يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

6.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57020

⸱

مايو 11, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ونحن قد هندسة البروتين قفيصه من فيروس التهاب الكبد الوبائي ه نانوحبيبات ثيرانوستيك (هيفنب). هيفنب تجميع ذاتي في قفص icosahedral مستقرة في إيصال المخاطية. وهنا يصف لنا بتعديل هيفنبس للورم الاستهداف بتحور يتعرض سطح المخلفات إلى سيستينيس، الذي متزاوجة يغاندس الاصطناعية التي تربط الخلايا السرطانية على وجه التحديد.

الملخص

جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة في الكشف والعلاج من الأمراض المختلفة. يعتمد هذا التطبيق على التحوير الوراثي، التجميع الذاتي وتصريف سيستين للوفاء بتطبيق استهداف الورم من المؤتلف فلبس. بالمقارنة مع الوراثية يقدم التعديل الاقتران وحدها، والمواد الكيميائية من الببتيدات الأجانب إلى فلبس كبير فائدة لأنه يسمح بمجموعة متنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات الاصطناعية أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس بطريقة مرنة والتضمين دون تغيير للجمعية عزام.

هنا، نحن توضح كيفية استخدام التهاب الكبد الوبائي ه فيروس نانوحبيبات (هيفنب)، كبسولة ثيرانوستيك نمطي، كناقل توصيل متعددة الوظائف. وتشمل مهام هيفنبس استهداف الأنسجة وتصوير وتقديم العلاج. استناداً إلى بحوث هيفنب الهيكلية الراسخة، اختيرت بقايا مستقلة هيكلياً والمعرضة للسطح لاستبدال سيستئين كمواقع التصريف لمجموعات كيميائية ترتبط ماليميدي عن طريق الروابط ثيول انتقائية. سيستين واحد بعينه-تعديل هيفنب (Cys استبدال الهليونين في 573 aa (هيفنب-573 ج)) كان مترافق للثدي سرطان خلية محددة يجند، LXY30 وتسميته بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الأسفار صبغ (Cy5.5)، التقديم الورم المستهدفة هيفنبس كبسولات التشخيصية الفعالة (LXY30-هيفنب-Cy5.5). يمكن أن تستخدم استراتيجيات هندسية مماثلة مع المجمعات الجزيئات الأخرى مع هياكل ذرية معروفة جيدا لاستكشاف تطبيقات محتملة في إيصال ثيرانوستيك.

المقدمة

تطوير ناقلات نانو الحجم في إيصال التشخيصية والعلاجية، المعروفة باسم نانوثيرانوستيكس، حولت الكثير من ميدان الطب الحيوي بعيداً عن العلاجات معممة نحو التنفيذ الهادف1. تسليم نانوثيرانوستيك المستهدفة يدمج ناقلات نانو الحجم (nanoparticles) مع جزيئات ثيرانوستيك ستابلي توجيه الجزيئات ثيرانوستيك إلى أنسجة مريضة محددة أو المسارات البيوكيميائية2،3،4 . قد حان لطب النانوي في صدارة التنفيذ الهادف لأن جسيمات نانوية الحجم الأمثل لها القدرة على تحقيق استقرار الدورة الدموية لجزيئات ثيرانوستيك واستهداف جزيئات سطح الخلية المقدمة في الأنسجة المريضة بشكل انتقائي. لا تزال تعاني العديد من الأنظمة الأساسية نانوثيرانوستيك من امتصاص الخلية سلبية وتدهور ناضجة مسبقاً وسمية ورابطة غير كافية مع جزيئات ثيرانوستيك. فلبس التغلب على كثير من هذه العقبات في التنفيذ الهادف. فقد استخدمت نانوكاريرس لعرض الأجنبية [ابيتوبس] و/أو تسليم الجزيئات الصغيرة: نظام التي يمكن استخدامها لمكافحة العديد من الأمراض1. هذا التطبيق يعتمد أساسا على الخاصية التجميع الذاتي فضلا عن سهولة التعديلات الوراثية، لتحقيق التطبيق مصممة لعزام معطى. ومقارنة بالهندسة الوراثية، تصريف المواد الكيميائية من الببتيدات الأجنبية إلى عزام يعرض ميزة كبيرة لأنه يسمح بمجموعة كبيرة ومتنوعة من الكيانات، مثل الببتيدات أو oligosaccharides، يكون مترافق لسطح فلبس في التضمين و طريقة مرنة دون تغيير للجمعية عزام.

