مقالة منهجية

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين

DOI:

10.3791/57016

⸱

يناير 29, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيراً ما يتم تغيير آليات جينية في الدبقي. ويمكن استخدام إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لدراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية في الدبقي التي تنتج عن التغييرات في هيستون التعديلات التي تنظم النسخ الكروماتين هيكل والجينات. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إشراك تعديلات جينية في التنمية والتقدم من الدبقي. التغييرات في مثلايشن وأسيتيليشن مروجين والمناطق التنظيمية المسرطنة والمكثفات الورم يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني وتلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لاورام الدماغ. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية (رقاقة) هو تقنية شعبية يتيح الكشف عن التعديلات أو غيرها من البروتينات أحكام ملزمة للحمض النووي. على النقيض من رقاقة cross-linked، في رقاقة الأصلي، لا تعامل الخلايا مع فورمالدهايد تساهمي ربط البروتين بالحمض النووي. وهذا مفيد لأنه في بعض الأحيان قد إصلاح crosslinking البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي فقط عابر وليس لها أهمية وظيفية في تنظيم الجينات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم رفع الأجسام المضادة عموما ضد الببتيدات غير المثبتة. لذلك، يتم زيادة خصوصية جسم في الشريحة الأصلية. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن رقاقة الأصلي لا ينطبق إلا على دراسة هيستونيس أو غيرها من البروتينات التي تربط محكم للحمض النووي. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ موريني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحداث جينية متكررة في جليوماس، والمرجح أن تلعب دوراً مهما في نشوء المرض ورم. وفي الواقع، في طب الأطفال الدبقي عالية الجودة، الطفرات في الجينات ترميز المتغيرات هيستون H3.3 و H3.1 تحدث بشكل متكرر1. الطفرات تؤثر التعديلات هيستون وعواقب جينية رئيسية2،3. تحدث الطفرات المتكررة في إيسوسيتراتي نازعة الجينات 1/2 (IDH1/2)، طفرة التي تمنع هيستون تعتمد α-كجم والحمض النووي دي-ميثيلاسايس، والتعديلات الوراثية في المنظمين الكروماتين الأخرى مثل أتركس و DAXX في المراهقين إلى الطيف الكبار، 4. ولذلك، من الأهمية لدراسة كيفية تغيير الطفرات التي تؤثر على المنظمين جينية هيكل الكروماتين والتعديلات التنظيمية هستون، الذي، بدوره، أثرا محسوسا الترنسكربيتوم ورم الخلايا.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) أداة قوية تستخدم لتقييم أثر إدخال تعديلات جينية في الجينوم5،،من67. في رقاقة الأصلي، الكروماتين يهضم مع نوكلياسي ميكروكوككال (مناسى)، إيمونوبريسيبيتاتيد استخدام جسم مضاد المثارة ضد بروتين الفائدة، وثم هو تنقية الحمض النووي من مجمع الكروماتين إيمونوبريسيبيتاتيد6. خلايا غير ثابتة أثناء الإجراء حتى هذه التقنية قابلة للتطبيق لدراسة البروتينات التي تتفاعل محكم مع الحمض النووي6فقط. نظراً لغياب العابرة للربط الإيدز خصوصية جسم حيث عادة ما يتم رفع الأجسام المضادة ضد الببتيدات أو البروتينات غير المثبتة7. وبالإضافة إلى ذلك، أنه ليس هناك أي خطوة كروسلينكينج، وهذا يقلل من فرص تحديد التفاعلات عابر البروتين-الحمض النووي التي هي غير محددة ولا التنظيمية7،8. يمكن استخدام شرائح التعرف على إثراء التعديلات هستون في منطقة محددة بالجينوم. هنا، نحن بالتفصيل على بروتوكول لأداء رقاقة الأصلي في نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من وراثيا تصميم نماذج الماوس من الدبقي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميتشيغان.

1-جيل من ورم الدماغ NS واستزراع الظروف.

  1. إعداد متوسط الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) مع دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة/F12B27 الملحق (س 1)، N2 الملحق (س 1)، وكاشف مضادات الميكروبات. الملحق المتوسطة مجلس الأمن القومي اليوم للاستخدام مع الإنسان المؤتلف غشائي عامل النمو (مماثلة)، وعامل النمو الأساسية-تنتجها الخلايا الليفية (الأجيال) بتركيز نهائي من 20 نانوغرام/مليلتر كل.
