والهدف من هذا البروتوكول إنشاء ثقافة الدماغ اليرقات السابقين فيفو المورفولوجية الأمثل لرصد إيقاعات الجزيئية الإيقاعية مع المدى الطويل fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. وتناقش أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات الدوائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
دائرة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية ينظم الإيقاعي النواتج السلوكية والفسيولوجية منسقة مع إشارات بيئية، مثل دورات اليوم/ليلة. ساعة جزيئية داخل كل تنظيم ضربات القلب العصبية يولد إيقاعات circadian في التعبير الجيني، التي تكمن وراء الإيقاعي وظائف الخلايا العصبية اللازمة لعمل الدائرة. التحقيق في خصائص التذبذب الجزيئية الفردية في مختلف أقسام فرعية لتنظيم ضربات القلب من الخلايا العصبية وتفاعلها مع الإشارات العصبية غلة فهم أفضل لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الدائرة. نقدم هنا، نهجاً الوقت الفاصل بين الفحص المجهري نيون لرصد البرتقالة الجزيئية في الخلايا العصبية على مدار الساعة لمثقف المورفولوجية اليرقات الدماغ. يسمح هذا الأسلوب تسجيل عدة أيام من إيقاعات الصحفيين الإيقاعية الفلورسنت وراثيا مرمزة في القرار خلية واحدة. يمكن أن يكون هذا الإعداد جنبا إلى جنب مع المعالجات الدوائية لتحليل استجابة في الوقت الحقيقي على مدار الساعة الجزيئية للمركبات المختلفة عن كثب. خارج إيقاعات circadian، يقدم هذا الأسلوب متعدد الأغراض في تركيبة مع التقنيات الجينية المورفولوجية القوية إمكانية دراسة العمليات العصبية أو الجزيئية المختلفة في أنسجة الدماغ حية.
المقدمة
الساعات الإيقاعية تساعد الكائنات الحية على التكيف مع التغييرات البيئية الدورية الناتجة عن دوران الأرض ح 24. عادة وراء حلقات متداخلة ردود الفعل النسخي متعدية الآلية الجزيئية للساعات الإيقاعية نطاق الأنواع1. تتألف الدارة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية المحتوية على مدار الساعة الخلايا العصبية يدمج معلومات الوقت من اليوم تنقلها العظة البيئية، مثل الضوء/الظلام (دينار) ودورات درجة الحرارة، تنسق الإيقاعات من عدد كبير صحيفة الفسيولوجية و العمليات السلوكية2،3. تنسيق إيقاعات الجزيئية مع الخلايا العصبية المدخلات والمخرجات من الأهمية بمكان لتشغيل الدائرة الإيقاعية لكن يظل مفهوما جزئيا فقط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد حلول الأسهم تحت غطاء الثقافة
- إعداد 400 مل 1 × شنايدر المتوسطة النشطة (SAM) الأمثل السابقين فيفو ثقافة العقول اليرقات (تعديل من مرجع24،25) (الجدول 1). قاسمة لمل 5 وفلاش تجميد في النتروجين السائل (LN2)، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- إعداد 1 × تشريح المحلول الملحي (DSS) بتمييع 10 × الحل الأسهم (تعديل من مرجع26) (الجدول 2).
- الكوة الفيبرينوجين إلى 10 مغ ومخزن في 4 درجات مئوية لاستخدام واحد.
تنبيه: وزن الفيبرينوجين تحت الاندفاق الصفحي، ارتداء القفازات، كما أنها ضارة. - إعداد حل ثرومبين الأسهم ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا، نحن إظهار النتائج الممثل التسجيل طويلة الأجل لمراسل الفلورسنت الإيقاعية في السابقين فيفو ثقافة الدماغ اليرقات، ويعيش التصوير نتائج تطبيق حمام PDF في التعبير مراسل.
