مقالة منهجية

دراسة اتصالات مونوسينابتيك في المورفولوجية استخدام مقاومة تيدرودوتاكسين صوديوم قنوات

9.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57052

⸱

فبراير 14, 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

هذه المقالة ميزات أسلوب اختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية باستخدام تيدرودوتاكسين والقناة تيدرودوتاكسين-مقاومة الصوديوم، ناتشباك.

الملخص

هنا، يتم تطبيق تقنية جديدة تسمى "المقاومة تيتروتوكسين" (ت) إجراء هندسة عكسية ل Synapses السبر (تيربس) لاختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية المستهدفة. يعتمد الأسلوب على التعبير المشارك من المنشط المحورة وراثيا مع قناة الصوديوم تيدرودوتاكسين المقاوم، ناتشباك، في خلية presynaptic محددة. اتصالات مع الشركاء بعد متشابك المفترضة التي تحددها تسجيلات كامل الخلية حضور ت، الذي يمنع النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية التي لا تعبر عن ناتشباك. يمكن تعديل هذا النهج للعمل مع أي منشط أو تصوير الكالسيوم كمراسل للاتصالات. ويضيف تيربس إلى مجموعة متنامية من الأدوات المتاحة لتحديد الاتصال داخل الشبكات. ومع ذلك، تيربس فريدة من نوعها في ذلك تقارير موثوق بها أيضا السائبة أو نقل وحدة التخزين ونقل الفائض.

المقدمة

هدفا رئيسيا لعلم الأعصاب خريطة الاتصالات بين الخلايا العصبية لفهم كيفية تدفق المعلومات من خلال الدوائر. أصبحت العديد من النهج والموارد المتاحة لاختبار اتصال وظيفية بين الخلايا العصبية في مجموعة من الأنظمة النموذجية1،2. لإنشاء الرسوم البيانية الأسلاك الأكثر دقة باستخدام الكهربية، من المهم حل سواء كانت اتصالات الملحوظ بين خليتين مونوسينابتيك مقابل بوليسينابتيك وغير المباشرة وغير المباشرة. معيار الذهب لجعل هذا التمييز في الثدييات من الخلايا العصبية لقياس زمن الوصول بين action potentials واحد في الخلايا presynaptic وظهور التيارات بوستسينابتيك ضادات (ابسكس) في الخلايا العصبية الثانية. يجب أن يكون اتصالات مونوسينابتيك الاختفاء قصيرة بضع ميلي ثانية وتقلب منخفضة3. هذا النهج يمكن أن يكون معقداً في اللافقاريات الخلايا العصبية لأنه قد تحدث الاشتباكات العصبية في dendrites بهم بعيداً عن الموقع تسجيل جسدية، مما يؤدي إلى تأخير في الكشف عن سبب مسافات طويلة اليكتروتونيك بين كوندوكتانسيس بوستسينابتيك والتسجيل قطب كهربائي. يمكن إدخال هذه التأخيرات الغموض فيما يتعلق ببولي-مقابل الاشتراكات مونوسينابتيك. بالإضافة إلى ذلك، الأحداث متشابك الصغيرة قد تسوس قبل الوصول إلى الموقع تسجيلات جسدية، وقيادة النشاط presynaptic أقوى، من المرجح أن تجنيد الأحداث بوليسينابتيك.

