يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57015

⸱

يناير 19, 2018

 , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول إنشاء ثقافة الدماغ اليرقات السابقين فيفو المورفولوجية الأمثل لرصد إيقاعات الجزيئية الإيقاعية مع المدى الطويل fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. وتناقش أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات الدوائية.

الملخص

دائرة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية ينظم الإيقاعي النواتج السلوكية والفسيولوجية منسقة مع إشارات بيئية، مثل دورات اليوم/ليلة. ساعة جزيئية داخل كل تنظيم ضربات القلب العصبية يولد إيقاعات circadian في التعبير الجيني، التي تكمن وراء الإيقاعي وظائف الخلايا العصبية اللازمة لعمل الدائرة. التحقيق في خصائص التذبذب الجزيئية الفردية في مختلف أقسام فرعية لتنظيم ضربات القلب من الخلايا العصبية وتفاعلها مع الإشارات العصبية غلة فهم أفضل لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الدائرة. نقدم هنا، نهجاً الوقت الفاصل بين الفحص المجهري نيون لرصد البرتقالة الجزيئية في الخلايا العصبية على مدار الساعة لمثقف المورفولوجية اليرقات الدماغ. يسمح هذا الأسلوب تسجيل عدة أيام من إيقاعات الصحفيين الإيقاعية الفلورسنت وراثيا مرمزة في القرار خلية واحدة. يمكن أن يكون هذا الإعداد جنبا إلى جنب مع المعالجات الدوائية لتحليل استجابة في الوقت الحقيقي على مدار الساعة الجزيئية للمركبات المختلفة عن كثب. خارج إيقاعات circadian، يقدم هذا الأسلوب متعدد الأغراض في تركيبة مع التقنيات الجينية المورفولوجية القوية إمكانية دراسة العمليات العصبية أو الجزيئية المختلفة في أنسجة الدماغ حية.

المقدمة

الساعات الإيقاعية تساعد الكائنات الحية على التكيف مع التغييرات البيئية الدورية الناتجة عن دوران الأرض ح 24. عادة وراء حلقات متداخلة ردود الفعل النسخي متعدية الآلية الجزيئية للساعات الإيقاعية نطاق الأنواع1. تتألف الدارة تنظيم ضربات القلب الإيقاعية المحتوية على مدار الساعة الخلايا العصبية يدمج معلومات الوقت من اليوم تنقلها العظة البيئية، مثل الضوء/الظلام (دينار) ودورات درجة الحرارة، تنسق الإيقاعات من عدد كبير صحيفة الفسيولوجية و العمليات السلوكية2،3. تنسيق إيقاعات الجزيئية مع الخلايا العصبية المدخلات والمخرجات من الأهمية بمكان لتشغيل الدائرة الإيقاعية لكن يظل مفهوما جزئيا فقط.

في المورفولوجية، في صميم عقارب الساعة الجزيئية، ينشط هيتيروديمير ساعة/دورة (CLK/الفتوة) النسخ من الفترة (الواحد) و زمان (تيم). تشكل مجمعا في وتيم وإدخال النواة، حيث أنها تكبح النشاط الترانسكربتي CLK/الفتوة، ونتيجة لذلك النسخ الخاصة بهم. أنظمة بوستترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال يسبب التأخير بين النسخ CLK/الفتوة-التوسط والقمع من جانب في/تيم، ضمان توليد سيركا ذبذبات الجزيئية 24-ح1،،من34 . حوالي 150 من الخلايا العصبية التي تحتوي على النموذج الجزيئي الساعات هذه دائرة للتحكم في سلوك الكبار الإيقاعية الذباب5. كثير أبسط لم تعمل بكامل طاقتها الإيقاعية دارة تتكون من 3 مجموعات من الخلايا العصبية على مدار الساعة-5 البطني الجانبي الخلايا العصبية (اللازم؛ 4 PDF-الإيجابي اللازم وواحد سالب PDF لنف، انظر أدناه)، 1s العصبية الظهرية 2 (DN1s) و 2s العصبية الظهرية 2 (DN2s)-موجود في اليرقات الدماغ6،7.