  2. حمل ورم الدماغ في الماوس استخدام نظام ينقول النائمة التي يتم حقن البلازميدات ترميز المسرطنة أو شرنا استهداف الورم المكثفات في البطينين الأفقي للمواليد الجدد لتوليد أورام الدماغ عفوية9. حدد ماوس مع وجود ورم كبير، الذي يتأكد بتصوير الإضاءة الحيوية.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلاً حول بنيات "النظام ينقول الجمال النوم" وبلازميد المستخدمة في كالينيسكو et al. 9.
    1. الصورة في الفئران، حقن 100 ميليلتر من 30 ملغ/مل لوسيفرين حل إينترابيريتونيلي باستخدام إبرة قياس 26.
    2. 5 دقيقة بعد حقن لوسيفرين، تخدير الحيوان استخدام تشكيل غرفة تخدير مع تدفق الأوكسجين/isoflurane تعيين إلى إيسوفلوراني 2%.
    3. عندما يتم تخديره من الحيوانات (عادة ما تكون من 2-3 دقيقة)، ضع الحيوانات في دائرة الإضاءة الحيوية مع الأكسجين إيسوفلوراني تعيين إلى إيسوفلوراني 2%. إذا كانت الحيوانات تحت التخدير لمدة تزيد على 5 دقائق، استخدم مرهم العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    4. صورة الفئران باستخدام في فيفو بصري تصوير النظام مع المعلمات التالية: التعرض التلقائي، binning الكبيرة، والفتحة f = 1. المعلمة للنظر ورم كبير هو الإضاءة الحيوية > خ الفوتونات/s/سم26 10.
  3. Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من استنشاق isoflurane مخدر في دائرة مغلقة، تحقق برشة تو أنه تم تخديره من الحيوان، وقطع رأس الماوس.
  4. استخراج الدماغ وتشريح كما هو موضح سابقا في كالينيسكو et al. 9.
  5. وضع الدماغ في 10 سم طبق بيتري. استخدام الفلورية تشريح مجهر تعيين القناة الفلورسنت مناسب و 0.3 X التكبير، إذا كان الورم الناجم عن تعرب عن بروتين فلوري، خلاف ذلك تحديد كتلة الورم بالاختلافات في أنسجة اللون والملمس. استخدام المبضع، والملقط لفصل أنسجة الورم من الدماغ العادي.
  6. فرم الورم إلى قطع صغيرة في طبق بتري. مكان الورم تشريح في أنبوب 1.5 مل مع 300 ميليلتر من المتوسط القومي.
  7. استخدام مدقة بيليه بلاستيك القابل للتصرف الذي يناسب على جدران أنبوب ميكروسينتريفوجي المخروطية مجانسة الورم بلطف. أضف 1 مل من الخلية المفرزة المتوسطة واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام مدقة قد قتل بعض الخلايا. إذا أراد القارئ إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية، قد أغفل استخدام مدقة.
  8. تمرير تعليق خلية من الخطوة 1، 7 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وغسل المصفاة مع 25 مل متوسط القومي.
  9. الطرد المركزي من التعليق على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه إلى 6 مل متوسط القومي.
  10. لوحة تعليق خلية ورم من الخطوة 1، 9 إلى قارورة ثقافة T-25 والثقافة أنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع جو من 95% الهواء و 5% CO2. عادة بعد 3 أيام، سيكون هناك خليط من بعض الخلايا الميتة والخلايا التقيد بها وبعض الخلايا تشكيل NS التي تطفو في الأجل المتوسط.
  11. نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل وجمع الخلايا التي تنزل إلى أسفل باستخدام ميكروبيبيتي فقط وإعادة لوحة لهم على قارورة زراعة الأنسجة T-75.
  12. الحفاظ على الخلايا في كثافة عالية نسبيا (1-3 × 106 خلايا في T-25). مرور الخلايا عندما يكونون المتلاقية.