هيفنبس، المستمدة من البروتين قفيصه الهجينة المؤتلف، 2nd فتح قراءة الإطار (ORF2)، وهي غير معدية، تجميع ذاتي كابسيدس قادرة على ربط الخلايا وإدخال. نظراً لتطور الهجينة لانتقال الغشاء المخاطي، المثل مستقرة في ظروف المخاطية proteolytic وحمضيه5البروتين قفيصه المجمعة. هيفنبس تشكل جوفاء، T = 1 قفيصه icosahedral، تتألف من وحدات متطابقة 606،7 من ORF2، جعلها مستقرة جداً سواء في التخزين وفي ظروف قاسية الفسيولوجية. تفتقر إلى أي عناصر جينية فيروسية، يتحقق إنتاج فعالة وعالية الغلة من خلال نظام التعبير باكولوفيروس في خلايا الحشرات. بسبب استقرارها proteolytic، تستخرج هيفنبس الذاتي تجميعها وتنقيته من المادة طافية الخلية، خفض إلى حد كبير خطوات التنقية اللازمة. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك هيفنبس نتوء مكشوفة سطح مجال (ف) متصلاً من خلال مفصل مرنة لقاعدة icosahedral مستقرة. المجال ف أشكال التموج المكشوفة السطح فوق قاعدة icosahedral بينما المفصل مرنة تجعل من الممكن تعديل المجال ف إلى حد كبير دون المساس بالهيكل الأساسي إيكوساهيدرال. مع الوحدات المتكررة 60، نتائج تعديل مواقع محددة واحدة في 60 موقعا متماثل للتحوير الكيميائي. في الآونة الأخيرة، وقد اقترحنا نانو-منصة استخدام هيفنب التي يمكن كيميائيا متزاوجة يغاندس أو الجزيئات الصغيرة للتطبيقات ثيرانوستيك. وتحقق ذلك باستبدال واحد من الأحماض الأمينية سيستين في مجال نتوء الهجينة-عزام كموقع رد فعل مع الببتيدات مرتبطة ماليميدي أو الجزيئات. استناداً إلى التحليل الهيكلي السابق عزام الهجينة ومدروسة مكسبه [ابيتوبس]8،9استعيض الأحماض الأمينية الهجينة-عزام الخمسة التالية مع سيستئين كمرشحين محتملين: Y485C، T489C، S533C، N573C، و T586C ( الشكل 1). وأكدت بها تشكيلات عزام بعد التعبير وتنقية من خلايا الحشرات، انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) المراقبة (الشكل 2)، والمواقع سيستين المكشوفة التي تم تحليلها بواسطة الغربية لطخة بعد البيوتين مرتبطة ماليميدي الاقتران (الشكل 2). بين طفرات الخمسة، ج هيفنب-573 عرض أقوى إشارة من تصريف ماليميدي-البيوتين (الشكل 2)، وكان يستخدم لمتابعة مظاهرة ك nanocarrier لخلايا سرطان الثدي تستهدف4 (الشكل 3).

ويصور هذا البروتوكول أساليب تصريف المواد الكيميائية لإرفاق جزيئات استهداف الورم هيفنبس عن طريق التصريف السطحي سيستين. نحن بالتفصيل على تصريف الورم الاستهداف والكشف عن الجزيئات لإيصال الورم مع المؤتلف هيفنبس التي تحتوي على سيستين في N573 (هيفنب-573C). ركزنا على انقر فوق كيمياء اقتران عملية من خطوتين لربط ورم سرطان الثدي تستهدف الببتيد، LXY3010 إلى هيفنبس بشكل LXY30-هيفنب (الشكل 4). وفي وقت لاحق، N-هيدروكسيسوكسيميدي (NHS)-كانت مترافق Cy5.5 إلى موقع Lys منفصلة في هيفنبس لبناء LXY30-هيفنب-Cy5.5 لكشف فلوري على حد سواء في المختبر (الشكل 5) و المجراة في4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-هيفنب الإنتاج في خلايا الحشرات

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية في غطاء ثقافة خلية. الرجوع إلى المنشور السابق لدينا لإنتاج هيفنب أكثر تفصيلاً الإجراءات11.