الدائرة الإيقاعية اليرقات بسيط يوفر نموذجا ممتازا لدراسة التفاعلات بين الاتصالات بين الخلايا العصبية والبرتقالة الجزيئية. استخدام مراسلنا الفلورسنت المطورة حديثا في--TDT، الذي يحاكي المستويات كل البروتين وموقعها سوبسيلولار، وسعينا إلى وصف ديناميات الجزيئية البرتقالة في مجموعات مختلفة على مدار الساعة العصبية فرعية في الدائرة الإيقاعية اليرقات 8. وعلاوة على ذلك، مع العلم بالدور الرئيسي لمعامل تفريق الصباغ neuropeptide (PDF) التي تنتجها اللازم 4 في تنظيم إيقاعات circadian في ال10،الخلايا العصبية المستوى9،11، أردنا النظر المباشر أثر PDF على الساعات الجزيئية. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة لرصد الجينات الإيقاعية إيقاعات في الدماغ اليرقات explant على مدى عدة أيام من الوقت الفاصل بين الفحص المجهري [كنفوكل]. وكان أيضا تكييف البروتوكول لفحوصات الدوائية لاختبار تأثير PDF أو غيرها من المركبات على المستوى في--TDT. وهكذا، وتكييف يتألف من إتاحة ثقافة explant الدماغ لتطبيق المخدرات وزيادة دقة الزمانية والتصوير لمدة أقصر.

السابقين فيفو ثقافة العقول المورفولوجية لمراحل تنموية مختلفة قد حددت سابقا12،13،،من1415،16،17 ،18. بينما استخدمت هذه البروتوكولات لتصوير مختلف الظواهر البيولوجية، البعض منهم غير متوافقة مع التصوير في القرار خلية واحدة أو لا تدعم الثقافة لأكثر من عدة ساعات. تشمل أساليب بديلة لإجراء تصوير حية طويلة الأجل من الخلايا العصبية الإيقاعية في المورفولوجية تصوير الإضاءة الحيوية الجزيئية إيقاعات19،،من2021 وتصوير الأسفار مؤشر الكالسيوم مع الورقة الخفيفة الميكروسكوب22،23. على الرغم من أن التصوير بالإضاءة الحيوية يمكن تحقيق أعلى الأزمنة والفحص المجهري الورقة الخفيفة يمكن أن تكون قابلة للتكيف للتصوير في فيفو ، أنها تقتصر على القرار المكانية وتتطلب أنظمة المجهر المتخصصة.

لتلائم الطريقة الموصوفة هنا هو تصور إشارات مضيئة في ثقافة الجامعة الدماغ في القرار خلية واحدة على مدى عدة أيام. هذه طريقة سهلة ومرنة يمكن تكييفها وفقا للصورة مثقف الكبار يطير العقول والتجارب الدوائية لدراسة العديد من مشاكل مختلفة في بيولوجيا الأعصاب المورفولوجية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد حلول الأسهم تحت غطاء الثقافة

