مقالة منهجية

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

DOI:

10.3791/57048

⸱

أغسطس 30, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 2Children's Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزر البنكرياس، وتسمى أيضا الجزر من Langerhans، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج الهرمونات لتنظيم الجلوكوز وغيرها من الوظائف البيولوجية الهامة. الجزر تتكون في المقام الأول من خمسة أنواع من الخلايا التي تفرز الهرمونات: خلايا α تفرز الجلوكاجون، خلايا بيتا تفرز الأنسولين، خلايا δ تفرز سوماتوستاتين، خلايا تفرز غريلين، وخلايا PP تفرز ببتيد البنكرياس. 60 إلى 80٪ من الخلايا في الجزر هي خلايا بيتا، والتي هي أهم خلية السكان لدراسة إفراز الأنسولين. جزر البنكرياس هي نظام نموذج حاسم لدراسة إفراز الأنسولين في الجسم الحي السابق. الحصول على جزر عالية الجودة هو ذو أهمية كبيرة لبحوث مرض السكري. تتطلب معظم إجراءات عزل الجزيرة صعوبة تقنية في الوصول إلى موقع حقن الكولاجين، وإجراءات الهضم القاسية والمعقدة، وخطوات تنقية التدرج المتعددة الكثافة. تتميز هذه الورقة بطريقة بسيطة عالية الإنتاجية لعزل جزيرة الماوس مع أوصاف مفصلة ومظاهرات واقعية، وتبين الخطوات المحددة التالية: 1) حقن الكولاجين P في أمبولة فاتر، وهي منطقة صغيرة تنضم إلى قناة البنكرياس و القناة الصفراوية المشتركة، 2) الهضم الأنزيمي والفصل الميكانيكي للالبنكرياس exocrine، و 3) خطوة تنقية التدرج واحد. مزايا هذه الطريقة هي حقن إنزيم الجهاز الهضمي باستخدام أمبولة أكثر سهولة من Vater، والهضم أكثر اكتمالا باستخدام مزيج من النهج الأنزيمية والميكانيكية، وأبسط خطوة تنقية التدرج واحد. ينتج هذا البروتوكول ما يقرب من 250-350 جزيرة لكل ماوس; والجزر الصغيرة هي مناسبة لمختلف الدراسات في الجسم الحي السابق. المحاذير المحتملة من هذا الإجراء يحتمل أن تكون مصحوبة بأضرار الجزر بسبب الهضم الأنزيمي و / أو حضانة التدرج لفترات طويلة، وكلها يمكن تجنبها إلى حد كبير عن طريق تبرير الإعلان الدقيق لوقت الحضانة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك طريقتان شائعتان في الأدب لعزل الجزيرة البنكرياسية. واحد يتطلب استئصال البنكرياس وتقطيعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الجراحية، ومن ثمهضمه في محلول الكولاجين 1،2،3. طريقة أخرى أكثر دقة هو استخدام شبكة من القنوات الموجودة في البنكرياس لإدخال إنزيم الجهاز الهضمي. وقد استخدمت المواقع التالية لحقن الإنزيم الهضمي: تقاطع القناة الصفراوية والكيسي، المرارة في القناةالصفراوية المشتركة، أو القناة الصفراوية المشتركة نفسها 1،4،5. ومن المعروف أن الجزر لا توزع بالتساوي في البنكرياس. منطقة الطحال يحتوي على معظم الجزر6. في حين أن الطريقة الثانية باستخدام الطرق التشريحية لتقديم الإنزيمات الهضمية يسمح لضخ أكثر اكتمالا من البنكرياس، بما في ذلك منطقة الطحال، وهذا الإجراء غالبا ما يتطلب لقط أو خياطة أمبولة من Vater التي هي من الناحية الفنية تحديا. من حيث تنقية جزيرة، وقد استخدمت التدرجات كثافة متعددة، فضلا عن مصافي الخلاياوالتراجع المغناطيسي لتنقية الجزر 3،7. استخدام هذه التدرجات يمكن أن تستغرق وقتا طويلا والتدرجات فيكول يمكن أن يؤدي إلى ضرر سام من الجزر8.