    ملاحظة: يتم تحديد كونفلوينسي بحجم مجالات. مراكز سوداء من مجالات كبيرة يعني أن هناك خلايا ميتة في المركز وتشير إلى أنه ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا فورا.
  13. إضافة عوامل النمو (basic-صندوق الأجيال القادمة؛ ولو 20 نانوغرام/مليلتر كل) كل ثلاثة أيام. تغيير المتوسط عندما تكون الخلايا غير روافد وبرتقالي فاتح يتحول المتوسط.
  14. لتغيير في المتوسط، جمع المتوسطة القديمة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه خلية في مجلس الأمن القومي المتوسطة وتستكمل مع مماثلة وصندوق الأجيال القادمة على التركيز المحدد في الخطوة 1، 1.
    ملاحظة: إذا كانت المجالات في منتصف-كونفلوينسي عالية، ولكن ليس على استعداد أن تكون باساجيد (حجم المجال صغير مع قطر < 100 ميكرومتر)، ثم يمكن تقسيم بيليه إلى قوارير اثنين.
  15. لمرور الخلايا، الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية واحتضان الخلايا في خلية مفرزة متوسطة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    1. إضافة 5 مل من محلول ملح متوازن لمفرزة تمييع المتوسطة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. صب المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 18 مل متوسط القومي وتقسيم التعليق على قدم المساواة إلى ثلاثة T-25 قوارير.
  16. لتجميد مختبرين للخلايا، فصل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1، 15، وتجميد الخلايا في مختبرين 1 مل من مصل البقر الجنين 90% مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يبرد ببطء الخلايا عن طريق وضع الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق، ثم حفظ الخلايا-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و-80 درجة مئوية لمدة يوم واحد. وفي اليوم التالي نقل الخلايا إلى حاوية تخزين نيتروجين سائل.

2-أصلي رقاقة

  1. إعداد الكروماتين
    1. وبعد إجراء تقييم NS المشتقة، الثقافة NS في T-75 في 15 مل متوسطة مجلس الأمن القومي في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة بمناخ من الهواء 95% و 5% CO2 حتى تصبح NS المتلاقية. لوح T-75 المتلاقية واحد سوف تسفر عن 3-5 × 106 خلايا.
    2. عندما تصبح الخلايا المتلاقية، الطرد المركزي NS على 300 غرام x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وإضافة 1 مل من الخلية تفكك المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمل 5 إضافة 5 كحد أدنى من المتوسط وحساب عدد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير10.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى 1 × 106 خلايا كل رد فعل إيمونوبريسيبيتيشن (IP). لاحظ أن عنصر تحكم مفتش أو المصل المناعي مسبقاً يجب أن يكون أيضا شملت11.
    3. الطرد المركزي NS في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحد في ز 300 x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وتعليق إعادة بيليه NS مع 1 مل من محلول ملح متوازن ونقل التعليق إلى منخفض البروتين ملزمة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
    4. NS أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 95 ميليلتر من الهضم المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم كاكل2، 0.2% أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين خماسي البروم ثنائي الفينيل) الواحدة 1 × 106 خلايا تستكمل بحوزتي مثبط كوكتيل بتركيز عال (1: 100). فورا بيبيت الخلايا أعلى وأسفل لمنع التثاقل وتجنب خلق أي فقاعات.
    5. ريسوسبيند مناسى في الجلسرين 50% لجعل الحل 1 ملغ/مل (1.15 وحدات/ميليلتر، المخزنة في-20 درجة مئوية) التي سوف يشار إليها باسم "س 1" الأوراق المالية. جعل "0.1 x" الأسهم بالقيام بتخفيف 1:9 ثانية مع والغليسيرول 50% (مثلاً.، 900 ميليلتر من "س 1" مناسى و 100 ميليلتر من الجلسرين 50%) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    6. مزيج 5 ميليلتر من "0.1 x" منسى و 145 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم. تبقى الإنزيم على الجليد من جميع الأوقات. إضافة 5 ميليلتر من منسى المخفف في المخزن المؤقت الهضم الواحدة 1 × 106 خلايا. نفض الغبار على أنبوب لخلط ووضع الأنبوب في كتلة 37 درجة مئوية للضبط 12 دقيقة عملية عينات واحد في وقت واحد لضمان وقت حضانة دقيقة من 12 دقيقة.