  1. إعداد 400 مل 1 × شنايدر المتوسطة النشطة (SAM) الأمثل السابقين فيفو ثقافة العقول اليرقات (تعديل من مرجع24،25) (الجدول 1). قاسمة لمل 5 وفلاش تجميد في النتروجين السائل (LN2)، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. إعداد 1 × تشريح المحلول الملحي (DSS) بتمييع 10 × الحل الأسهم (تعديل من مرجع26) (الجدول 2).
  3. الكوة الفيبرينوجين إلى 10 مغ ومخزن في 4 درجات مئوية لاستخدام واحد.
    تنبيه: وزن الفيبرينوجين تحت الاندفاق الصفحي، ارتداء القفازات، كما أنها ضارة.
  4. إعداد حل ثرومبين الأسهم في سام (1500 المعاهد الوطنية للصحة وحدة/mg) والكوة إلى 10 ميليلتر، فلاش تجميد في LN2 وتبقى في-80 درجة مئوية.
    تنبيه: ارتداء قفازات عند التعامل مع ثرومبين كما أنها ضارة.
  5. الكوة حل الأسهم من 100 × البنسلين والستربتوميسين. تبقى عند-20 درجة مئوية.
  6. قص الدوائر من غشاء تترافلوروايثيلين (PTFE) (انظر الجدول المواد) إلى الحجم الذي يناسب داخل طبق أسفل الزجاج. شطف لهم في 70% EtOH وثم يعقم dH2تعقيم سين والجاف تحت الاندفاق الصفحي مع الأشعة فوق البنفسجية. نضع في طبق بتري معقم. الاستخدام مرة واحدة.
    ملاحظة: PTFE هو غشاء مرن المليئة بالثغرات التي تسمح بتبادل الغازات ويمنع التبخر أثناء التسجيل طويلة الأجل المتوسط.

2-الوقت الفاصل بين الفحص المجهري الإعداد

ملاحظة: الإعداد التالي مجهر الماسح ضوئي مقلوب جنبا إلى جنب [كنفوكل] (انظر الجدول المواد) مزودة بماسح ضوئي رنانة (8,000 هرتز). ويشمل النظام كاشف مضاعف صور حساسة للغاية، مما يمنع الضيائية وفوتوبليتشينج جنبا إلى جنب مع الماسح الضوئي رنانة. يتم التحكم في درجة الحرارة والرطوبة داخل دائرة البيئة مجهر (انظر الجدول المواد) التي تغطي معظم المجهر.

  1. ضع دائرة رطوبة المرحلة الأعلى.
  2. قم بتشغيل وحدات تحكم درجة الحرارة والرطوبة حجته إلى الدائرة المجهر 25 درجة مئوية و 80% من الرطوبة.
  3. للقيام بتجارب في الظلام المستمر (دد)، تغطي الدائرة البيئية المجهر قماش غير شفاف (ما لم تكن الدائرة مجهر مصنوع من مادة غير شفافة).
  4. إذا كان استخدام الماء غمر وهدف، ضع "موزع الصغرى غمر المياه" على رأس الهدف وبرنامج بروتوكول مع برنامج "تحكم الهدف أوتويميرسيون" الاستغناء عن المياه بمعدل ثابت من خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
    ملاحظة: ينصح أهداف غمر المياه جنبا إلى جنب مع موزع المياه أو الجافة الهدف العدسة لتصوير حية طويلة الأجل، كنوع آخر من المتوسطة الغمر أن تجف.
  5. وضع حامل صحن بيتري على المسرح، داخل قاعة الرطوبة.
  6. إطلاق برنامج المجهر وحدد وضع الماسح الضوئي مدوية من مربع الحوار الأول. حدد 'موافق' لتهيئة المسرح عند مطالبتك بذلك. انتقل إلى علامة التبويب التكوين وتكوين الأجهزة للتبديل على خطوط الليزر ذات الصلة.
  7. الذهاب للحصول على علامة التبويب ولوحة س وص تحديد وضع ثنائية الاتجاه وتعيين معلمات اقتناء الصورة.
    ملاحظة: وصف التصوير الإعداد المعروضة هنا (الشكل 2و الشكل 3 و فيلم 1) هو الأمثل لمراقبة الإيقاعية التعبير للصحفيين الفلورسنت محددة. المعلمات التالية تم اختيارها لتتناسب مع مواصفات لدينا أفضل: 40 س الماء الغمر الهدف، 8 X الخط المتوسط مع 512 × 512 صورة القرار. لتصوير متعددة الألوان، صورة متسلسلة مطلوب شراء عند الطول الموجي الانبعاثات fluorophore واحدة والطول الموجي الإثارة لتداخل آخر (هنا، الأطوال الموجية للانبعاثات بروتين فلوري الصفراء (يفب) والطماطم الإثارة التداخل). اختيار طريقة متسلسلة "بين كومة" كما أنها أسرع ولا يكاد حركة الخلايا العصبية على مدار الساعة أثناء الحصول على كدسة Z. إعدادات الفحص المجهري ينبغي تكييفها لتناسب الهدف من كل تجربة.