  1. ثقافة الخلايا Sf9 في وسائل الإعلام خلية الحشرات (انظر الجدول للمواد) لالتقاء 50-75% في لوحات 6-جيدا.
  2. باستخدام الخلية الحشرات تعداء الكواشف طبقاً للبروتوكولات الشركة المصنعة، ترانسفيكت باكميدس التي تحتوي على ORF2 هيفنب-573 ج داخل الخلايا Sf99 لإنتاج باكولوفيروس المؤتلف. احتضان transfected الخلايا عند 27 درجة مئوية ل 3-6 أيام، اعتماداً على بقاء الخلايا.
  3. جمع المادة طافية في الإصابة بعد 3-6 أيام (بعد أن يتم تفكيك الخلايا ترانسفيكتيد بسبب الإصابة باكولوفيروس) كمخزون باكولوفيروس P0.
  4. إزالة الثقافة المتوسطة قبل تطبيق 200 ميليلتر من الأسهم P0 إلى الخلايا Sf9 المتلاقية 50-75% في قارورة أحادي الطبقة2 سم 25. روك قارورة كل 15 دقيقة لضمان التغطية الكاملة للعدوى. كرر 4 مرات، لمدة 60 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل مستنبت الخلية الحشرات قارورة وتبقى عند 27 درجة مئوية لمدة 3-6، اعتماداً على بقاء الخلايا، تضخيم باكولوفيروس إلى عيار أعلى.
  6. القيام بفحوصات اللوحة للحصول على عيار باكولوفيروس قراءة12.
  7. الثقافة علقت Tn5 الحشرات الخلايا (جدول المواد) مع 100 مل من خلايا الحشرات المتوسطة في قارورة 250 مل ويهز في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لعيار من 0.5 × 105 -1 × 106 للتطعيم.
  8. إضافة باكولوفيروس في عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 5-10 إلى 100 مل Tn5 الخلايا في قارورة 250 مل. بعد التلقيح، هزة في 27 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 أيام.
  9. عندما يبدو أن معظم خلايا الحويصلات و 70-90% خلايا ميتة تحت المجهر الضوئي الملاحظة، جمع الخلايا Tn5 ونقل إلى أنابيب ultracentrifuge مل 33. المكان أولتراسينتريفوجي الأنابيب في يتأرجح الدوارات دلو، والتوازن، وتدور إلى أسفل الخلية تحت الأنقاض والمؤتلف باكولوفيروسيس في 10,000 س ز لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  10. الاحتفاظ بالمادة طافية يحتوي على هيفنبس صدر في 4 درجات مئوية لمزيد من التنقية. لتخزين ممتدة من باكولوفيروس طافية، إضافة مثبطات البروتياز.