ويستند البروتوكول الحالي على الطريقة التي وصفها لي وآخرون7، مع تعديلات إضافية تضاف على أساس تجربة أنفسنا والآخرين1،4. الخطوات الأكثر أهمية من بروتوكولنا هي لقط من القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من نهاية الكبد، حقن الكولاجين P عن طريق أمبولة فاتر لهضم الأنسجة exocrine، ومن ثم استخدام حمام الماء تهتز لتسريع الهضم ميكانيكيا1، 4،7. في وقت لاحق، يتم تطبيق حل 'STOP' لمنع المزيد من الهضم من الجزر. يستخدم HBSS لغسل ما تبقى من الكولاجين P وSTOP الحل. عندما تم استخدام طريقة فيكول لتنقية الجزر البشرية، أفيد أن العائد هو ضعف الجزر مع قدرة وظيفية أكبر (على سبيل المثال، إفراز الأنسولين) بالمقارنة مع استخدام التدرجات Percoll9. ومع ذلك، شككت الدراسات في استخدام تدرج فيكول بسبب تأثيره السام على الجزر1،10. وقد أفيد أن التدرج Histopaque يوفر حركية تنقية الأمثل لعزل جزيرة الماوس، والتي تنتج غلةجيدة من الجزر عالية الجودة مع خطوات أبسط وتكلفة أقل 1. في بروتوكولنا، يستخدم Histopaque-1077 لتنقية الجزرمن الأنسجة المتبقية الأخرى 8،11. يمكن زراعة الجزر المقطوعة في وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640، أو استخدامها مباشرة في RNA /البروتين الكم.

بروتوكولنا، وذلك باستخدام مزيج من الكولاجين P الهضم وخطوة تنقية التدرج واحد، هو أبسط من البروتوكولات المنشورة الأخرى. أسلوبنا لا يتطلب إجراءات جراحية صعبة ولها فقط بضع خطوات بسيطة. والأهم من ذلك، هذا البروتوكول تنتج باستمرار عائد جيد من الجزر الوظيفية عالية الجودة (250-350/mouse) كما أبلغنا12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (ACUC) من جامعة تكساس A & M. تظهر الأدوات الجراحية اللازمة في الشكل 1 ويظهر الرسم التخطيطي للإجراء في الشكل 2.

1- الحلول

  1. إعداد حل الملح المتوازن هانك (HBSS) عن طريق إضافة 100 مل من 10X HBSS (من المخزون) إلى 900 مل من الماء المقطر لجعل 1 L HBSS (1X).
  2. إعداد حل STOP (يجب أن تكون طازجة وينبغي استخدامها في غضون 1 ح) عن طريق إضافة 50 مل من 100X المصل البقري الجنيني (FBS) إلى 450 مل من الجليد البارد 1X HBSS؛ هذا يجعل 500 مل إيقاف الحل. حافظ على حل STOP عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  3. إعداد محلول الكولاجين P (يجب أن تكون طازجة في غضون 1 ساعة من استخدامها) عن طريق إضافة 1 ملغ / مل من الكولاجين P إلى الجليد البارد 1X HBSS. استخدام 6 مل / ماوس.
    1. إضافة 0.05٪ (ث / الخامس) الزلال المصل البقري (BSA) إلى محلول الكولاجين P (وهذا يوفر المواد الغذائية للجزر المعزولة). على سبيل المثال، استخدم 3 ملغ BSA في 6 مل كولاجيناز P الحل. الحفاظ على الجليد.
    2. حساب وإعداد كمية الكولاجين P اللازمة لجميع الفئران في أنبوب واحد 50 مل.
  4. إعداد كامل RPMI 1640 المتوسطة عن طريق إضافة 10٪ FBS، 100 U/mL البنسلين، 100 ميكروغرام / مل ستربيوميسين، INS-1 ملحق الخلية (10 مل HEPES، 2 مل L-الجلوتامين، 1 mM بيروفات الصوديوم، و 0.05 مل 2-mercaptoethanol) إلى 500 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام التي تحتوي على 5.5 M الجلوكوز لاستخدامها للثقافة بين عشية وضحاها والحضانة.

