة تصل إلى 1 – 2 أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. - عملية بطون على معالج نسيج الآلي، المبرمجة مع الإعدادات التالية:
الجفاف: 70% إيثانول-1 دورة، 20 دقيقة؛ الإيثانول 90%-1 دورة، 20 دقيقة؛ 100 ٪ الإيثانول-2 دورات، كل 20 دقيقة + 1 دورة، دورة 40 دقيقة + 1، ح 1.
مسح: زيلين نفط – 2 دورات، كل 30 دقيقة + 1 دورة، 45 دقيقة.
التلقيح: شمع البارافين في 60 درجة مئوية-دورة 1، 45 دقيقة + 1 دورة، دورة ح 1 + 1، ح 1.25. - إزالة عينات المجهزة من الجهاز وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لتضمين البارافين.
- البارافين التضمين لانسجة المعدة المجهزة
- وضع قوالب قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ على مرحلة وحدة التضمين الحارة أسس القوالب.
ملاحظة: تضمين الجهاز يجب تعيين عند 60 درجة مئوية لتضمين البارافين تتسم بالكفاءة. - مكان مشمع أشرطة الكاسيت التي تحتوي على العينات إلى منطقة لوحة ساخن/حمام شمع حار لوحدة التضمين حتى يذوب الشمع تماما.
ملاحظة: من المستحسن تضمين العينة بعد وقت قصير من الشمع يذوب. وهذا ما يضمن عدم حدوث تصلب الأنسجة. - ملء نصف قوالب الفولاذ المقاوم للصدأ مع شمع البارافين. استخدام الملقط الحارة، إزالة شرائط أنسجة المعدة من أشرطة الكاسيت ودفع المعدة يجرد من خلال البارافين إلى قاعدة قوالب بلطف. توجيه شرائح الأنسجة في زاوية اليمين إلى قاعدة قوالب بعناية حيث أن تحقق غاياتها شرائح تواجه صعودا.
ملاحظة: الخطوات التالية التي ينبغي إجراء أسرع وقت ممكن لتجنب تصلب وفصل الطبقات البارافين داخل كتل المضمنة. التوجه السليم لانسجة المعدة أمر بالغ الأهمية لتحليل المتلقين للمعلومات. - وضع قوالب على لوحة الباردة وحدة التضمين إصلاح العينات في مكان وإعادة توجيه الأنسجة إذا لزم الأمر.
ملاحظة: إذا أصبح أخرجت الأنسجة ويبدأ البارافين تتصلب، وضع قوالب يعيدوه الصفيحة إذابة الشمع وإعادة تضمين الأنسجة في قوالب. - ضع نصف الأشرطة المسمى التضمين (التي كانت تستخدم لتجهيز الأنسجة) إلى أعلى القوالب وتعبئة بلطف بالشمع الحار. لا تسمح البارافين تجاوز السعة.
- بلطف ضع قوالب إلى لوحة باردة والسماح لتبرد.
- بمجرد البارافين حددت تماما، فصل القطع جزءا لا يتجزأ من العفن. شمع البارافين نظيفة الزائدة على حواف كاسيت باستخدام صفيحة (تعيين فوق 80 درجة مئوية) أو مكشطة. ويمكن تخزين الكتل في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تمزيقها.
- وضع قوالب قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ على مرحلة وحدة التضمين الحارة أسس القوالب.
- تقطيع الأنسجة
- البرد كتل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين على الجليد والحرارة حمام مائي مملوءة بالماء عالي النقاوة إلى 40-45 درجة مئوية.
- تأمين بليد في حامل مبضع وضبط زاوية التخليص بين 1-5 درجة مئوية لمنع الاتصال بين الأوجه كتلة الوجه وسكين، قبل إدراج كتل البارافين.
ملاحظة: تأكد من كتل واضحة من البارافين الزائدة المكتسبة من التضمين، كما أن هذا قد يعوق تناسب الكتلة. - توجيه الشفرة لقطع مستقيم عبر الكتلة. بلطف قطع المقاطع رقيقة 2 – 3 لضمان تحديد المواقع الصحيحة للكتلة.