3-الإعداد للدماغ اليرقات Explant الثقافة

ملاحظة: الإجراء بأكمله من تشريح لتضمين explants الدماغ يأخذ ~ 30 دقيقة.

  1. إعداد الكواشف تحت غطاء ثقافة.
    1. ذوبان الجليد قاسمة ثرومبين وتبقى في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة التضمين (الخطوة 3، 3). الاستخدام مرة واحدة.
    2. ذوبان الجليد بسرعة قاسمة سام عند 37 درجة مئوية والحفاظ على الجليد لاستخدام واحد.
    3. إضافة سام قاسمة 10 مغ من الفيبرينوجين إلى 10 ملغ/مل ونفض الغبار برفق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وخلال الخطوة التضمين (الخطوة 3، 3). الاستخدام مرة واحدة.
      ملاحظة: لا احتضان الفيبرينوجين الحل أكثر من ح 2 كما أنه يبدأ في بلمرة.
    4. ذوبان الجليد قاسمة للأسهم x 100 البنسلين والستربتوميسين. إعداد 2.5 مل سام يحتوي على 1 × البنسلين-ستربتوميسين (سام/المضادات الحيوية). الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: مخزن x 100 المتبقية الأسهم البنسلين والستربتوميسين عند 4 درجة مئوية تصل إلى شهر واحد.
    5. إعداد قاسمة 500 ميليلتر من سام المتبقية. الحفاظ على الجليد.
    6. لتصوير طويلة الأجل، تطبيق يعقم فراغ الشحوم إلى الجزء البلاستيك من أسفل الطبق أسفل الزجاج (الشكل 1A) وتعقيم تحت الاندفاق الصفحي مع الأشعة فوق البنفسجية.
  2. تشريح الجهاز العصبي المركزي والبطني العصب الحبل.
    1. تنظيف الملقط و 2 × أطباق تشريح الزجاج ثلاثة آبار مع 70% EtOH. من أجل 400 ميليلتر من مفاجآت صيف دبي إلى 4 آبار و 400 ميليلتر من سام في بئر واحدة. الحفاظ على الجليد.
    2. يستخرج يطير المتوسطة المحتوية على اليرقات واختيار غير تجول اليرقات الطور الثالث (L3) مع الملقط. شطف لهم تباعا في 2 آبار مليئة بمفاجآت صيف دبي. الاحتفاظ بها في البئر مليئة بمفاجآت صيف دبي الثالثة على الجليد أنيسثيتيزيس اليرقات.
      ملاحظة: L3 يدوم يومين تقريبا عند 25 درجة مئوية. لمراقبة الدماغ في الفترة الزمنية ذات الصلة فسيولوجيا اخترنا استخدام غير تجول اليرقات L3. بدء مجموعات فرعية أخرى من الخلايا العصبية على مدار الساعة، مثل لام-اللازم و DN3s، التي سيتم تشكيلها في التيه المرحلة L3 ولكنها ليست بالضرورة ركوب الدراجات بعد (البيانات لا تظهر). ولذلك، على الرغم من أنه من الممكن للصورة ركوب الدراجات على مدار الساعة من الخلايا العصبية في هذه المرحلة (البيانات لا تظهر)، من المهم لتمييز الخلايا العصبية الوظيفية الفعل اليرقات على مدار الساعة بعناية من البلدان النامية منها لتحليل البيانات. عدم التجول L3 تظهر حوالي 4 إلى 4.5 يوما بعد بيضة زرع عند 25 درجة مئوية. لاستخدام هذا البروتوكول لدراسة إيقاعات circadian، قم بمزامنة (انترين) اليرقات النامية في ح 12/12 ح LD دورات عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام قبل جمع اليرقات L3.
    3. تشريح أدمغة اليرقات مع الملقط غرامة في البئر مليئة بمفاجآت صيف دبي 4، الذي لم يستخدم الشطف اليرقات، باستخدام أسلوب من الداخل إلى الخارج27.
      1. بإيجاز، قص اليرقة في اثنين، ولطف قرصه هوكس الفم مع زوج من الملقط ونشمر من الداخل إلى الخارج في جدار الجسم استخدام زوج آخر من الملقط، وبالتالي تعريض الدماغ. مجاناً الدماغ بالاستغناء عن جميع القصبة الهوائية والأعصاب التي تعلق على بقية الجسم.
      2. نضح الدماغ في حوالي 3 ميليلتر من مفاجآت مع ماصة 20 ميليلتر (قبل شطفها بمفاجآت صيف دبي)، والاستغناء عن في بئر مملوءة سام. كرر هذا الإجراء للعقول يصل إلى 7.