وقد وضعت تقنيات مختلفة لاختبار اتصالات مونوسينابتيك في اللافقاريات. نهج واحد يستخدم الأيونات الموجبة divalent عالية الحلول (مرحبا دي) التي تحتوي على فائض ملغ++ وكاليفورنيا++. يمنع هذا الحل الاتصالات بوليسينابتيك باحتمال الإفراج عن الحد وزيادة إمكانات العمل عتبة لصالح كشف الإدخال مونوسينابتيك4،5. تحديد نسبة دقة ملغ++ بكاليفورنيا++ المطلوبة، ومع ذلك، ليست تافهة، وقد تستمر الاشتراكات بوليسينابتيك لتحفيز متواضعة حتى6. نهج بديل يسمى "إعادة تشكيل" التجارة والنقل عبر الشركاء متشابك (فهم) يستفيد من القرب بين الأغشية قبل وبوستسينابتيك عثر عليها في نهايات للاستدلال اتصال مونوسينابتيك 7. هنا، وأعرب عن مكون البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في إحدى الخلايا العصبية، ويعبر عن جزء مكمل للجزيء بشريك بوستسينابتيك المفترضة. وجود الأسفار يشير إلى أن الخلايا العصبية اثنين في قرب قريبة ما يكفي للسماح بإعادة تشكيل جزيء بروتينات فلورية خضراء وينطوي على وجود المشبك. فهم يمكن تقرير نهايات زورا، رغم ذلك، إذا خليتين عن كثب قد الرئيسي يعارضها الأغشية، كما هو الحال في أحد الأعصاب أو كراسة. المتغيرات لفهم القضاء على هذه المغلوطة بالربط الجزء بريسينابتيك من التجارة والنقل مباشرة إلى سينابتوبريفين، مما يتيح إعادة تشكيل فقط في نهايات نشط8. في حين قد ساعدت في تحديد الربط الوظيفي في المورفولوجية CNS فهم وعن المتغيرات، بعض قد لا إجراء اتصالات مرئية بفهم إذا كانت المسافات بين الشركاء قبل وبوستسينابتيك كبيرة نسبيا. وهذا ذات الصلة لا سيما في تقييم نقل وحدة التخزين المرتبطة نيورومودوليشن9 أو تثبيط جابايرجيك10.

هنا، هو أظهر تقنية تكميلية ورواية لاختبار اتصالات مونوسينابتيك مباشرة في المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي. يعمل هذا الأسلوب، تسمى "المقاومة تيدرودوتاكسين إجراء هندسة عكسية" لسبر سينابسيس (تيربس)، حسب تعبير المشاركين عن تيدرودوتاكسين (ت)-قناة مقاومة الصوديوم، ناتشباك، ومنشط أوبتوجينيتيك في خلية presynaptic أثناء التسجيل من المفترضة الشركاء بوستسينابتيك9. حضور ت، يتم منع جميع إمكانات العمل بوساطة النشاط في الخلايا غير تلك التي تعرب عن ناتشباك. قناة ناتشباك بشكل انتقائي يعيد استثارة في الخلايا المستهدفة presynaptic، تسمح بانتقال متشابك أثارت الضوء. هذا الأسلوب يسمح التنشيط قوية من الخلايا العصبية presynaptic، مثل أن اتصالات يمكن أن تحلها بوستسينابتيكالي تسجيل جسدية مع الحد من احتمال توظيف الدوائر بوليسينابتيك. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يسمح بدراسة حجم الإرسال ويكشف عن انتشار الإرسال صدر من خلية واحدة في جميع أنحاء دائرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكشف عن تيربس الطبيعة الكيميائية للاتصال من خلال الأدوية التقليدية. تيربس غير مناسبة للاستخدام في أي نموذج النظام يتيح التعبير المحورة وراثيا من قنوات الصوديوم ت غير متحسسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الذباب والمروج GAL4 تحديد خطوط

  1. حدد خط مروج GAL4 وعبوره مع الذباب يحمل التحوير UAS-ناتشباك والتحوير أوبتوجينيتيك للتنشيط.
    ملاحظة: يتم تحديد UAS-كشريمسون11 بسبب الموصلية عالية، والسهولة التي ينشط ناتشباك بوساطة إمكانات العمل. تتوفر UAS-ناتشباك وكشريمسون UAS من "مستودع مخزون بلومينغتون".
  2. إعداد الشبكية عبر كل كحل أسهم في الإيثانول (35 ملم)، وتخزين الحل في الثلاجة عند-20 درجة مئوية.
  3. ميليلتر 28 مزيج من هذا المخزون إلى حوالي 5 مل من امهاء البطاطا تقشر الغذاء وأضف هذا الخليط إلى الجزء العلوي من قنينة متوسطة المورفولوجية التقليدية.
  4. رفع الذباب الكبار إذ تعرب عن كشريمسون على الأغذية التي تحتوي على 0.2 مم كل-ترانس-الشبكية لمدة 1 – 3 أيام11.