- قطع كتل بسمك حوالي 10-30 ملم. تضمن هذه الخطوة أن يتم خفض مساحة قصوى لكل قطاع النسيج.
- قطع 10 أقسام ميكرومتر وتجاهل أي التي تحتوي على الثقوب الناتجة عن التشذيب.
- التقاط المقاطع باستخدام الملقط وتعويم لهم في حوض ماء للتسوية بعناية. استخدام الملقط لفصل كل قسم.
- جمع الأجزاء من حمام الماء والمكان على الشرائح الزجاجية المشحونة (انظر الجدول للمواد).
- تخزين الشرائح تستقيم في حامل شريحة ووضع في حاضنة في 37 درجة مئوية. الأجزاء الجافة بين عشية وضحاها.
- تخزين المقاطع في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى للتحاليل اللاحقة.
- Haematoxylin وويوزين (H & E) تلطيخ الأنسجة المعدة
- ديواكس الشرائح باستخدام 3 يغسل من زيلين نفط لمدة 5 دقائق في كل منها، تليها يغسل 3 في الإيثانول 100%، لمدة 3 دقائق. ضمان حلول جديدة تستخدم في كل مرحلة.
- شطف الشرائح في ماء الصنبور ل 30 – 60 ثانية.
- إزالة الماء الزائد بلطف التنصت على الجزء السفلي من الشرائح على منشفة ورقية. وصمة عار مع هايماتوكسيلين التي تمت تصفيتها للحد الأدنى 3 ضمان أن أبواب مشمولة بما فيه الكفاية مع الحل.
- شطف الشرائح قيد التشغيل ماء الصنبور حتى يتم تشغيل المياه واضحة.
- تراجع الشرائح في ماء الصنبور سكوت ل s 8 – 10. لا تعرض الشرائح للحل أكثر من 10 s كهذا سيؤدي إلى البقع الداكنة ومكثفة. ويمكن مشاهدة تلوين الأقسام تحت مجهر. تلوين الكفاءة في هذه المرحلة سيؤدي إلى لون 'زرقاء'.
ملاحظة: تعد مياه الحنفية سكوت بتذويب 2 غ من كربونات الصوديوم الهيدروجينية (ناكو3) و 20 غ من سلفات المغنيزيوم (مجسو4) في 1 لتر ماء المقطر. - شطف الشرائح في ماء الصنبور ل 30 – 60 ثانية.
- إزالة المياه الزائدة كما هو موضح في الخطوة 3، ومن ثم وصمة عار مع المصفاة 1% ويوزين مائي لمدة 3 دقائق.
- شطف الشرائح قيد التشغيل ماء الصنبور حتى يتم تشغيل المياه واضحة.
ملاحظة: تلطيخ يمكن تقييم استخدام مجهر ضوء. إذا كان بقع داكنة جداً، يمكن المجففة الشرائح في الإيثانول 100% لمدة أطول من الوقت المحدد. إذا كان مطلوباً تلطيخ قتامة، يمكن الملون الشرائح مع ويوزين لمدة 1 – 2 دقيقة أطول، قبل الشروع في الخطوات اللاحقة. - يذوي الشرائح باستخدام 3 يغسل من الإيثانول 100% لمدة 30 ثانية كل، تليها يغسل 3 من زيلين نفط لكل 2 دقيقة. ضمان حلول جديدة تستخدم في كل مرحلة.
- تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة. إضافة قطره من تصاعد المتوسطة في وسط ساترة نظيفة قبل وضع الشريحة بلطف على أعلى مع المقاطع التي تواجه أسفل.
ملاحظة: لا جاف الشرائح قبل الانزلاق الغطاء. - ضع الشرائح على سطح مستو والسماح للهواء الجاف. ويمكن أيضا أن تجفف الشرائح في غطاء دخان لتسريع وقت التجفيف.
- صبغة جيمسا لانسجة المعدة
- دو الشرائح باستخدام 2 يغسل من هيستوليني لمدة 5 دقائق في كل منها، تليها يغسل 2 من الإيثانول 100% لمدة 3 دقائق ومن ثم يغسل نهائي في الإيثانول 70% للحد الأدنى 3 ضمان حلول جديدة تستخدم لكل غسل.