        ملاحظة: ينبغي إجراء تشريح على سطح بارد للحفاظ على اليرقات تخديره والدماغ مبردة. على سبيل المثال، ضع طبق تشريح على كتلة تبريد متصل بمضخة توزيع المياه المبردة الجليد. S تحيط ~ 30 إجراء تشريح للمخ. من المهم الاحتفاظ بأقراص imaginal العين/باللوامس يعلق على العقول والحبل البطني العصب سليمة. تمزيق هذه الأجزاء سوف تلحق الضرر الدماغ ويقلل من جودة الثقافة. أيضا، تجنب تعريض الأدمغة في الهواء. قبل يسفط الدماغ الأولى، ماصة صعودا وهبوطاً مفاجآت صيف دبي التي تحتوي على أجزاء من اليرقات تشريح، كما أنه يمنع العقول من الالتصاق بالجدار من الحافة.
  3. تضمين explants الدماغ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وتركيب (~ 20 دقيقة).
    1. غمر تشريح دماغ في حل العامل الفيبرينوجين (الفيبرينوجين التركيز النهائي ~3.3 ملغ/مل، ميليلتر 10.5 كل الدماغ) على النحو التالي:
    2. نضح ميليلتر 3.5 سام/المضادات الحيوية (مع تلميح نفسها المستخدمة في المقطع 3.2.3). نضح تشريح دماغ من تشريح جيدا إلى نصيحة ماصة نفسه دون الاستغناء عن المتوسط سام/المضادات الحيوية في التلميح.
    3. الاستغناء عن الدماغ والمتوسطة على غطاء طبق بتري معقم. إضافة آخر ميليلتر 3.5 سام/المضادات الحيوية و 3.5 ميليلتر من الفيبرينوجين الحارة/سام 10 ملغ/مل الحل في القائمة التي تحتوي على الدماغ. مزيج الحل حول الدماغ بلطف بيبيتينج مع طرف ماصة 20 ميليلتر.
      ملاحظة: استخدام ماصة بدلاً من الملقط في هذه الخطوة تجنب التشديد على الدماغ.
    4. تأخذ 2 ميليلتر من الحل العامل الفيبرينوجين من الإسقاط وتنطبق على ساترة للطبق أسفل الزجاج على شكل دائرة صغيرة. إضافة 0.8 ميليلتر من ثرومبين وتخلط بسرعة كبيرة مع تلميح ماصة. يتم تحويلها إلى فيبرينوجين الفيبرينوجين ويبدأ بلمرة.
    5. يأخذ الدماغ الذي يجلس في الفيبرينوجين العامل (الخطوة 3.3.1) حل بين زوج من الملقط ووضعه في المصفوفة بمجرد مصفوفة فيبرينوجين بيضاء مرئية. توجيه على الجانب الأمامي من الدماغ إلى أسفل (لتصوير الخلايا العصبية على مدار الساعة). دفع به إلى أسفل أقرب ما يمكن إلى الزجاج غطاء. وتتألف من طبقات من فيبرينوجين فيبرينوجين جلطة. اختر طبقة واحدة وإضعاف أعلى الدماغ مع الحركات الصغيرة ولطيف دون فصل المصفوفة.
      1. كرر 2 إلى 3 مرات من أجزاء مختلفة من جلطة لتحقيق الاستقرار في المخ.
        ملاحظة: عند التعامل مع الدماغ بالملقط، كن حذراً لا الجافة أو تفرض عليه من إجهاد البدني.
    6. إضافة 20 ميليلتر سام/المضادات الحيوية على رأس الدماغ المضمنة لوقف عمل ثرومبين.
    7. كرر الإجراء لجبل على العقول الباقية. فمن الممكن لتضمين تصل إلى 5 إلى 6 العقول على طبق أسفل زجاج.
    8. لتصوير حية طويلة الأجل، إضافة 600 ميليلتر سام/المضادات الحيوية في البئر الداخلية (الجزء الزجاج). ضع غشاء PTFE قبل قطع فوق المتوسط والتمسك بها للشحوم الفراغ المطبق على الجزء البلاستيك من الأسفل (3.1.5) (الشكل 1A).
    9. لفحوصات الدوائية، ملء الطبق مع 2 مل من سام/المضادات الحيوية (الشكل 1B).
      ملاحظة: مهم جداً لتجنب تبخر المتوسط، كما osmolality المتوسط أمر حاسم لبقاء الخلايا العصبية. ولذلك، من الضروري لتجارب التصوير الطويلة الأجل، ختم الطبق الثقافة مع غشاء PTFE. بينما لإجراء التجارب على المدى القصير، ختم غشاء غير مطلوب طالما الطبق مليئة 2 مل متوسطة ورصدها في دائرة هوميديفيد.