2- الإعداد

  1. ملء ثلاثة أنابيب 50 مل من 25 مل RNase تثبيط الحل، 70٪ الإيثانول أو المقطر H2O. سيتم استخدام هذه الحلول لتنظيف الأدوات الجراحية قبل وأثناء العملية.
  2. نقع نصائح من الأدوات في RNase تثبيط الحل لمدة 30 دقيقة قبل بدء البروتوكول. هذا يلغي أي RNase المحتملة على الأدوات.
  3. قبل قطع منصات ماصة إلى 6 في × 6 في الحجم للاستخدام أثناء الجراحة.
  4. إعداد 1X HBSS الحل مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية. إعداد حل STOP قبل الجراحة. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. إعداد محلول الكولاجين P مباشرة قبل الجراحة وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: يجب استخدام هذا في غضون 2 ساعة من الإعداد.
  6. تسمية أنابيب 50 مل للهضم وتنقية; إعداد 2 أنابيب لكل فأر، واحد للهضم والآخر لتنقية islet. تأكد من أن هوية الحيوان على كلا الأنبوبين.
  7. إضافة 3 مل من محلول كولاجيناز P في أول أنبوب 50 مل. سيتم حقن 3 مل المتبقية من الكولاجين P.
  8. رسم ما تبقى 3 مل من محلول الكولاجين في حقنة 3 مل شنت مع 30 G 1/2 في إبرة. ضع الحقنة على الثلج