    7. إضافة 10 ميليلتر من 10 × "مناسى إيقاف المخزن المؤقت" (110 مم تريس-HCl، pH 8.0، يدتا 55 مم) الواحدة 1 × 106 خلايا. يجب الاحتفاظ بعينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا.
    8. إضافة ميليلتر 110 "من المخزن المؤقت x RIPA 2" (280 ملم كلوريد الصوديوم، الاثير أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين 1.8%، 0.2% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 0.2% Na-ديوكسيتشولاتي، 5 مم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)؛ المخزنة في 4 درجات مئوية) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل في تركيز عال (1: 100) الواحدة 1 × 106 خلايا. نفض الغبار على أنبوب للمزيج.
    9. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في [ميكروفوج] عند 4 درجة مئوية و 1700 خ زاي نقل المادة طافية في أنابيب جديدة عادية 1.5 مل ميكروسينتريفوجي (لم تعد منخفضة البروتين ملزمة ميكروسينتريفوجي الأنابيب اللازمة) وتخزينها على الجليد. تجاهل بيليه.
  2. إيمونوبريسيبيتيشن (IP)
    1. مزيج البروتين A والخرز المغناطيسي "ز البروتين" بنسبة 1:1. لكل من الملكية الفكرية، وإعداد 25 ميليلتر من الخرز.
    2. تغسل الخرز بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي (10 ملم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 1% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% نا-ديوكسيتشولاتي؛ المخزنة على 4 درجة مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000).
    3. استخدام مغناطيس للسماح بالخرز لفصل من الحل الغسيل وصب الحل الغسيل (حوالي 1 دقيقة). نفذ الخطوة يغسل مرتين.
    4. إعادة تعليق الخرز على وحدة التخزين الأصلية باستخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000).
    5. إذا كان ضروريا، وتمييع الكروماتين استخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000) حيث يكون لكل IP حجم 100-200 ميليلتر. حجز نسبة 10% حجم المستخدمة في مجال الملكية الفكرية الكروماتين للمدخلات.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا استخدمت 200 ميليلتر في مجال الملكية الفكرية، 20 ميليلتر من الكروماتين المخفف ينبغي أن تكون محفوظة للإدخال. لما مجموعة أربع IPs، ينبغي إضعاف حجم إجمالي الكروماتين إلى 820 ميليلتر.
    6. إعداد الإدخال. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، يدتا 1 مم) تستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) للإدخال واحتضان الإدخال في 55 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات 2.2.6-2.2.7 جنبا إلى جنب مع خطوات 2.3.4 و 2.4.1.
    7. تنقية الإدخال باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة والوتي في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
    8. قياس تركيز الإدخال باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي وتسجيل النتائج في دفتر الملاحظات. فارغة مع المخزن المؤقت شطف من كيت.
      ملاحظة: في نيوروسفيريس الماوس، استخدمنا حوالي 6 ميكروغرام من الحمض النووي لكل IP.
    9. تشغيل الإدخال على جل 1% أو تحميل 1 ميليلتر في "بيواناليزير الحمض النووي" استخدام الإعدادات القياسية. تخزين ما تبقى لاستخدامها كمدخلات في تطبيقات المتلقين للمعلومات.
    10. إضافة 10 ميليلتر بروتين غسلها A & ز الخرز المغناطيسي لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 1 في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 30 ميليلتر بروتين A & ز المغناطيسي الخرز لثلاثة من البرامج المتكاملة.
    11. وضع العينات في مغناطيس وتسمح الخرز لفصل. تقسيم الكروماتين بتحويل المبلغ الذي سبق تحديدها في أنبوب 1.5 مل جديدة.
    12. إضافة الجسم والتفاف القبعات مع الفيلم البارافين البلاستيك لتجنب التبخر. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: ينبغي تحديد تركيز تجريبيا في أعقاب توصيات الشركة المصنعة.
    13. في اليوم التالي، تدور الأنابيب استخدام أجهزة الطرد مركزي مصغرة في درجة حرارة الغرفة، 2000 س ز، ل 10 ق. ثم إضافة 10 ميليلتر من حبات لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 3 في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
  3. يغسل IP وهضم البروتين
    1. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية. كرر هذا يغسل تيب خمسة.