4-الحصول على الصور الوقت الفاصل بين

  1. ضع الطبق أسفل الزجاج على حامل صحن بيتري داخل قاعة الرطوبة المرحلة الأعلى.
  2. انتقل إلى لوحة z-المكدس في علامة التبويب الحصول على وتعيين الخطوات z-مقطع من برنامج مجهر (2 ميكرومتر × ~ 40 في هذه التجارب هو مبين في الشكل 2 و الشكل 3، و فيلم 1). تعيين بداية z-مكدس في الطائرة الأبعد عن ساترة والنهاية في سطح explant الدماغ، قريبة ساترة. على الرغم من حركات الدماغ لا يعتد بها، وإضافة المقاطع z إضافية في بداية ونهاية z-المكدس.
  3. انتقل إلى علامة & العثور على الحصول على الصور متعددة موقف الفريق والتشكيل. مع هدف X 40، يمكن التقاط 1 الدماغ الكرة داخل مجال الرؤية
  4. الذهاب للحصول على وضع الفريق وتحديد إكسيزت (z-مكدس مرور الزمن). انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين معلمات الفاصل الزمني وتواتر الوقت المفضل.
    ملاحظة: الحصول على الوقت الفاصل بين الصور مع التردد المطلوب. ملاحظة أن تصوير حية طويلة الأجل (ح 24-72) مع وقت انقضاء فترة أقصر من ح 2 يميل إلى النتائج في الخلايا العصبية ركوب أقل، ربما لأنه يقلل من الجدوى من الخلايا العصبية. توسع حجم البيانات كمعدل الزيادات اقتناء الصورة، مما يجعل تحليل البيانات وتخزين أكثر تحديا.

5-المعالجة من Explants الدماغ مع "العيش التصوير القصيرة الأجل"

ملاحظة: الإجراء التالي هو أساسا نفس لتصوير طويلة الأجل ولكن لا تتطلب غشاء PTFE. لتجنب تعريض الأدمغة الضوء الأزرق عند إضافة المواد الكيميائية إلى الثقافة، يجب وضع المجهر في غرفة مظلمة مع الضوء الأحمر.

