نقدم بروتوكول لاستخدام الفحص المجهري STED في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا ب التي انتشرت في كوفيرسليبس المغلفة بالأجسام المضادة لمستقبلات الخلية ب، ونموذج للمرحلة الأولى تشكيل المشبك محصنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ب الخلايا التي تربط المستضدات غشاء محدد (مثلاً، على سطح خلية عرض مستضد) تشكيل المشبك منأى، بنية خلوية متخصصة التي يحسن إشارات مستقبلات (المركز) ب-الخلية واقتناء مستضد المركز بوساطة. كلا يعيد البناء cytoskeleton أكتين وإعادة توجيه الشبكة microtubule نحو الموقع الاتصال مستضد ضرورية لتشكيل المشبك محصنة. يعيد البناء من cytoskeleton أكتين في حلقة المحيطية كثيفة من أكتين و يرافق الاستقطاب مركز تنظيم microtubule نحو المشبك محصنة. البروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة، فضلا عن البروتينات القشرية نهاية بالإضافة إلى التقاط التوسط التفاعلات الفيزيائية بين سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، التي تسمح لهم بإعادة تنظيمها بطريقة منسقة. توضيح آليات أن تحكم عملية إعادة التنظيم هذه سيتوسكيليتال، فضلا عن فهم كيف أن هذه الهياكل cytoskeletal تشكيل تشكيل المشبك محصنة ويشير إلى المركز، يمكن أن توفر أفكاراً جديدة في تنشيط الخلية ب. وهذا قد ساعد بوضع نهج مجهرية فائقة القرار التي تكشف عن تفاصيل جديدة عن شبكة سيتوسكيليتال المنظمة. يصف لنا هنا طريقة لاستخدام الميكروسكوب استنفاد (STED) حفز الانبعاثات في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات transfected microtubule معلم بروتينات فلورية خضراء بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا باء. نموذج الأحداث المبكرة في تشكيل المشبك محصنة، نسمح للخلايا ب ينتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، التي تبدأ إشارات المركز وإعادة عرض cytoskeleton. نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة للتعبير عن التجارة والنقل الانصهار البروتينات في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد اللمفاوية للخلية التي يسببها Ig مكافحة انتشار وتثبيت الخلية اللاحقة وإيمونوستاينينج، والحصول على الصور والخطوات deconvolution صورة. الصور عالية الدقة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات تسمح بتصور في نفس الوقت هياكل أكتين وميكروتوبوليس والبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة microtubule التي قد تربط هذه الشبكات سيتوسكيليتال اثنين.
المقدمة
عند ربط الخلايا ب الاستقطاب صفائف مستضدات (مثلاً، عرض على سطح عرض مستضد الخلايا (Apc))، مستقبلات ب-الخلية الناتجة (المركز) مما يشير إلى تشكيل بنية المشبك محصنة ضد الكلاسيكية، الذي كان أول وصف في محركات الأقراص تي الخلايا1،2،3،4،5،6،،من78،9،10، 11،،من12....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافق جميع الإجراءات الحيوان بالجامعة "اللجنة الرعاية الحيوانية في مقاطعة كولومبيا البريطانية".
1-الإعراب عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء-الانصهار في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد الليمفاوية
- الثقافة A20 الخلايا في إكمال ربمي المتوسطة (ربمي-1640 تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، الجلوتامين 2 مم، بيروفات 1 مم، 50 يو/مليلتر البنسلين و 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع 5 % CO2.