3- الإجراء

  1. إزالة جميع الأدوات من RNase تثبيط الحل، ثم تراجع لهم أولا في الأنبوب مع الإيثانول 70٪، ثم في أنبوب يحتوي على المقطر H2O، ثم الهواء الجاف على منشفة ورقية نظيفة.
  2. ضع الماوس في غرفة تحتوي على 0.5 مل من الإسيوفروران حتى يتم التخدير بعمق الماوس.
  3. إزالة الماوس من الغرفة والتحقق من حالة التخدير عن طريق معسر وسادة القدم مع ملقط. ويستند التخدير العميق على ملاحظة أن التنفس تصبح بطيئة باطراد والماوس غير رد الفعل على القدم معسر. بعد التأكد من أن الماوس هو التخدير العميق ، قتل الفأر مع خلع عنق الرحم ، ثم وضع الماوس على لوحة ماصة.
    1. وضع الماوس التخدير على بطنه، وتطبيق الضغط على الرقبة وخلع العمود الفقري من الدماغ عن طريق سحب الذيل.
  4. الشريط أطراف الماوس في موقف supine إلى وسادة ماصة، رش الجسم مع الإيثانول 70٪، ومسح الزائدة من الإيثانول الزائد.
  5. استخدام ملقط الزجاج غطاء ومقص الجراحية المنحنية لجعل الشقوق. أولا جعل شق أفقي على جلد منطقة البطن (~ 3 سم)، وسحب الجلد مفتوحة على مصراعيها لفضح جدار البطن. ثم جعل شق عمودي (~ 3-4cm) على الشمع البطني لفضح البنكرياستماما في تجويف البطن (الشكل 3).
  6. دفع فصوص الكبد متفوقا لفضح القناة الصفراوية، وسوف تظهر كأنبوبوردي شاحب (الشكل 3).
  7. نقل الأمعاء بعناية من المنطقة القطنية / الحرقفية اليمنى من تجويف البطن إلى اليمين، وتعريض القناة الصفراوية والشريان الكبدي (الشكل3).
  8. بعناية المشبك القناة الصفراوية المشتركة باستخدام serrefines شوارتز الصغيرة (الشكل1) أقرب إلى الكبد قدر الإمكان.
  9. تحديد أمبولة فاتر، الذي يقع في الحليمة الاثني عشر، التي شكلتها اتحاد قناة البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة. أمبولة Vater يبدو منتفخا عند النظر إليها تحت المجهر تشريح الذي هونقطة الدخول إلى القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 4).
    ملاحظة: ضبط كثافة / زاوية ضوء المجهر تشريح يمكن أن تجعل من الأسهل لتحديد موقع.
  10. إدراج حقنة مع 3 مل من محلول الكولاجين P في أمبولة من Vater. دفع الإبرة في القناة لحوالي 1/4 من طول القناة الصفراوية المشتركة (أمبولة يؤدي إلى القناة) كما هو مبين في الشكل 5.
  11. مرة واحدة الإبرة في أمبولة، تأكد من أن اتجاه الإبرة هو من هذا القبيل أنه موازي ة مع القناة.
  12. استقرار الإبرة عن طريق لقط مع ملقط Adson الصغيرة لمنعها من ثقب القناة (الشكل5).
  13. حقن ببطء وثبات 3 مل من محلول الكولاجين P من المحاقن في القناة الصفراوية المشتركة (ما يكفي ليشعر المقاومة) كما هو مبين في الشكل 6. والهدف من ذلك هو خلق ضغط التدفق الخلفي لإجبار الكولاجين على دخول قناة البنكرياس. يعتبر الحقن ناجحا إذا كان الرأس والرقبة والجسم ومنطقة الذيل من البنكرياس كلها تضخمت تماما.
    ملاحظة: سيكون عائد الislet منخفضًا إذا لم يتم تضخم البنكرياس بشكل كامل، أو إذا لم يتم تضخيم منطقة الطحال بشكل كامل. منطقة الطحال يحتوي على أكبر عدد من الجزر6. يمكن تأكيد التضخم من خلال ظهور المساحات المفتوحة بين أنسجة البنكرياس التي تمتلئ بالحل.
  14. تشريح بعناية من البنكرياس تضخم ووضعها في أنبوب الهضم 50 مل التي تحتوي على 3 مل من الجليد الباردة كولاجيناز P الحل.
    1. إزالة البنكرياس باستخدام 2 ملقط (منحني ة ومايكرو Adson; انظر الشكل1): (بدءا من الطحال، وسحب البنكرياس بعيدا عن الطحال ومواصلة إزالة من المعدة وعلى طول الاثني عشر.
      ملاحظة: لا توجد شقوق مطلوبة.
    2. قم بتقطيع البنكرياس لمدة 3-5 ثوان في أنبوب الهضم مع 3 مل من محلول كولاجيناز P المثلج باستخدام مقص جراحي ناعم (الشكل7A).
  15. تأمين الأنبوب إلى رف في حمام مائي 37 درجة مئوية ويهز في 100-120 دورة في الدقيقة لمدة 12-13 دقيقة تقريبا.
  16. بعد الحضانة، يهز بلطف الأنابيب باليد لتعطيل الأنسجة حتى يصبح محلول الهضم الكولاجين P متجانسة (الشكل7B). يتم تأكيد التجانس من خلال ظهور يشبه الجسيمات الدقيقة من البنكرياس. حوالي 30 ث من لطيف المصافحة اليد عادة ما يكون كافيا. عقد الأنبوب حتى الضوء لفحص ما إذا كان الأنسجة متجانسة بشكل جيد. يهز لآخر ~ 15 s إذا لزم الأمر.
  17. مرة واحدة هضمها، على الفور وضع الأنابيب على الجليد وإضافة 40 مل من الجليد الباردة وقف الحل لإنهاء الهضم الأنزيمي.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن ترك أنابيب الهضم على الجليد تصل إلى 2 ساعة، إذا كان العمل على فئران متعددة.
  18. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو في 300 × ز لمدة 30 ق (درجة حرارة الطرد المركزي مرنة).
    ملاحظة: استخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو بحيث يتم تشكيل بيليه الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل وليس على جدار الأنبوب؛ هذا أمر بالغ الأهمية لتحسين غلة الهَسَلِت.
  19. Decant وتكرار الطرد المركزي مع حل STOP 2 مرات أخرى، وdecanting الحل بعد كل تدور. استخدام 20 مل من حل STOP لكل غسل اللاحقة.
    1. قبل كل تدور، وتعطيل بيليه عن طريق هز بلطف بيليه الأنسجة في أنبوب 50 مل في محلول وقف 20 مل.
  20. إعادة تعليق بيليه الأنسجة مع 40 مل من الجليد الباردHBSS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 30 ق.