2-إعداد الأوراق المالية ت

  1. إنشاء حل أسهم 1 مم تتكس في الماء المقطر أو منزوع. تخزين هذا الحل في ثلاجة مختبر لعدة أشهر. تدقيق سياسات المؤسسات فيما يتعلق بتخزين ت تصنيف العديد من المؤسسات ت كمادة خطرة أو السيطرة عليها.

3-إعداد الذباب للكهربية

  1. جمع يوم 1 – 3 الذباب الكبار القديمة التي تثار على الطعام مع كل-ترانس-الشبكية.
    ملاحظة: تشير إلى مورثي وتيرنر في عام 2013 لوصف مفصل للتصحيح لقط المورفولوجية الخلايا العصبية،من1213.
  2. وضع الذباب في قنينة زجاج التﻷلؤ. مكان القنينة على الجليد لمدة 1 دقيقة شل الذباب.
  3. استخدام الملقط الخشنة لإدراج يطير إلى دائرة تسجيل مصنوعة خصيصا. وتتكون الغرفة 3 ½ "دائرة ليزر قطع من اﻷكريليك 1/16". قص حفرة ¾ "داخل المركز حيث تم إرفاق إحباط مخصصة مع الإيبوكسي الجزء 2. إحباط يحتوي على الثلاثي على شكل الأمل في أن يتم إدراج الطاير.
  4. تطبيق الشمع أو الإيبوكسي الأشعة فوق البنفسجية الشفاء حول الحيوان لضمان الحصول عليها بشدة داخل قاعة تسجيل.
  5. إلقاء الضوء على الإعداد مع ألياف ضوئية gooseneck للتصور تحت ستيريوميكروسكوبي. مجموعة ألياف gooseneck لإنارة منحرف بضبط لهم ذلك لإلقاء الضوء على الطاير مباشرة من الجانب.
  6. ضبط مستوى الضوء إلى أدنى الإعداد الممكنة التي ما زال يسمح التصور الواضح ذبابة. سوف تختلف هذه الكثافة الخفيفة عبر التجارب الفردية.
    ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول باستخدام في الدماغ الموقع explant الأسلوب14.
  7. استرداد التسجيل الخارجي المالحة. يحتوي على المياه المالحة في مم: 103 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل و 5 حامض الميثيل-2-أمينوثاني-سولفونيك ن-تريس (هيدروكسيميثيل)، تريهالوسي 8، الجلوكوز 10, 26 ناكو3، 1 نة2بو4، 1.5 كاكل2و 4 مجكل2 (المعدل إلى mΩ 270-275). هو bubbled المحلول الملحي مع 95% O2%5 CO2 (كاربوجين) وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 7.315.
  8. ضع 4-6 قطرات من المحلول الملحي التسجيل خارج الخلية على إعداد الذبابة. عند هذه النقطة، زيادة مستوى الضوء في مجهر تشريح لرؤية أفضل.
  9. شحذ سلك تنغستن استخدام التحليل الكهربائي. جعل الأسلاك، تعد حلاً مشبعة كنو3 وتطبيق ما يقارب 20 "الخامس للتيار المتردد" الحالي حين غمس غيض الأسلاك في حل 20 مرة لكل 100 مللي ثانية حتى يتم شحذ التلميح. استخدام سلك التنغستن شحذ لإزالة بشرة على رأسه الطاير ومما يعرض في الدماغ.
  10. كذلك كشف الدماغ بإزالة القصبة الهوائية والهيئات الدهون التي تحيط بها. إذا كان الوصول إلى الفصوص باللوامس، استخدام سلك التنغستن بنت أو أداة مماثلة لشد بلطف هوائيات تحت إحباط تسجيل الدائرة زيادة وضوح الرؤية. استخدام الملقط حادة للدموع بلطف بعيداً اﻷغماد الدبقية تغطي مجال الاهتمام حيث سيجري إعداد تسجيلات.
  11. نقل غرفة تسجيل لتلاعب الكهربية. فورا bubbled نضح ابدأ مع تسجيل خارجي المحلول الملحي مع كاربوجين للحفاظ على الدماغ. ويوضع فوق المرحلة مجهر خزان المحلول الملحي وهو الجاذبية للإعداد. استخدام خط فراغ وقارورة Erlenmeyer ل 2 لجمع المياه المالحة النفايات.