  1. انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين الفاصل الزمني المطلوب وعدد من المسح الضوئي للحصول على بيانات خط الأساس قبل تطبيق المخدرات. بدء المسح الضوئي.
  2. خط الأساس بعد اكتمال المسح الضوئي، ورفع رئيس النظام مجهر المسح الضوئي. قم بإزالة غطاء وحدة التحكم بالرطوبة أعلى مرحلة وعناية غطاء الطبق أسفل الزجاج دون نقله.
  3. إزالة المقدار المناسب من الثقافة المتوسطة إذا لزم الأمر. إضافة الحل التجريبي في الأجل المتوسط، ومزيج بعناية والغاية بلطف، مع ماصة باستور معقمة دون لمس explants الدماغ.
    ملاحظة: لتطبيق حمام من قوات الدفاع الشعبي، استخدام 2 ميكرومتر حل الأسهم قوات الدفاع الشعبي (في [دمس] 10%).
  4. استبدال الأغطية للطبق أسفل الزجاج وقاعة الرطبة، ومسح الرأس. في حالة استخدام، قم بتغيير موضع القماش الأسود معتم حول قاعة المجهر.
  5. معرفة ما إذا كان العقل المدبر في مواقعها الأصلية في وضع المسح الضوئي مباشرة. تعديل إذا لزم الأمر.
  6. انتقل إلى لوحة "اكتساب الوقت" وتعيين الفاصل الزمني المطلوب وعدد من المسح الضوئي. بدء المسح الضوئي.
    ملاحظة: هنا نحن اختبار الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة كل ساعة لما يصل إلى 10 س.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، نحن إظهار النتائج الممثل التسجيل طويلة الأجل لمراسل الفلورسنت الإيقاعية في السابقين فيفو ثقافة الدماغ اليرقات، ويعيش التصوير نتائج تطبيق حمام PDF في التعبير مراسل.