  21. Decant وتكرار الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو مع حل HBSS مرتين أكثر، وdecanting الحل بعد كل تدور. استخدام 20 مل من HBSS لكل غسل.
    1. قبل كل تدور، وتعطيل بيليه، لفصلها من الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق هز بلطف أنبوب يحتوي على 20 مل HBSS الحل.
  22. بعد الطرد المركزي الأخير إزالة جميع HBSS.
  23. ثم إضافة 5 مل من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب 50 مل التي تحتوي على بيليه. دوامة لفترة وجيزة في سرعة منخفضة حتى متجانسة.
  24. إضافة آخر 5 مل من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب 50 مل. لا دوامة / مزيج.
    ملاحظة: من الضروري أن تبقى ثابتة ولا يزال للسماح أفضل التدرج لتشكيل دون تعطيل.
  25. ماصة 10 مل من درجة حرارة الغرفة HBSS العازلة في الأنبوب (التي تحتوي على التدرج الكثافة)، قطرة بقطرة بلطف وببطء للسماح للتدرج لتشكيل. استخدام بندقية ماصة مع ماصة 10 مل لإضافة HBSS قطرة.
  26. باستخدام جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو، تدور أنابيب في 1700 × ز لمدة 15 دقيقة.
  27. بعد الدوران، قم بإزالة الأنابيب بعناية دون إزعاج التدرج. باستخدام بندقية ماصة مبتلة مسبقا مع HBSS الباردة (ماصة HBSS صعودا وهبوطا)، ماصة من طبقة الجزر (5-10 مل) شكلت بين تدرج الكثافة وHBSS في أنبوب جمع جزيرة 50 مل جديدة.
    ملاحظة: من المفيد أن تبلل الماصة مع HBSS الباردة قبل الأنابيب الجزر لمنع الجزر من التمسك الجدران الداخلية للماصة.
    1. في حالة عدم اكتمال الفصل، تكون الجزر الصغيرة مرئية في طبقة تدرج الكثافة، وصالة من كامل 10 مل من تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) جنبا إلى جنب مع طبقة جزيرة شكلت في واجهة (فقط لترك حوالي 8-10 مل من الطبقة العليا HBSS وراء).
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي جمع كل من طبقة islet وطبقة تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) إلى جمع الحطام الذي قد يطيل وقت انتقاء الislet، ولكن لن يتم تغيير أية خطوات أخرى. جمع كل من هذه الطبقات ليست ضرورية عندما يتم تشكيل طبقة islet بشكل جيد.
  28. إضافة 20 مل من الجليد البارد HBSS إلى أنبوب 50 مل الجديد الذي يحتوي على الجزر، ثم الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 3 دقائق في جهاز طرد مركزي يتأرجح دلو.
  29. بعد تدور، ماصة بعناية (لاdecant)من supernatant (ترك ~ 3 مل في الجزء السفلي) دون إزعاج بيليه التي تحتوي على الجزر في الجزء السفلي. تجاهل الـ supernatant.
  30. كرر الغسيل والطرد المركزي 3 مرات على الأقل. إضافة 20 مل من HBSS في كل مرة، وتأكد من تعليق بيليه قبل كل تدور.
  31. قم بتسخين زجاجة وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640 في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. بعد الطرد المركزي الأخير، وإزالة كل من HBSS وإضافة 4 مل من الوسائط RPMI-1640 كاملة أعدت سابقا (تحتوي على FBS، INS-1 ملحق الخلية والبنسلين / العقدية) إلى بيليه.
  32. قم بإزالة بيليه عن طريق الدوران بلطف في الأنبوب وصب على الفور وسائل الإعلام RPMI-1640 في طبق بيتري 100 مم. إضافة آخر 5 مل من وسائل الإعلام RPMI-1640 إلى الأنبوب ودوامة بلطف لغسل أي الجزر المتبقية، ثم أيضا صب وسائل الإعلام في نفس طبق بيتري.
    1. تحت مجهر تشريح، واختيار الجزر الصحية من طبق بيتري باستخدام ماصة 20 درجة مئوية، ووضعها في طبق بيتري جديد يحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 كاملة. عندما ينظر إليها تحت المجهر تشريح، يجب أن تظهر الجزر كروية / مستطيل والذهبي البني اللون مع سطح أملس بالمقارنة مع شفافة نسبيا، والأنسجة exocrine wispy.
      ملاحظة: عادة ما يتم تعيين تكبير مجهر تشريح في 12.5-16x. سوف تختلف غلة جزيرة اعتمادا على عوامل مختلفة بما في ذلك سلالة, عمر وجنس الماوس. عادة ما ينتج هذا البروتوكول 250-350 الجزر الصحية من عمر الماوس C57BL/6J صحية 4-10 أشهر.
  33. احتضان الجزر في حاضنة معقمة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 التسريب و 95٪ الهواء المرطب بين عشية وضحاها للتجارب في اليوم التالي، أو تجميد الجزر للتحليل المطلوب في وقت لاحق.
    1. مرة واحدة يتم تجميد الجزر الصغيرة، لا يمكن استخدامها لإفراز الاختبارات، فقط RNA أو البروتين القياس الكمي. لجمع الخلايا لتجميد، ووضعها في المخزن المؤقت HBSS، وجمع جميع الجزر في 200-500 ميكرولتر من العازلة، ونقل إلى أنبوب 1.5 مل، الطرد المركزي 350 × غرام لمدة 1-2 دقيقة، وإزالة supernatant ترك ما لا يزيد عن 30-40 محلول لتر، ووضع في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير ( عدة أيام) أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إكمال هذا الإجراء بشكل صحيح يتطلب بعض الفهم لتشريح الماوس في تجويف البطن. وهذا يسمح لتحديد السليم من أمبولة من Vater ولقط من القناة الصفراوية المشتركة. يستغرق الإجراء بأكمله عادة 1-2 ساعة. ومن الأكثر كفاءة عزل الجزر الصغيرة من 4-6 فئران في نفس الوقت، لذلك يمكن طرد العديد من العينات معاً. ويختلف وقت قطف الجزر، حسب عدد الجزر وكفاءة الهضم؛ قد يستغرق الأمر حوالي ساعة لاختيار 250-350 جزيرة صغيرة من فأر واحد.