    2. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ليكل (250 ملم ليكل، 10 مم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 0.5% NP-40، 0.5% نا-ديوكسيتشولاتي؛ ومخزن في 4 درجات مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة المغناطيسي الوقوف وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
    3. إضافة 150 ميليلتر الباردة الشركة المصرية للاتصالات (لا مثبطات البروتياز) واحتضان العينة في 4 درجات مئوية مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
    4. بعد هذه الخطوة النهائية الغسيل، إعادة تعليق العينة في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) واحتضان العينة في 55 درجة مئوية ح 1.
  4. تنقية الحمض النووي ورقاقة الكمية Real-Time PCR (qPCR)
    1. تنقية إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR. بعد إضافة الحمض النووي ملزم العازلة من المجموعة لكل عينة، وضع الأنبوب على مغناطيس وانتظر حتى الخرز المغناطيسي الكلي، ثم نقل المادة طافية على العمود "تنظيف". اتبع إرشادات الشركة المصنعة والوت في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
    2. للتحقق من نجاح الملكية الفكرية، أداء قبكر. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تصمم كبسولة تفجير لمناطق السيطرة الإيجابية والسلبية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لعنوان IP يقوم ب H3K4me3 و H3K27me3، نماذج التالية يجب تشغيل على قبكر: H3K4me3، H3K27me3، ومفتش رقاقة الحمض النووي، إدخال الحمض النووي، وليس قالب تحكم (المجلس الوطني الانتقالي) باستخدام كبسولة تفجير للمناطق لإثراء مع H3K4me3 (مراقبة إيجابية) و المناطق إثراء مع H3K4me3 (مراقبة سلبية)؛ وبالمثل، ل H3K27me3.
    3. اتبع البروتوكولات القياسية لأداء قبكر12. بإيجاز، أداء قبكر استخدام مزيج الرئيسي الأخضر سيبر، 0.5 ميليلتر من 10 ميكرون العامل تركيز كل إلى الأمام وعكس التمهيدي وميليلتر 2 رقاقة أو إدخال الحمض النووي. قراءة لوحات باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي. وترد في الجدول 2تسلسل التمهيدي. تسلسلات التمهيدي جابده من هوانغ وآخرون. وكانت تستخدم13.
    4. تحليل بيانات الشريحة بالنسبة للمدخلات، أي في المئة إدخال أسلوب (% IP)14. حساب النسبة المئوية للإدخال باستخدام الصيغ التالية:
      تعديل الإدخال = ct يعني (مدخلات)-تسجيل2(مدافع)
      حيث مدافع هو عامل إضعاف للانطلاق بالإدخال و
      مدافع = الحجم الكلي للملكية الفكرية/حجم الإدخال
      % IP = 100 × 2 ^ (تعديل الإدخال-"الأشعة المقطعية" (IP))
      حيث Ct هو عامل العتبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد تمثيل تخطيطي للورم NS المتولدة من ورم الدماغ التي تكون فيها خلايا ورم المخ كاتوشكا إيجابية في الشكل 1. الرقم 2 تمثيل تخطيطي لتقنية شرائح كاملة. يظهر الشكل 3 نتائج تمثيلية للونين من ورم الدماغ NS يهضم مع مناسى ل 12 دقيقة، مما أسفر عن أغلبية مونو، دي-وثلاثي نوكليوسوميس. عقب رقاقة، يمكن أداؤها على الرقاقة قبكر وإدخال الحمض النووي عينات. ويبين الشكل 4 رقاقة qPCR بيانات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المعروضة هنا سوف تمكن المستخدم من أداء رقاقة الأصلي في NS المستمدة من أورام الدماغ المهندسة وراثيا. على النقيض من رقاقة العابرة للربط، يقتصر هذا البروتوكول لدراسة البروتينات التي تربط محكم مع الحمض النووي6. يمكن تعديل عدد الخلايا التي تستخدم عند الضرورة ويمكن الارتقاء بالبروتوكول. كنا 1 × 106 خلايا في مجال الملكية الفكرية، ومع ذلك، قد أيضا إجراء رقاقة الأصلي مع أقل قدر من 4 × 104 خلايا5. في هذا البروتوكول، قمنا بتحليل "الحمض النووي رقاقة" عب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ قسم جراحة الأعصاب؛ ليا في "قلوب سعيدة"، ومؤسسة على الرغم من تشاد إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. R.I.Z.-V. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/منح نيجمس 5T34GM007821-37.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2946-90004محلل حيوي
AccuSpin Micro 17R ، مبردفيشر ساينتفيك13-100-676
C57BL / 6TaconicB6-fC57BL / 6 فأر
كلوريد الكالسيومAldrich22350-6كاشف عازل
D-Luciferin ، ملح البوتاسيومGoldbioLuckK-1g
DiaMag1.5 الرف المغناطيسيDiagenodeB04000003للحبة المغناطيسية تغسل
DiaMag Rotator الاتحاد الأوروبيDiagenodeB05000001الدوار
DMEM / F-12Gibco11330-057NSC مكون
Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001Dبروتين A حبات مغناطيسية
Dynabeads بروتين Gثيرمو فيشر علمي10003Dالبروتين G الخرز المغناطيسي
EGFPeproTechAF-100-15إعداد 20 مو ؛ جم / مل من الأسهم في 0.1٪ BSA و aliquot.