عدم تجول اليرقات L3 التعبير عن ساعة جزيئية مراسل في--TDT و UAS-mCD8::YFP يقودها سائق العصبية على مدار ساعة كانت العالق Clk 856-gal4 (الشكل 1) في أدمغة ld. تشريح وإعدادها لثقافة طويلة الأجل خلال آخر ضوء المرحلة من دو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا وصفت لنا طريقة طويلة الأجل مجهرية الوقت الفاصل بين الأسفار من العقول اليرقات المستزرعة. يتوقف نجاح هذا النوع من التجارب على عدة عوامل، مثل صحة الثقافة، وطريقة لتجميد explant الدماغ، وكثافة الأسفار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء مراسل، الزماني والمكاني القرار، و الوصول إلى explant. وهذه العوامل يمكن أن يستبعد بعضها بعضا. على سبيل المثال، زيادة تواتر مرور الزمن يؤثر على صحة الثقافة، وتعطيل تداول explant الدماغ قد تعوق تبادل الغازات. وهكذا، إيجاد وسيلة سعيدة (لا يقصد التورية) للظواهر قيد الدراسة هو المفتاح لنجاح بروتوكول. ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نشكر روسباش مايكل له الإرشاد والدعم خلال المرحلة الأولى من تطوير هذا الأسلوب. تم تمويل هذا العمل من قبل JST المعزوفة البرنامج، مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_149893 و 31003A_169548)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC-الجنيه الاسترليني-311194)، ومؤسسة نوفارتيس "البحوث" الطبية البيولوجية الطبية (13A39) وجامعة جنيف .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
KH2PO4Sigma-AldrichP5655لست متأكدا من أنهم بالضبط نفس الأشخاص الذين لدينا في المختبر. اخترت "مناسب لزراعة خلايا الحشرات" كلما كان متاحا
CaCl 2 < / sub >Sigma-AldrichC7902
MgSO4< / sub>.7H 2< / sub>OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3< / sub>Sigma-AldrichS5761
D- (+) الجلوكوزSigma-AldrichG7021
مستخلص الخميرةSigma-AldrichY1000
الأنسولينSigma-AldrichI0516-5ML
البنسلين الستربتومايسينسيجما ألدريتشP4333
BIS-TRISسيجما ألدريتشB4429
L- (ناقص ؛)- حمض الماليكسيجما - ألدريتشM7397
D- (+) - تريهالوز ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشT0167
حمض السكسينيكسيجما ألدريتشS9512
حمض الفوماريكسيجما ألدريتشF8509
& ألفا ؛ - حمض الكيتوجلوتاريكسيجما ألدريتشK1128
مصل ربلة الساق الجنينية غير المعطلة بالحرارة (FCS) الميكوبلازما والفيروساتفحص BioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
hepes-koh ، درجة الحموضة 7.4E & ك المنتجات العلميةEK-654011
KClسيجما ألدريتشP5405
NaH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichS5011
السكروزسيجما ألدريتشS7903
الفيبرينوجين من بلازما البقركالبيوكيم (ميرك)341573-1 جمتنبيه: ضار بالاستنشاق ، عند ملامسته للجلد وفي حالة ابتلاعه. التلاعب تحت التدفق
الصفحي الثرومبين من بلازما البقرSigma-AldrichT9549تنبيه: المخاطر الصحية ، استخدم القفازات
PDF ، NH2< / sub>-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificالمصنوع
شحمالفراغ Sigma-Aldrich18405
طبق 35 مم ، رقم 1.5 غطاء ، قطر زجاج 20 مم ، غير مطليMatTekP35G-1.5-20-C
أطباق ثقافة الأنسجة من Corning Falcon Easy-GripFisherscientific08-772A
معقم 500 مل Steritop-GP 33 مم مرشح علوي للزجاجة الملولبة ، 0.22 & mu ؛ مميليبورSCGPS05RE
بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) فيلمدوبونت200A تفلون FEP فيلم
Millex-HV وحدة تصفية حقنة ، 0.45 & nbsp ؛ ومايكرو. م ، PVDF ، 33   ؛ مم ،تصفية حقنةMillex-GV
جاما ، 0.22   ؛ ومايكرو. م ، PVDF ، 33   ؛ مم ، جاما المعقمMilliporeSLGV033RS
طبق تشريح زجاجي ثلاثي الآبارأي شركة
ملقط ناعم ، مقاس 5 ، DumontFine ScienceTools 11254-20
ماسح ضوئي ترادفي مقلوب TCS SP5 مجهر متحد البؤر ، مع ماسح ضوئي رنين وكاشفات مضاعف صور HyD غرفةLeica microsystem CMS GmbH
خدمات تصوير الحياةCUBE & نظام التحكم في درجة الحرارة BOX ، جهاز
التحكم في الرطوبة على سطح المسرحلخدمات
في الماء موزع صغير مخصص: موزع ، سلسلة MP6 للمضخة الصغيرة الممتدة وبرنامج التحكم في الهدف الغمرإنشاء المكدس LEICA CMS GmbH
SUM-stack والبرنامج المساعد الانجراف ثلاثي الأبعاد التصحيحImageJ
10x التكرارالتكراري AutoQuant وبرنامج
حسب الطلب وحدة المعقمة SLHV033RS التحكم في درجة الحرارة المصمم خصيصا التصوير الافتراضي للغمر التلقائي ، Imaris

المراجع

  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
  3. Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
  4. Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
  5. Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
  6. Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
  7. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
  8. Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560(2017).
  9. Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
  10. Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
  11. Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
  12. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  13. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
  15. Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699(2014).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
  17. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  18. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  19. Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
  20. Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
  21. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
  22. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
  23. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
  24. Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
  25. Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
  26. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85(2006).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327(2015).
  30. Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
  31. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
  32. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497(2015).
  33. Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
  34. Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
  35. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
  36. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

دماغ يرقات ذبابة الفاكهةالمجهرية بنظام التصوير المتقطععصبونات الساعة البيولوجيةالتضمين في مصفوفة الفيبرينالمراسلات الفلورية الجينيةتحليل الإنتروبيا القصوىالتدخلات الدوائيةزراعة الدماغ خارج الجسم
Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.