عدم تجول اليرقات L3 التعبير عن ساعة جزيئية مراسل في--TDT و UAS-mCD8::YFP يقودها سائق العصبية على مدار ساعة كانت العالق Clk 856-gal4 (الشكل 1) في أدمغة ld. تشريح وإعدادها لثقافة طويلة الأجل خلال آخر ضوء المرحلة من دو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا وصفت لنا طريقة طويلة الأجل مجهرية الوقت الفاصل بين الأسفار من العقول اليرقات المستزرعة. يتوقف نجاح هذا النوع من التجارب على عدة عوامل، مثل صحة الثقافة، وطريقة لتجميد explant الدماغ، وكثافة الأسفار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء مراسل، الزماني والمكاني القرار، و الوصول إلى explant. وهذه العوامل يمكن أن يستبعد بعضها بعضا. على سبيل المثال، زيادة تواتر مرور الزمن يؤثر على صحة الثقافة، وتعطيل تداول explant الدماغ قد تعوق تبادل الغازات. وهكذا، إيجاد وسيلة سعيدة (لا يقصد التورية) للظواهر قيد الدراسة هو المفتاح لنجاح بروتوكول. ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نشكر روسباش مايكل له الإرشاد والدعم خلال المرحلة الأولى من تطوير هذا الأسلوب. تم تمويل هذا العمل من قبل JST المعزوفة البرنامج، مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_149893 و 31003A_169548)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC-الجنيه الاسترليني-311194)، ومؤسسة نوفارتيس "البحوث" الطبية البيولوجية الطبية (13A39) وجامعة جنيف .
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | لست متأكدا من أنهم بالضبط نفس الأشخاص الذين لدينا في المختبر. اخترت "مناسب لزراعة خلايا الحشرات" كلما كان متاحا |
| CaCl 2 < / sub > | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4< / sub>.7H 2< / sub>O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3< / sub> | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D- (+) الجلوكوز | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| مستخلص الخميرة | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| الأنسولين | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| البنسلين الستربتومايسين | سيجما ألدريتش | P4333 | |
| BIS-TRIS | سيجما ألدريتش | B4429 | |
| L- (ناقص ؛)- حمض الماليك | سيجما - ألدريتش | M7397 | |
| D- (+) - تريهالوز ثنائي هيدرات | سيجما ألدريتش | T0167 | |
| حمض السكسينيك | سيجما ألدريتش | S9512 | |
| حمض الفوماريك | سيجما ألدريتش | F8509 | |
| & ألفا ؛ - حمض الكيتوجلوتاريك | سيجما ألدريتش | K1128 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية غير المعطلة بالحرارة (FCS) الميكوبلازما والفيروسات | فحص BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| hepes-koh ، درجة الحموضة 7.4 | E & ك المنتجات العلمية | EK-654011 | |
| KCl | سيجما ألدريتش | P5405 | |
| NaH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S7903 | |
| الفيبرينوجين من بلازما البقر | كالبيوكيم (ميرك) | 341573-1 جم | تنبيه: ضار بالاستنشاق ، عند ملامسته للجلد وفي حالة ابتلاعه. التلاعب تحت التدفق |
| الصفحي الثرومبين من بلازما البقر | Sigma-Aldrich | T9549 | تنبيه: المخاطر الصحية ، استخدم القفازات |
| PDF ، NH2< / sub>-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | المصنوع | |
| شحم | الفراغ Sigma-Aldrich | 18405 | |
| طبق 35 مم ، رقم 1.5 غطاء ، قطر زجاج 20 مم ، غير مطلي | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| أطباق ثقافة الأنسجة من Corning Falcon Easy-Grip | Fisherscientific | 08-772A | |
| معقم 500 مل Steritop-GP 33 مم مرشح علوي للزجاجة الملولبة ، 0.22 & mu ؛ م | ميليبور | SCGPS05RE | |
| بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) فيلم | دوبونت | 200A تفلون FEP فيلم | |
| Millex-HV وحدة تصفية حقنة ، 0.45 & nbsp ؛ ومايكرو. م ، PVDF ، 33 ؛ مم ، | تصفية حقنة | Millex-GV | |
| جاما ، 0.22 ؛ ومايكرو. م ، PVDF ، 33 ؛ مم ، جاما المعقم | Millipore | SLGV033RS | |
| طبق تشريح زجاجي ثلاثي الآبار | أي شركة | ||
| ملقط ناعم ، مقاس 5 ، Dumont | Fine Science | Tools 11254-20 | |
| ماسح ضوئي ترادفي مقلوب TCS SP5 مجهر متحد البؤر ، مع ماسح ضوئي رنين وكاشفات مضاعف صور HyD غرفة | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| خدمات تصوير الحياة | CUBE & نظام التحكم في درجة الحرارة BOX ، جهاز | ||
| التحكم في الرطوبة على سطح المسرح | لخدمات | ||
| في الماء موزع صغير مخصص: موزع ، سلسلة MP6 للمضخة الصغيرة الممتدة وبرنامج التحكم في الهدف الغمر | إنشاء المكدس LEICA CMS GmbH | ||
| SUM-stack والبرنامج المساعد الانجراف ثلاثي الأبعاد التصحيح | ImageJ | ||
| 10x التكرار | التكراري AutoQuant وبرنامج |
المراجع
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