4-الحصول على تسجيل كامل الخلية

  1. سحب الماصات التصحيح ساحبة ماصة تجارية. راجع الدليل لإعدادات لتحقيق ماصة مناسبة مع مقاومة نصيحة قرب 7 mΩ.
  2. إضافة 4 ميليلتر من تسجيل الداخلية حل إلى ماصة تصحيح. المياه المالحة الداخلية يتكون من 140 البوتاسيوم اسبارتاتي وحبيس 10، مجاتب 4، 0.5 غ3أنشئ، عطا 1 و 1 بوكل في مم.
  3. إعداد تصحيح المشبك مكبر للصوت لتسجيل كامل الخلية. صفر الإزاحة في مكبر للصوت ومكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار. وهنا، يستخدم صباحا نظم تصحيح المشبك مكبر للصوت 2,400.
  4. تطبيق الضغط الإيجابي من خلال ماصة والاقتراب من الخلية. استخدام ميكرومانيبولاتور للمباشرة الماصة، والاتصال بالخلية. الإفراج عن الضغط الإيجابي. مجموعة القدرة القابضة للغشاء إلى-60 أم. وينبغي أن تشكل ماصة ختم جيجاوهم مع غشاء الخلية كما يدل على ذلك انخفاض sub-بيكوامب عقد الحالية.
    ملاحظة: إذا استخدام بروتينات فلورية خضراء تسترشد استهداف الخلية، في محاولة للتقليل من استخدام الضوء ابيفلوريسسينت لمنع التنشيط ChR2 والاكتئاب متشابك المحتملة. أيضا الانتظار لبضع دقائق قبل تطبيق الخطوة 5.
  5. تعيين مكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار من-50 أم إلى-60 أم. هذا الإعداد المعيار على التصحيح-المشبك مكبرات الصوت. وستكشف البقول اختبار عابرة capacitative كبيرة تمثل الحالية اللازمة لشحن ماصة التصحيح. إزالة capacitative العابرين بضبط المقابض تعويضاً قدرة على الساعة 2400 أو مماثلة مكبر للصوت.
  6. تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي تمزق غشاء الخلية والحصول على تكوين كامل الخلية.
    ملاحظة: تكوين خلية كاملة من الملاحظ عندما تكون هناك زيادة كبيرة في العابرين capacitative عرض السعة للخلايا العصبية. المرجح أن يلاحظ أيضا زيادة صغيرة في عقد الحالية (خط الأساس). تعيين مكبر للصوت لوضع المشبك الحالي وضبط يمكن للخلية أن من-50 إلى-60 أم.