- شطف الشرائح في ماء الصنبور ل 30 – 60 ثانية.
- تحضير حل جيمسى بخلط 20% Giemsa وصمة عار بالماء المقطر 80 في المائة. وصمة عار الشرائح مع الحل جيمسا ح 1.
- وضع الشرائح في 100 مل ماء المقطر الذي يحتوي على 3-4 قطرات حمض الخليك ل s 2 – 3.
ملاحظة: يجب أن يكون الحل مختلطة جيدا قبل الاستخدام. وفي هذه المرحلة، يجب أن تظهر الشرائح في اللون الأزرق الشاحب. - تغسل شرائح في الإيثانول 96% لمدة 30 ثانية.
- يغسل الشرائح في الحمامات 3 من الايزوبروبانول لمدة 2 دقيقة في كل منها، تليها 3 حمامات من هيستوليني لكل 2 دقيقة. استخدام الايزوبروبانول الطازجة وهيستوليني لكل غسل.
- شرائح ساترة مع تصاعد المتوسطة، كما تم وصفه سابقا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويصف هذا البروتوكول أسلوب تزقيمية شفوي لتحقيق إجراء عدوى H. pylori أو H. حطي في نماذج الماوس مورين (الشكل 1). في أعقاب القتل الرحيم، يتم إزالة بطون، ووزنه ومقسمة إلى نصفين تساوي 2 تتألف من التجويف والجسم ومناطق غير غدي من أنسجة المعدة (الشكل 2). تتم إزالة المنطقة غير غدي قبل إجراء أي تحاليل.
تؤكده الاستعمار الناجحة للحيوانات عادة إجراء العد قابلة للتطبيق على H. pylori-إصابة هوموجيناتيس المعدة، وبعد تعداد الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويصف هذا البروتوكول استخدام طراز الماوس في فيفو لعدوى الملوية . الخطوات الحاسمة من الإجراءات: 1) إعداد لقاح الملوية التي تحتوي على البكتيريا قادرة على البقاء ومتحركة؛ 2) تسليم الأرقام المناسبة للبكتيريا للماوس عبر إجراء تزقيمية مدتها؛ 3) الكشف عن العدوى البكتيرية بالعد مستعمرة و/أو بكر؛ و 4) إصابة التجهيز لانسجة المعدة التمكن من تقييم للتشريح المرضى في بطون. ترد أدناه مناقشة المزيد من الاقتراحات لإدخال تعديلات، الاعتبارات التقنية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
طريقة زراع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن يشكر السيدة أ دي Paoli والسيدة جورجي رأي-ماكان للمساعدة التقنية. الكتاب تقر استخدام التسهيلات والمساعدة التقنية من منصة موناش علم الأنسجة وقسم علم التشريح وعلم الأحياء التنموي، جامعة موناش. المختبر هو مدعومة بتمويل من "الوطنية للصحة" ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) إلى RLF (APP1079930، APP1107930). ويدعم RLF "زمالة للبحث أقدم" من NHMRC (APP1079904). دينار كويتي ومولودية تدعمها سواء في "موناش الدراسات العليا المنح الدراسية". دينار كويتي أيضا معتمد من قبل المركز للحصانة الفطرية والأمراض المعدية، ومعهد هدسون للأبحاث الطبية، في حين MC "المنح الدراسية الدولية بعد التخرج" من كلية الطب والتمريض والعلوم الصحية، جامعة موناش. أبحاث في "معهد هدسون للأبحاث الطبية" معتمد من قبل "التنفيذية برنامج الحكومة الفيكتوري دعم البنية التحتية".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية > الكواشف البكتريولوجية < / قوية> | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | تذوب في الماء منزوع الأينون قبل التعقيم |
| قسطم دم الحصان منزوع الرجفان | البيولوجيات الأخلاقية الأسترالية | PDHB100 | |
| باكتو مرق ضخ القلب في الدماغ | BD Bioscience | 237500 | تذوب في الماء منزوع الأينونات قبل التعقيم |
| عبوات غاز CampyGen | Thermo Fischer Scientific | CN0035A / CN0025A | |
| < قوية > الكواشف النسيجية < / قوية > | |||
| فورمالين ، مخزن محايد ، 10٪ | سيجما ألدريتش | HT501128 | |
| كحول مطلق ، 100٪ | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| الأيزوبروبانول (2-بروبانول) | ميرك | 100995 | |
| زيلين (خالي من الكبريت) | ChemSupply | XT003-20L | |
| فلتر مايرز هيماتوكسيلين | العنبر العلمي | MH-1L | قبل الاستخدام |
| Eosin ، Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter قبل الاستخدام |