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجماE-4884كاشف عازل
إيثيلين جلايكول مكرر (بيتا ؛ أمينوإيثيل إيثر) - N ، N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك) (EGTA) كاشفعازلةSigmaE-4378
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612كاشف qPCR
مصل الأبقار الجنينيجيبكو10437028لتجميد الخلايا
FGFPeproTech100-18bتحضير 20 & جم / مل من الأسهم في 0.1٪ BSA و aliquot.
أدوات العلومالدقيقة الملقط11008-13لتشريح الورم
الجلسرين ، MB GradeEMD- Millipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103محلول ملح متوازن
FlurisoVETone501017استنشاق التخدير
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262في الجسم الحي نظام التصوير البصري
Hyqtase HyClonSV3003001وسائط انفصال الخلية
كلوريد الليثيومSigmaL8895كاشف عازلة
أنابيب دقيقة منخفضة الربط CorningCostarCLS3207أنبوب الطرد المركزي الدقيق منخفض البروتين
الطرد المركزي الدقيقفيشر21-402-903أنبوب الطرد المركزي الصغير المنتظم
المكورات الدقيقة NucleaseThermo Fisher Scientific ، Affymetrix70196Yقد تختلف كل دفعة ؛ شراء كمية كافية للتجارب و aliquot.
N2Gibco17502-048مكون NSC
Normal Rabbit IgGMillipore12-372
NormocinInvivogenNOL-36-063عامل مضاد للميكروبات ، استخدم عند 0.1 مجم / مل.
NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLكاشف عازلة
Kimble Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749515-0000
كوكتيل مثبط البروتيازSigma-AldrichP8340aliquot وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
يصنع Protinase KSigma-AldrichP2308مخزون 10 مجم / مل في الماء ؛ aliquot ويخزن في -20 درجة مئوية.
طقم تنقية QIAquick PCRQiagen28104طقم تنقية الحمض
النووي أدوات العلوم الدقيقة للمشرط10007-16لتشريح الورم
كلوريد الصوديومVWR0241-5KGكاشف عازلة
الصوديوم DeoxycholateSigma-AldrichD670-25Gكاشف عازلة
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجماL-4390كاشف عازلة
تريس قاعدةحراري فيشر العلميBp152-1كاشف عازلة
تريتون X-100ثيرمو فيشر العلميBP 151-500البولي إيثيلين جلايكول أوكتيل الأثير
قياسي جهاز طرد مركزي صغيرفيشربراند12-006-901جهاز طرد مركزي صغير قياسي
SZX16 مجهرأوليمبوسSZX16فلورسنت
نظام PCR في الوقت الحقيقي ViiA 7 مع أنظمةحيوية مطبقة4453535
Nanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W
أنبوب تشريح سريعة من 96 بئر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
  3. Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
  4. Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy? Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
  5. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  6. Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
  7. Turner, B. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  8. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  9. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
  10. Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  13. Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439(2014).
  14. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A G RIPA TE qPCR

مقالات ذات صلة