2. تنقية هيفنب

  1. بيليه، وعزل هيفنبس استخدام الفصل التدرج (CsCl) كلوريد السيزيوم:
    1. نقل المادة طافية المجمعة (من الخطوة 1، 10) وإضافة 20% NP-40 في كل أنبوب لجعل تركيز نهائي من 0.5% 40 NP بحل أي غشاء خلوي المتبقية. مزيج من بيبيتينج برفق واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 25 درجة مئوية.
    2. أولتراسينتريفوجي هيفنبس في 112,400 س ز في يتأرجح الدوارات دلو ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه أسفل هيفنبس من المادة طافية. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي ولطف إعادة تعليق بيليه الخام في ميليلتر 200 من 10 ملم مس المخزن المؤقت pH 6.2 في كل أنبوب بين عشية وضحاها (O/N) في 4 درجات مئوية. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة (الخطوة 3.1) للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في النفط الخام بيليه كعصابة كاتشين 52.
    3. إعداد تدرج CsCl 38.5% (w/v) بخلط ز 1.96 CsCl وبيليه الخام إعادة تعليق ~ 4 مل من 0.01 م مس 6.2 درجة الحموضة في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  2. جمع الكسور بعد CsCl التدرج:
    1. تجاهل الكسر ميليلتر 500 الأعلى، الذي هو أساسا غشاء الخلية خفيفة الوزن الحطام. جمع 500 ميليلتر الكسور، بدءاً من الجزء العلوي من الأنبوب، وتغيير نصائح الفترات الفاصلة بين كل جزء. وضع كل جزء في أنابيب مرقمة المسمى 1.5 مل.
      ملاحظة: وجود ORF2 هيفنب في الكسور يفصل CsCl التدرج لا يمكن الكشف عنها عن طريق تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي الهلام بسبب التركيز العالي ل CsCl. يمكن إزالة أو تضعف باتباع إجراء تنظيف CsCl CsCl في كل جزء. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن التدرج CsCl 10-40% سكروز تدرج13 لتجنب CsCl المتبقية.
    2. نقل كل جزء في أنبوب أولتراسينتريفوجي 5 مل وتمييع CsCl مع مل 4.5 من 10 ملم مس، 6.2 درجة الحموضة. تحقيق التوازن بين الأنابيب وفي دوار دلو يتأرجح. أولتراسينتريفوجي في 147,000 س ز ح 2 في 4 درجات مئوية بيليه لأسفل هيفنبس.
    3. تجاهل المادة طافية ولطف إعادة تعليق هيفنبس في 100 ميليلتر من 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة في كل أنبوبة. وتغطي هذه الأنابيب تجنب التبخر واحتضان س/ن في 4 درجات مئوية.
    4. سجل A280 القراءة ونسبة نانومتر A260/A280 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تحديد تركيز ORF2 التقريبي:
      figure-protocol-1
      وسوف تحتوي على كل ORF2 1 Cys الموقع وموقع Lys لتصريف المواد الكيميائية.
      ملاحظة: هو معامل الانقراض المولى ORF2 هيفنب 60,280، وما يعادل 1.019 مغ/مل × A280. والسبب في ذلك ما يقرب من 1:1 التي يمكن تقريبها تركيز هيفنبس (في ملغ/مل) A280، ومن ثم تركيز ORF2 حسب المعادلة المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، سيتعين هيفنب مع أن قراءة A280 من 1 بتركيز 1 ملغ/مل، وما يعادل 18.8 مكم ORF2.
    5. إعداد صفحة بالحزب الديمقراطي الصربي. استخدام عينة ميليلتر 6 من كل جزء بسيط لتحديد الكسور التي تحتوي على 53.3 كاتشين ORF2 هيفنب البروتين (الخطوة 3.1). وينبغي إيجاد في هيفنبس في الكسور 3-5، مع كثافة ~1.25 غ/مل.
    6. التأكد من الوجود ونقاء هيفنبس تيم الملاحظة. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2.0 ملغ/مل لل. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral فارغة، ~ 27 نانومتر في القطر (الشكل 2). بعض الملوثات البروتين قد تبقى في الكسور، وسيتبع تحت تيم (الخطوة 3، 2).
  3. في حالة أن الشوائب موجودة تحت TEM، كرر الخطوة 2.1.3-2.2.6 لنقاء أفضل من هيفنبس.
    ملاحظة: قد يسبب تنقية إضافية من خلال التدرج CsCl خسارة العائد من هيفنبس. وبدلاً من ذلك، يمكن الاستعاضة عن تنقية CsCl التدرج تدرج سكروز 10-40% لتجنب المتبقية CsCl13.

