Method Article

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

DOI:

10.3791/57020

⸱

May 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة في الكشف والعلاج من الأمراض المختلفة. يعتمد هذا التطبيق على التحوير الوراثي، التجميع الذاتي وتصريف سيستين للوفاء بتطبيق استهداف الورم من المؤتلف فلبس. بالمقارنة مع الوراثية يقدم التعديل الاقتران وحدها، والمواد الكيميائية من الببتيدات الأجانب إلى فلبس كبير فائدة لأنه يسمح بمجموعة متنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات الاصطناعية أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس بطريقة مرنة والتضمين دون تغيير للجمعية عزام.

هنا، نحن توضح كيفية استخدام التهاب الكبد الوبائي ه فيروس نانوحبيبات (هيفنب)، كبسولة ثيرانوستيك نمطي، كناقل توصيل متعددة الوظائف. وتشمل مهام هيفنبس استهداف الأنسجة وتصوير وتقديم العلاج. استناداً إلى بحوث هيفنب الهيكلية الراسخة، اختيرت بقايا مستقلة هيكلياً والمعرضة للسطح لاستبدال سيستئين كمواقع التصريف لمجموعات كيميائية ترتبط ماليميدي عن طريق الروابط ثيول انتقائية. سيستين واحد بعينه-تعديل هيفنب (Cys استبدال الهليونين في 573 aa (هيفنب-573 ج)) كان مترافق للثدي سرطان خلية محددة يجند، LXY30 وتسميته بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الأسفار صبغ (Cy5.5)، التقديم الورم المستهدفة هيفنبس كبسولات التشخيصية الفعالة (LXY30-هيفنب-Cy5.5). يمكن أن تستخدم استراتيجيات هندسية مماثلة مع المجمعات الجزيئات الأخرى مع هياكل ذرية معروفة جيدا لاستكشاف تطبيقات محتملة في إيصال ثيرانوستيك.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير ناقلات نانو الحجم في إيصال التشخيصية والعلاجية، المعروفة باسم نانوثيرانوستيكس، حولت الكثير من ميدان الطب الحيوي بعيداً عن العلاجات معممة نحو التنفيذ الهادف1. تسليم نانوثيرانوستيك المستهدفة يدمج ناقلات نانو الحجم (nanoparticles) مع جزيئات ثيرانوستيك ستابلي توجيه الجزيئات ثيرانوستيك إلى أنسجة مريضة محددة أو المسارات البيوكيميائية2،3،4 . قد حان لطب النانوي في صدارة التنفيذ الهادف لأن جسيمات نانوية الحجم الأمثل لها القدرة على تحقيق استقرار الدورة الدموية لجزيئات ثيرانوستيك واستهداف جزيئات سطح الخلية المقدمة في الأنسجة المريضة بشكل انتقائي. لا تزال تع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-هيفنب الإنتاج في خلايا الحشرات

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية في غطاء ثقافة خلية. الرجوع إلى المنشور السابق لدينا لإنتاج هيفنب أكثر تفصيلاً الإجراءات11.

  1. ثقافة الخلايا Sf9 في وسائل الإعلام خلية الحشرات (انظر الجدول للمواد) لالتقاء 50-75% في لوحات 6-جيدا.
  2. باستخدام الخلية الحشرات تعداء الكواشف طبقاً للبروتوكولات الشركة المصنعة، ترانسفيكت باكميدس التي تحتوي على ORF2 هيفنب-573 ج داخل الخلايا Sf99 لإنتاج باكولوفيروس المؤتلف. احتضان transfected الخلايا عند 27 درجة مئوية ل 3-6 أيام، اعتماداً على بقاء الخلايا.
  3. جمع المادة طافية في الإصابة بعد 3-6 أيام (بعد أن يتم تفكيك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أقرب إلى الهجينة-فلبس، Cys جميع تعديل كابسيدس هيفنبس شكل icosahedral القابلة للذوبان، والإجمالي لا في الحل أثناء الإنتاج أو تنقية. قبل وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين خطوة واحدة، كل من Cys تعديل هيفنبس تم تمييزه عن فلبس الهجينة في وصمة سلبية م (الشكل 2). ماليميدي-البيوتين تصريف الكفاءة Cys هيفنبس تم التعديل تم اختباره أولاً مع النشاف الغربية عن طريق ربط ستريبتافيدين تشيميلومينيسسينت. وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين، تعديل Cys هيفنبس عرض ستريبتافيدين ملزم إشار.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على النقيض من الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً في مجال الهندسة الوراثية، التي عادة ما يستغرق أسابيع، هنا نظهر خطوتين بسيطة وإجراءات تصريف المواد الكيميائية خطوة واحدة، والتي يمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام، إضافة السرطان استهداف يجند و/أو الأسفار صبغ الكشف عن مواقع Cys/ليز هيفنبس. يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى الشاشة ليجند أفضل للهدف من مجموعة من المرشحين، وبالتالي يستفيد من خدمات توليف جزيء الببتيد الصغيرة المتاحة في فترة زمنية معقولة التكلفة والتسليم.

على عكس الهندسة الوراثية التقليدية، التي يمكن فقط.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب نعترف بالرعاية من التمويل اللازم يستبدل بالمعاهد الوطنية للصحة منح #' ق: AI095382، EB021230، CA198880، المعهد الوطني للأغذية والزراعة، فضلا عن البرنامج "أستاذ مرموق في فنلندا".

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
وحدات غسيل الكلى المصغرة ، 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572وحدة غسيل الكلى المصغرة
خمس خلاياThermo Fisher ScientificB85502Tn5 خلايا
SF9 Cells  ؛Thermo Fisher Scientific11496015خلايا Sf9
التعبير عن الفيروس العصبي Bac-to-BacThermo Fisher ScientificA11101 ، A11100نظام التعبير عن الفيروس Baculovirus
Bac-to-Bacالحياة10359-016 ، 10360-014 ، 10584-027 ، 10712-024Bacmid
ESF921 أنظمة التعبير عن وسائط خلايا الحشراتLLC96-001-01 وسائط الخلية
Cy5.5 NHS ester ، 5mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns ، 40K MWCO ، 0.5 ملThermo Scientific87766عمود تحلية
المياه MES HydrateSigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
أجهزة الطرد المركزي فائقة الوضوح Thinwall أنابيب الطرد المركزيBeckman Coulter، Incتعتمد على الدوارأنبوب الطرد المركزي الفائق
NuPage 4-12٪ Bis-Tris المواد الهلامية البروتينThermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS هلام البروتين
Cellfectin II كاشفThermo Fisher Scientific10362100كاشف التعداء
EMS توهج المفرغالمجهر الإلكترون علمالتفريغ توهج
عالية نظام تقنيات حشرة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E Virus NanoparticlesChemical ConjugationSurface FunctionalizationMaleimide BiotinLXY30 LigandCy5 5 Fluorescent TagClick ChemistryTEM ImagingConfocal MicroscopySpin Desalting Column

Related Articles