5-اختبار اتصال متشابك

  1. تكوين نظام حيازة (دق) البيانات لتشغيل برنامج تشغيل الصمام لتوليد نبضات الضوء. هنا، يتم استخدام نظام "دق الصكوك الوطنية" مع مطلب لتوصيل إشارة تمثيلية إلى برنامج تشغيل الصمام. يتم ضبط كثافة الصمام عن طريق الإشارات التناظرية إلى برنامج التشغيل. الصمام 620 630 الطول موجي نانومتر الصمام.
  2. ضع LED الحمراء رفيع المستوى مباشرة تحت التحضير. ضبط شدة الضوء بحيث تصل إلى 0.238 ميغاواط/مم2 الطاير.
  3. تنشيط الخلايا العصبية presynaptic أثناء التسجيل من الخلية بوستسينابتيك للفائدة. تحقيق خلية التنشيط أوبتوجينيتيكالي، فارماكوجينتيكالي، أو عن طريق تحفيز الأعصاب. وهنا، يتم تطبيق كشريمسون ونبضات قصيرة من الضوء الأحمر.
    ملاحظة: يمكن رصد اتصالات متشابك في المشبك الحالية ابسبس أو المشبك الجهد ابسكس. ينبغي أن يكون اتصال متشابك مرئية قبل تطبيق ت ردا على 40 نبضة خفيفة. إذا لوحظ أي اتصال، فإنه من غير المحتمل أن الخلايا العصبية سينابتيكالي متصلة أما مونو-أو بوليسينابتيكالي. يمكن تعديل عقد محتمل للتأكيد على اتصالات ضادات أو المثبطة تبعاً لذلك.
  4. إذا كان اتصال من الملاحظ في المحلول الملحي العادي، أضف ت إلى نظام التروية لتحقيق تركيز نهائي من 1 ميكرومتر. استخدام مضخة تعمل لالتقاط وإعادة استخدام المياه المالحة للمحافظة على ت. مضخة تمعجية سيتم استخلاص المحلول الملحي من الحمام وإعادته إلى الخزان المالحة.
  5. ضبط سرعة المضخة توفير فراغ ثابتة قوية تسمح بأن مستوى الملوحة في الحمام صعود وهبوط.
    ملاحظة: ينبغي أن يؤدي تطبيق ت وقف النتوءات النشاط في الخلايا العصبية التي تتم مراقبته في كل خلية. وهذا يؤكد أن ما يكفي ت المضاف إلى المياه المالحة.
  6. تطبيق نبضات قصيرة من الضوء الأحمر (40 مللي ثانية لكل نبضة) مرة أخرى. ومن المرجح في هذه المرحلة، أي اتصال متشابك الذي ما زال مونوسينابتيك. إضافة الخصوم الدوائية لتدوير المياه المالحة لاختبار الطبيعة الكيميائية اتصالات متشابك التي تظل في تتكس.
    ملاحظة: عند الجمع بين أوبتوجينيتيكس ونيون استهداف الخلايا العصبية، قد يكون من المهم عدم استمرار تفعيل السكان بريسينابتيك من الخلايا العصبية أثناء محاولة الحصول على تسجيل. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الاكتئاب متشابك، ويجعل من الصعب على راجع اتصالات. بسبب كشريمسون عصابة إثارة طويل الذي يمتد على نطاق واسع في مجموعة البروتينات الفلورية الخضراء، فلوروفوري أحمر يمكن استخدامها لتمثيل الخلايا العصبية و channel2rhodopsin (Ch2R) يمكن استخدامها لإثارة السكان الخلية. ويتطلب القيام بذلك علم الوراثة محددة ومكعب عامل تصفية مخصص. لتوليد الذباب مناسبة، تجعل الذباب التي تعبر عن فلوروفوري الأحمر (طلب تقديم العروض أو مشري) تحت نظم التعبير الثنائي نظام ليزا أو Q. وهذه ستحتاج إلى تكون متقاطعة مع الذباب معربا عن مروج Gal4 وجينات المستجيب UAS-Ch2R وناتشباك UAS. سوف المكعب المرشح الأمثل ابيفلوريسسينسي مجموعة إثارة ضيقة تثير fluorophore أحمر، ولكن لا تثير Ch2R. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تشمل تعيين عامل التصفية عامل تصفية انبعاثات تمريره طويلة لجمع الكثير من الضوء المنبعثة. قمنا باستخدام عامل تصفية مخصص من صفاء التي شملت جزء أرقام et580/25 x و t600lpxr (من مجموعة 49306)، ولكن مع عامل تصفية حاجز/انبعاثات et610lp.