3-هيفنب الوصف

  1. إعداد صفحة الحزب الديمقراطي الصربي % 4-12 مكررا-تريس "البروتين الهلام"، 1.0 مم، 17-الآبار (انظر الجدول للمواد) وفقا لدليل المستخدم14:
    1. إضافة 2 ميليلتر من 4 × تحميل المخزن المؤقت إلى 6 ميكروليتر من عينة البروتين. احتضان المخلوط عينة في كتلة حرارة لمدة 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية تجريدها من البروتين. تحميل عينات البروتين على الهلام.
    2. تشغيل مخزون النشر الاستراتيجي-الصفحة بوضع العاصمة إمدادات الطاقة في 100 V مدة 10 دقيقة، ثم 150 الخامس لمدة 45 دقيقة حتى تشغيل العينات إلى حوالي 1 سم فوق الجزء السفلي من الجل.
    3. وصمة هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ الأزرق (0.25% (w/v) أخذ R250 الزرقاء الرائعة، الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v))، عن ح 1.
    4. بعد هذا الإجراء المصبوغة، إزالة وصمة عار أخذ الأزرق وتطبيق المصبوغة إزالة المخزن المؤقت (الميثانول 30% (v/v)، وحمض الخليك 10% (v/v)) على هلام بروتين > ح 12 في درجة حرارة الغرفة.
    5. الوثيقة الجل تحت الضوء الأبيض للتأكد من وجود ORF2 هيفنب في الفرقة كاتشين 52.
  2. مراقبة هيفنبس استخدام ال.
    1. إعداد أو تمييع عينات هيفنب إلى 0.5-2 مغ/مل مع 10 ملم مس 6.2 درجة الحموضة لتصوير تيم.
    2. تتأين الشبكات المغلفة بالكربون مع 40 mA توهج التفريغ لمدة 30 ثانية لإنتاج الكربون ماء سطح. ويرد في الجدول للموادمعدات تفريغ الوهج.
      ملاحظة: على سطح الكربون ماء شبكات يمكن فقط آخر لمدة 30 دقيقة بعد توهج الاضطلاع بالعلاج.
    3. عقد في ملاقط وإضافة 2 ميليلتر من عينة هيفنب إلى الشبكة، انتظر 15-30 ثانية، ولطخة مع أوراق الترشيح.
    4. فورا غسل الشبكة مع ddH20 ووصمة عار مع أوراق الترشيح.
    5. فور إضافة 2 ميليلتر من خلات اليورانيل 2% إلى الشبكة، انتظر 15 ثانية، ثم وصمة عار مع أوراق الترشيح. الجافة الشبكات عينة بوضعها في إلكتروني تجفيف مجلس الوزراء الجافة س/أ.
    6. نقل الشبكة إلى تيم والصورة عند التكبير 10-80 ك. هيفنبس تظهر في تيم كالبروتينات icosahedral الفارغة التي هي ~ 27 نانومتر في القطر، ونظرا لعدم وجود الرنا الفيروسي.