في هذه الورقة، يتم تضمين عدد من الصور واقعية جدا: الشكل 3 يظه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشمل هذا البروتوكول التسريب الكولاجينوووووووالهضم، تليها تنقية الجزر. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي الحقن الفعال والتسريب الكامل من البنكرياس1،4،7. طريقة التسليم من هذا البروتوكول يسمح للإنزيم لاجتياز الطرق التشريحية لهضم أفضل الأنسجة exocrine المحيطة الجزر1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هي مناسبة تماما للهضم الكامل للمنطقة الطحال، والتي لديها أعلى تركيز من الجزر4

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للغاية للسيدة جنيفر مونغيا على توضيحها الفني للرسم التخطيطي. نشكر السيد مايكل ر. هونيغ في محطة الإذاعة العامة المجتمعية في هيوستن KPFT على مساعدته التحريرية. تم دعم هذه الدراسة من قبل الجمعية الأمريكية للسكري #1-15-BS-177 (YS)، وNIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). كما تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1010840 (YS) وR01 DK095118 (SG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 مل حقنةBD309657Hoding collagenase P
Coverglass ملقطVWR82027-396عقد جلد الفأر للمساعدة في إجراء الشق
ملقط منحنيZ168696الأنسجة أثناء إزالة البنكرياس
B13B16A الأيزوفلورانبيراماللتخدير الفئران قبل الجراحة
أطباق بتري 100 ممVWR30-2041يستخدم لثقافة الجزر
الصغيرة 30 G. ½ بوصة إبرةBD305106لاختراق أمبولا من فيتر لتوصيل الكولاجيناز P - يتم استخدام هذا المقياس لأنه يناسب بشكل جيد معظم أنابيب CBDs
50 ملVWR89039-658عقد أنسجة البنكرياس المهضومة ، والكولاجيناز P ، والجزر المنقاة
وسادات ماصة مع حاجز رطوبة مقاوم للماءVWR82020-845لامتصاص الدم من العمليات السيورجية
الطرد المركزي 5810R مع دلو التأرجح والقدرة على التباطؤEppendorf5811FJ478114تستخدم لأنسجة تكوير الأنسجة ، يتم تشكيل الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي - هناك حاجة إلى جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. كما أن ميزة التباطؤ مهمة لتشكيل طبقات التدرج.
كولاجيناز P- 1gRoche Diagnostics11249002001لهضم البنكرياس الإفرازي
مقص جراحي منحنيفيشر سيانتيفيك13-804-21لقطع بطن الفأر المفتوح
مجهر تشريحأوليمبوسSZX16يستخدم لتحديد الهياكل التشريحية الرئيسية لتوصيل الكولاجيناز بدقة إلى البنكرياس
محلول الملح المتوازن من هانك 10xCorning20-023-CVخلايا
الغسيل Histopaque-1077SigmaRNBF5100لتكوين التدرج
مصدر الضوءليدزLR92240تعزيز رؤية المجهر
RNaseZapFisher-ScientificAM9780لإزالة وسائط RNase
RPMI-1640 بدون L-GlutamineCorning15-040-CVالاستزراع
شوارتز ميكرو سيرفينات (مشبك الأوعية الدموية الدقيقة)أدوات العلوم الدقيقة18052-01لقط القناة الصفراوية المشتركة والشريان الكبدي
اهتزاز حمام مائيBoekel / Grant8R0534008مهم للهضم الميكانيكي للأنسجة الخارجية
مقص جراحي صغيرVWR82027-578أنسجة Cuttitng التي تنتشر إلى البنكرياس
عقد جهاز جزر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
  2. Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
  3. O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
  4. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).
  5. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
  6. Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
  7. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  8. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).
  9. Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374(1987).
  10. Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
  11. Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
  12. Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).
  13. Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

P

مقالات ذات صلة