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تيربس يستخدم للتمييز بين مونو والاشتراكات بوليسينابتيك في متشابك الاتصالات بين الخلايا العصبية. بينما يمكن استخدام التحفيز ضعيفة خلية لاختبار اتصالات مباشرة، يقود أكبر نشاط presynaptic غالباً المجندين اتصالات بوليسينابتيك (الشكل 1A). تيربس يعمل من خلال المشترك معربا عن قناة الصوديوم غير متحسسة ت ناتشباك ومنشط أوبتوجينيتيك، واختبار اتصالات حضور ت للقضاء على بوليسينابتيك اتصالات (الشكل 1B). فعالية كتل ت إمكانات العمل في الدماغ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحليل تيربس تكمل التقنيات الحالية المستخدمة لحلبة تكسير بتمكين الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية التي تم تحديدها. على وجه التحديد، النهج الذي يكشف عن اتصالات مونوسينابتيك بإسكات إمكانات العمل مع تتكس على نطاق واسع أثناء استعادة استثارة في عدد سكان تحديد الخلايا العصبية مع قناة الصوديوم تتكس غير متحسسة ناتشباك. هو أثارت متشابك الإفراج عن طريق التحفيز أوبتوجينيتيك بينما يتم رصد الأحداث بوستسينابتيك مع تسجيلات كامل الخلية. تيربس يميز نفسه من النهج الأخرى مثل الإلمام بالحساسية بالجملة أو انتقال حجم أثارت في م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نود أن نشكر جوشوا سنجر، جوناثان شينك، فضلا عن المراجعين مدروس للتعليقات على المخطوطة. كما نود أن نشكر بن الأبيض وهارولد الجريدة للمناقشات بشأن الأسلوب. شينك جوناثان توفر البيانات الشكل 3A. أيد هذا العمل على منحة من مؤسسة وايت هول و R21 المعاهد الوطنية للصحة إلى قج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
UAS-csChrimsonBloomington ذبابة الفاكهة مركزالأسهم 55135يستخدم كمنشط عصبي
UAS-NaChBacBloomington ذبابة الفاكهة مركزالأسهم 9466Resotores استثارة في الخلايا في TTX
TetrodotoxinTochris1078قد تكون هناك حاجة إلى إذن خاص لشراء TTX لأنها مادة خاضعة للرقابة
جميع أنواع Sigma-Aldrichall عبر الشبكية عبر الشبكيةR2500تتطلب عاملا مساعدا ل channelrhodopsin
Weldable 321 الفولاذ المقاوم للصدأ   ؛ ورقة,  0.002 "  سميك,  10 "  ماكماستركارالعريض 3254K7يستخدم لصنع حامل ذبابة مخصص. يمكن قطع رقائق معدنية مخصصة بالليزر على بعد pololu.com من ملف PDF المقدم مجهر
التشريحZeissStemi 2000-Cيستخدم لتشريح المستحضر
WaxerAlmoreEectra Waxer 66000يستخدم أثناء التشريح لتأمين الذبابة في رقائق
شمع البارافينJoann4917217يستخدم مع الشمع
رقم 5 ملقطأدوات العلومالدقيقة#5COتستخدم لتشريح وإزالة التشريح
مقصأدوات العلوم الدقيقة15001-08تستخدم لإزالة أجزاء من البشرة أثناء تشريح
سلك التنغستنأنظمة AM797500استخدم مع التحليل الكهربائي لصنع إبر حادة للتشريح
مضخة التمعجالتلاقي مضخات ببساطة مضخات (أمازون)PM200Sلإعادة تدوير
وحدة التحكم في سرعة TTX ل مضخة تمعجيةZitrades (أمازون)N / APWM وحدة تحكم تعتيم لأضواء LED أو الشريط ، 12 فولت 8 أمبير ، مفتاح إضاءة سطوع قابل للتعديل وحدة تحكم باهتة DC12V 8A 96W لشريط إضاءة LED B
Versa-Mount   ؛ منظم الهواء المضغوط الدقيقMcMaster Carr1804T1لتطبيق الضغط الإيجابي أثناء الترقيع
Capilaries الزجاجيةWorld PrecisionInstruments TW150F-3لماصات التصحيح
مقياس متعدد الأغراضMcMaster Carr3846K431Gauge لمنظم الضغط
الفيزيولوجيا الكهربية الكاميراDage MTI & nbsp ؛IR-1000ستعمل أي كاميرا تعمل في نطاق الأشعة تحت الحمراء (850 نانومتر). أنت لا تريد استخدام الإضاءة الحمراء لأن هذا يمكن أن ينشط csChrimson