4-الأسلحة الكيميائية تصريف هيفنبس مع البيوتين ويجند استهداف سرطان فلوروفوريس

  1. إجراء اقتران خطوة واحدة هيفنبس وماليميدي المرتبطة البيوتين.
    1. المخزن المؤقت التغيير: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة ح 1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد). نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر Cys رد فعل المواقع (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع مبلغ مساو من ماليميدي-البيوتين (100 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 متر، الرقم الهيدروجيني 7.4، جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية. إزالة البيوتين ماليميدي غير منضم مع إجراء ك 40 عمود Desalting موكو تدور وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد).
    3. تحليل العينات من خلال معيار الحد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.1).
    4. استخدام إجراءات معيارية، تعد من تشيميلومينيسسينت "الغربية لطخة" استخدام Streptavidin المرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية. التقاط الإشارات تشيميلومينيسسينت برأي X الفيلم (الشكل 2).
  2. تنفيذ الخطوة اثنين الاقتران LXY30 إلى سيستين سطح مكشوف على "مصادر القدرة النووية الهجينة" (الشكل 5).
    1. المخزن المؤقت exchange: تطبيق هيفنبس في وحدات الغسيل الكلوي مصغرة ودياليزي ضد برنامج تلفزيوني 0.01 م الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة حاء 1 نقل هيفنبس إلى أنابيب 1.5 مل وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    2. إضافة 650 مكم ماليميدي-أزيد و 650 ميكرومتر ألكاين-LXY3010 في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 مع 200 ميكرومتر CuSO4 و 1 ملم حمض الأسكوربيك لتشكيل LXY30 المرتبطة ماليميدي (القانون النموذجي للتحكيم-LXY30) في 650 ميكرومتر. احتضان الخليط في 4 درجات مئوية عن س/أ.
    3. مزيج هيفنب إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر من موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع حوالي 10% حجم من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30 (650 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني 0.01 M pH 7.4، جعل نسبة مولى 1:3؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: نظراً لتركيز عالية نسبيا من القانون النموذجي للتحكيم-LXY30، تركيزات نهائية من كواشف مختبر، مثل CuSO4، تقل حوالي 10 مرات بعد الاختلاط، لتفادي إلحاق الضرر بهم هيفنبس. خيار آخر هو أسلوب التصريف خالية من الاتحاد الجمركي15.
    4. إزالة غير منضم LXY30--ماليميدي--انقر فوق مع عمود "الدوران الملحي موكو ك" 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). تبقى هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) في 4 درجات مئوية.
  3. إجراء اقتران خطوة واحدة من LXY30-هيفنبس واستر Cy5.5 دائرة الصحة الوطنية (نهس-Cy5.5)
    1. مزيج هيفنبس المرتبطة LXY30 (LXY30-هيفنبس) إلى 1 مغ/مل، وما يعادل 18.8 ميكرومتر في موقع رد الفعل Cys (انظر التفاصيل في الخطوة 2.2.4)، مع تساوي حجم دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 (100 ميكرومتر) في 0.01 M برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 جعل نسبة مولى 1:5؛ الرد يا/ن في 4 درجات مئوية.
    2. إزالة غير منضم Cy5.5--دائرة الصحة الوطنية مع إجراء عمود "الدوران الملحي موكو" ك 40 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). الحفاظ على LXY30، ترتبط Cy5.5 هيفنبس (LXY30-هيفنب-Cy5.5) في 4 درجات مئوية.