| Wright-Giemsa Stain ، معدل | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | تمييع قبل الاستخدام (20٪ جيمسا ، 80٪ ماء منزوع الأيونات) |
| هيستولين | جرال Scientific | 11031/5 | |
| DPX متوسط تصاعد | VWR | 1.00579.0500< | |
| قوي>كواشف البيولوجيا الجزيئية< / قوي> | |||
| كيوبيت dsDNA BR مجموعة | الفحص الحرارية فيشر العلمية | Q32850 | |
| قليل النوكليوتيدات | سيجما ألدريتش | درجة حرارة التلدين ureB < / em > الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة هي 61 درجة ؛ تشتمل مجموعة C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | على 10x PCR عازل وكلوريد المغنيسيوم |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | يخفف إلى 10 ملي مولار في ماء معقم خال من النوكلياز قبل الاستخدام |
| Molecular grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| كربونات هيدروجين الصوديوم | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium كبريتات هيبتاهيدرات | كيمياء الإمداد | MA048-500G | |
| <قوية > مضادات حيوية< / قوية> | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | تذوب في الماء منزوع الأيونات |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | تذوب في الماء منزوع الأيونات |
| Trimethoprim (& ge; 98٪ HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | يذوب في 100٪ (مطلق) الإيثانول |
| أمفوتريسين | أمريسكو (علم النجوم) | E437-100MG | يذوب في الماء منزوع الأيونات |
| Bacitracin من Bacillus licheniformis< / em> | Sigma Aldrich | B0125 | يذوب في الماء منزوع الأيونات |
| حمض Naladixic | Sigma Aldrich | N8878 | يذوب في الماء منزوع الأيونات |
| <قوي>كواشف أخرى< / قوي > | |||
| ميثوكسي فلوران (بنتروكس) | التطورات الطبية الدولية | غير قابلة للتطبيق | |
| شمع البارافين | بارابلاست بالإضافة إلى ، لايكا بيوأنظمة | 39601006 | |
| <قوية>معدات وأدوات بلاستيكية< / قوية> | |||
| أوكسويد الجرار اللاهوائية | الحرارية فيشر العلمية | HP0011 / HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| 5810R أجهزة الطرد المركزي | جمع الكريات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 2,200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات ؛ C | ||
| 23 جم إبرة انزلاقية دقيقة | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis ، VWR | PM996 | |
| Portex أنابيب البوليثين الدقيقة التجويف | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| قسطرة التغذية البلاستيكية | Instech & nbsp ؛ مختبرات | FTP20-30 | |
| 1 مل توبركولين لوير زلة محاقن يمكن التخلص منها | BD Bioscience | 302100 | |
| مدقة Eppendorf micro لأنابيب 1.2 - 2 مل مدقات | Sigma Aldrich | Z317314 القابلة للتعقيم المستخدمة في تجانس المعدة | |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | استخدم برامج لطيفة محددة مسبقا لأنسجة معدة الفأر |
| أنابيب M (غطاء برتقالي) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| كيوبت مقياس الفلور | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| حلقة بلاستيكية معقمة | LabServ | LBSLP7202 | |
| لوحة باردة ، نظام التضمين Leica EG1160 | Leica Biosystems | غير قابل للتطبيق | |
| نظام قالب قاعدة الأنسجة ، قالب القاعدة 38 × 25 × 6 | ساكورا ، Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura ، Alphen an den Rijn | 4170 | |
| Microtome ، Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus Glass Slides | Menzel Glaser ، Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
المراجع
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