IR LEDThorlabs  M850F2للإضاءة المائلة
الألياف البصرية للأشعة تحت الحمراء LEDThorlabsM89L01الأزواج إلى الأشعة تحت
LED عدسة موضوعية   ؛أوليمبوس 40XLUMPlanFLNيمكن استخدامه في معظم الميكروسيبات ويعمل بشكل جيد لتصور الخلايا العصبية للذباب.
العنبر LEDThorlabsM590L3dلتصور RFP و mCherry
Blue LEDThorlabsM470L3< / strong>d< / sup>لتصور
مجموعة مرشحاتGFP Chroma49011< / strong>لتصور GFP أو تحفيز القناة2rhodopsin
مخصص mCherry Filter SetChroma  ET580 / 25X و T600LPXR (من مجموعة 49306) ولكن مع حاجز ET610LP / بصري انبعاثاستخدم فقط إذا كنت ترغب في تصحيح الخلايا العصبية المحددة باستخدام channel2rhodopsin
Dichroic للجمع بين الكهرماني والأزرق LEDThorlabsDMLP550Rاستخدم التصحيح فقط تحت mCherry وإثارة channel2rhodopsin بالضوء الأزرق.
LED أحمرالدي الصمام الكهربائي CreeXPE 620 - 630 نانومتريستخدم لقيادة csChrimson
LED DriverLEDupply3021-D-E-1000يستخدم لتشغيل مصابيح LED للتحفيز البصري الوراثي
مناورSutterMP-225تستخدم لوضع الماصة أثناء التسجيلات
مكبر صوت Patchclampأنظمة AMموديل 2400مكبر للصوت مكافئ مناسب
بيسل فلتروارنر إنسترومنتس مرشح LPF 202Aالإضافي لتصفية تتبع التيار إلى راسم الذبذبات أثناء التصحيح.
نظام الحصول على البيانات الأدوات الوطنيةNI PCIe-6321            781044-01تستخدم لتسجيل البيانات من مكبر الصوت إلى كتلة موصل الكمبيوتر
- BNC Terminal BNC-2090ANational Instruments779556-01تستخدم لتوصيل مكبر الصوت ببطاقة DAQ.
رقائق الصلب ماكماستر كار3254K7رقائق فولاذية لغرفة التسجيل المخصصة
مغناطيسK & J MagneticsD42لتأمين غرفة التسجيل لحامل الحلقة
1/16 "خلية يلقي الاكريليك شفافPololuتستخدم لصنع غرفة تسجيل مخصصة. يمكن قطع الأكريليك بالليزر على بعد pololu.com من ملف PDF المقدم
الحمراء GFP بي أدوات يستخدم

المراجع

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
  3. Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
  4. Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
  5. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
  6. Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
  7. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
  8. Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
  9. Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
  10. Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
  11. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
  12. Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
  13. Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
  14. Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
  15. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
  16. Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
  17. Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
  18. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
  19. Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
  20. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
  21. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
  22. Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
  23. Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila

مقالات ذات صلة