5-هيفنب ملزم والاستيعاب في خلايا سرطان الثدي نجمة داود الحمراء--MB231

  1. خلايا سرطان الثدي MDA-MB231 البذور في كوب 35 ملم أسفل الأطباق (5 × 104 كل طبق) س/ن في ثقافة خلية الثديية مجلس الوزراء.
  2. لتجربة ربط الخلية، وإعداد LXY30-هيفنب-Cy5.5 بالخطوات التالية 4.2-4.3. تمييع LXY30-هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 0-1% FBS/دميم.
    1. إعداد نموذج التحكم السلبي في 0.01 ملغ/مل هيفنب-Cy5.5 خطوة بعد 4.3 لكن مترافق مع دائرة الصحة الوطنية--Cy5.5 صبغ فقط، (الهجينة-Cy5.5). تمييع هيفنب-Cy5.5 إلى 0.01 ملغ/مل، وما يعادل ميكرومتر 0.188 من ORF2 هيفنب (راجع الخطوة 2.2.4)، في 250 ميليلتر من 10% FBS تكملة مع دميم.
  3. تغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تطبيق 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4. إزالة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني بعد الغسيل، مع الاحتفاظ ببعض المخزن المؤقت في الطبق ثقافة الخلية.
  4. تطبيق 250 ميليلتر من LXY30-هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم أو هيفنب-Cy5.5 في 10% FBS تكملة مع دميم لخلايا سرطان الثدي MDA MB231 المستزرعة. درع الخلية مثقف الأطباق من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
  5. تبقى الأطباق الخلايا المزروعة في ثقافة خلية 37 درجة مئوية مجلس الوزراء ح 1 لاستيعاب.
  6. أغسل 3 مرات، 5 دقيقة للمياه والصرف الصحي، مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 الخلايا المستزرعة على الجليد.
  7. إصلاح الخلايا 4% في منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 20 دقيقة ويغسل ثم مرة واحدة مع 250 ميليلتر من برنامج تلفزيوني م 1، الرقم الهيدروجيني 7.4.
    ملاحظة: الخلايا جاهزة الآن تصويرها بالمجهر [كنفوكل]. وترد البيانات الممثلة في الشكل 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أقرب إلى الهجينة-فلبس، Cys جميع تعديل كابسيدس هيفنبس شكل icosahedral القابلة للذوبان، والإجمالي لا في الحل أثناء الإنتاج أو تنقية. قبل وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين خطوة واحدة، كل من Cys تعديل هيفنبس تم تمييزه عن فلبس الهجينة في وصمة سلبية م (الشكل 2). ماليميدي-البيوتين تصريف الكفاءة Cys هيفنبس تم التعديل تم اختباره أولاً مع النشاف الغربية عن طريق ربط ستريبتافيدين تشيميلومينيسسينت. وبعد الاقتران ماليميدي-البيوتين، تعديل Cys هيفنبس عرض ستريبتافيدين ملزم إشار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على النقيض من الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً في مجال الهندسة الوراثية، التي عادة ما يستغرق أسابيع، هنا نظهر خطوتين بسيطة وإجراءات تصريف المواد الكيميائية خطوة واحدة، والتي يمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام، إضافة السرطان استهداف يجند و/أو الأسفار صبغ الكشف عن مواقع Cys/ليز هيفنبس. يمكن استخدام هذا الأسلوب إلى الشاشة ليجند أفضل للهدف من مجموعة من المرشحين، وبالتالي يستفيد من خدمات توليف جزيء الببتيد الصغيرة المتاحة في فترة زمنية معقولة التكلفة والتسليم.

على عكس الهندسة الوراثية التقليدية، التي يمكن فقط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

الكتاب نعترف بالرعاية من التمويل اللازم يستبدل بالمعاهد الوطنية للصحة منح #' ق: AI095382، EB021230، CA198880، المعهد الوطني للأغذية والزراعة، فضلا عن البرنامج "أستاذ مرموق في فنلندا".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدات غسيل الكلى المصغرة ، 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572وحدة غسيل الكلى المصغرة
خمس خلاياThermo Fisher ScientificB85502Tn5 خلايا
SF9 Cells  ؛Thermo Fisher Scientific11496015خلايا Sf9
التعبير عن الفيروس العصبي Bac-to-BacThermo Fisher ScientificA11101 ، A11100نظام التعبير عن الفيروس Baculovirus
Bac-to-Bacالحياة10359-016 ، 10360-014 ، 10584-027 ، 10712-024Bacmid
ESF921 أنظمة التعبير عن وسائط خلايا الحشراتLLC96-001-01 وسائط الخلية
Cy5.5 NHS ester ، 5mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns ، 40K MWCO ، 0.5 ملThermo Scientific87766عمود تحلية
المياه MES HydrateSigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
أجهزة الطرد المركزي فائقة الوضوح Thinwall أنابيب الطرد المركزيBeckman Coulter، Incتعتمد على الدوارأنبوب الطرد المركزي الفائق
NuPage 4-12٪ Bis-Tris المواد الهلامية البروتينThermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS هلام البروتين
Cellfectin II كاشفThermo Fisher Scientific10362100كاشف التعداء
EMS توهج المفرغالمجهر الإلكترون علمالتفريغ توهج
عالية نظام تقنيات حشرة

المراجع

  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
  3. Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
  4. Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
  5. Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
  6. Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
  7. Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
  8. Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
  9. Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
  10. Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
  11. Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
  12. Technologies, I. bL. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System: User Manual. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf (2015).
  13. Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
  14. Technologies, N. bL. Vol. MAN0007891 1-2. , Life Technologies. (2013).
  15. Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بيوتين المالييميدربيطة LXY30وسم Cy5.5 الفلوريكيمياء النقرتصوير المجهر الإلكتروني النافذالمجهر البؤريعمود إزالة الأملاح بالدوران
الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.