- تحضير الكاشف تعداء (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: قد تم تحسين هذا البروتوكول الكواشف محددة وبروتوكول....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ب خلايا تنتشر في Ig مكافحة المعطل تداولها، يوفر STED المجهري تستخدم بالاقتران مع برامج deconvolution الصور دقة أعلى من هياكل سيتوسكيليتال من الفحص المجهري [كنفوكل]. وهذا واضح في الشكل 1، حيث كانت تصور الشبكة أكتين و استخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه. مقارنة بين [كنفوكل] وصور فائقة الدقة STED من نفس العينة تبين أن الصور STED من دقة أعلى، وتكشف عن أكثر تفصيلاً هياكل cytoskeleton أكتين (الشكل 1). كما يبين هذا الشكل أن deconvolution ضر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن الحصول على صور مفصلة للهياكل سيتوسكيليتال باستخدام مجهرية فائقة القرار STED، الذي يمكن نظرياً أن التوصل إلى قرار 50 نانومتر، مقارنة بالفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية، الذي هو قرار حيود محدودة ~ 200 nm 24-كما تم تعزيز القدرة على حل الهياكل الدقيقة باستخدام البرمجيات deconvolution لحساب الموقف الأكثر احتمالاً لمصدر الضوء الأصلي من إشارة الملاحظة fluorescence "غير واضحة". ويصف هذا البروتوكول أساليب لاستخدام STED بصورة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، فضلا عن البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر "مرفق التصوير معهد علوم الحياة جامعة كولومبيا البريطانية" (LSI) لدعم وصيانة المجهر STED. تم تمويل هذا العمل بمنحه #68865 من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (M.R.G.). ونشكر الدكتور كوزو كايبوتشي (جامعة ناغويا، ناغويا، اليابان) على بلازميد CLIP-170-التجارة والنقل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية>ثقافة الخلايا | |||
| A20 خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ب للفأر | ATCC | TIB-208 | سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الفئران من أصل Balb / c الذي يعبر عن BCR المحتوي على IgG على سطحه |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| مصل الأبقار الجنيني | ثيرمو فيشر العلمي | 12483020 | تعطيل الحرارة عند 56 o< / sup>C لمدة 30 دقيقة |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| بيروفات الصوديوم | Millipore Sigma | P5280 | |
| البنسلين الستربتومايسين | ثيرمو فيشر سائل 15140122 | العلمي ، 10،000 | |
| وحدة <قوي > مواد إضافية للخلايا البائية الأولية < / قوي > | |||
| 70 - & ميكرو ؛ مصفاة الخلايا m | Corning | 352350 | |
| طقم عزل الخلايا البائية المغناطيسية القائمة على الخرزة | تقنيات الخلايا الجذعية | 19854 | طقم عزل الخلايا البائية للفأر EasySep |
| عديد السكاريد الدهني (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS من الإشريكية القولونية < / em>0111: B4 |
| عامل تنشيط الخلايا B (BAFF) | R & D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid ترميز CLIP-170-GFP | هدية من الدكتور كوزو كايبوتشي (جامعة ناغويا، ناغويا، اليابان)؛ موصوفة في Fukata et al.< / em> Cell< / strong> 109: 873-885 ، 2002 | ||
| الكواشف والمعدات الموصى بها < / قوية> | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | اتبع إرشادات الشركة المصنعة لخلط كواشف الإرسال مع |
| نموذج DNA Amaxa Nucleofector 2b | Lonza | AAB-1001 | برنامج L-013 المستخدم |
| ألواح فالكون 6 آبار ، TC المعالجة ، معقمة | Corning | 353046 | |
| Name< / strong> | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 غطاء نظارات | توماس Scientific | 1217N81 | منتج مشابه: كتالوج Marienfield-Superior # 117580 |
| ملقط | فيشر Scientific | 1381242 | تشريح ملقط منشق ناعم للغاية |
| Falcon 12 بئر نسيج معقم لوحة زراعة أنسجة البوليسترين | Corning | 353043 | |
| 100٪ ميثانول | فيشر Scientific | A412-4 | |
| محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) بدون كالسيوم أو مغنيسيوم | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد | جاكسون ImmunoResearch | 115-005-008 | لخلايا A20 |
| الماعز المضاد للفأر الجسم المضاد IgM | جاكسون ImmunoResearch | 115-005-020 | للخلايا البائية للفأر |
| الأولية<قوي>الاسم | الشركة | رقم الكتالوج | <قوي>تعليقات |
| <قوي>تلطيخ | |||
| بارافورمالدهيد (محلول مخزون 16٪)علوم | المجهر الإلكتروني | 15710 | تمييع مع PBS لتركيز العمل |
| الجلوتارالديهايد (محلول مخزون 50٪) | Millipore Sigma | 340855 | تمييع مع PBS لتركيز العمل |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| الأرانب الأجسام المضادة للتوبولين | Abcam | ab52866 | 1: 250 التخفيف الموصى به ولكن يجب تحسينه |
| Alexa Fluor 532-مترافق الماعز المضاد للأرانب IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | يوصى بتخفيف 1: 100 ولكن يجب تحسينه |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1: 100 التخفيف المعاد توصيته ولكن يجب تحسينه |
| إطالة الماس المضاد للتلاشي | Thermo Fisher Scientific | P36970 | بدون DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| الاسم< / strong> | Company< / strong> | رقم الكتالوج< / strong> | تعليقات< strong> |
| Materials< / strong> | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl 2< / sub> | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na 2< / sub>HPO4< / sub> | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4< / sub> Fisher | Scientific | M63 | |
| سكر العنب | فيشر Scientific | D16-500 | |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| المجهر | |||
| Leica SP8 TCS STED مجهر | Leica | ||
| Huygens برنامج تفكيك الالتواء | Scientific | انظر https://svi.nl/HuygensProducts |
المراجع
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
