Method Article

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

DOI:

10.3791/57065

⸱

February 16th, 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ، وهي أول المستجيبين لالتهاب أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي. وقد كشفت الأبحاث الأخيرة ميكروجليا لتكون قادرة على تولي تعمل كل برو-التهابات والالتهابات، ودينامية. M1 (برو-التهابات) و M2 (برو الترميمي) تعمل تلعب دوراً مهما في الظروف نيوروينفلاماتوري مثل إصابة في الدماغ قبل الولادة، واختلاف معرض الوظائف استجابة لبعض المؤثرات البيئية. وقد لوحظ تحوير microglial التنشيط لإضفاء نيوروبروتيكتيون مما يوحي microglia قد الإمكانات العلاجية في إصابة في المخ. ومع ذلك، مطلوب إجراء مزيد من البحوث لتحسين فهم دور microglia في المرض، وهذا البروتوكول يسهل أن. البروتوكول هو موضح أدناه يجمع بين عملية الطرد المركزي تدرج كثافة الحد من الحطام الخلوية، مع فصل المغناطيسية، إنتاج عينة نقية جداً من خلايا microglial الأولية التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب في المختبر ، دون الحاجة إلى 2-3 أسابيع استزراع. بالإضافة إلى ذلك، وصف الخطوات التي تسفر عن بيانات وظيفية قوية حول microglia، مساعدة دراسات لتحسين فهمنا للاستقطاب وفتيلة من هذه الخلايا، التي لها آثار قوية في مجال الطب التجديدي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأضرار التي حصلت خلال فترة ما حول الولادة من الالتهاب، التاكسج احتباس الدم والنزيف يمكن أن يكون صفيف عقابيل على المدى الطويل. هي نظرية الفسيولوجيا المرضية المعقدة لإصابة في الدماغ قبل الولادة إلى إشراك التهاب والاسكيميه التي تلت موت الخلايا العصبية ومحواري1. الاستجابة المناعية الفطرية دوراً هاما في سلسلة الأحداث التي أدت إلى إصابة2.

Microglia، الخلايا المناعية المقيمين داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS)، هي أول المستجيبين لإصابة3. ميكروجليا أنواع البلاستيك الخلية مع القدرة على أن تكون وقائية أو السامة، سواء التي تعتمد على البيئة4. أنهم متورطون في ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراءات التالية التي أقرتها "لجنة الأخلاقيات الحيوان" في جامعة موناش. واستخدمت الفئران C57Bl6/ي ف-3-6 الوليد غير المعالجة الصحية لتوليد نتائج الممثل.

1-الانزيمية الهضم

ملاحظة: من المهم النظر في العقم عند عزل واستزراع الخلايا الأولية. حين ضمان البيئة العقيمة، قدر الإمكان، بالتشريح الأولى وحصاد العقول مورين يمكن أن تكتمل خارج غطاء تدفق لامينال، مع الخطوات اللاحقة كلها داخل غطاء الاندفاق الصفحي.

  1. باستخدام أدوات معقمة، euthanize الماوس بخلع سرطان عنق الرحم، وقطع رأس الحيوان وشطف مع الإيثانول 100%. باستخدام مقص معقم صغيرة، جعل شقوق صغيرة على طول الجانبين الأيمن والأيسر من الرأس. في هذا العصر، قشور الجلد بعي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الأساليب المذكورة هنا، يمكن عزل السكان نقية من microglia ويمكن أن تكون جاهزة لتوصيف استخدام في المختبر ، ونظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. بادئ ذي بدء، ما يصل إلى 18 الحيوانات يمكن استخدام كل إعدام، مع غلة المتوقعة حوالي 450,000-600,000 ميكروجليال الخلايا. من المهم أولاً تأكيد نقاء الخلايا المعزولة، والقيام بذلك تم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ لعلامات اثنين CD45 و CD11b-تحديد microglia يمكن إثبات مزعجة، كما أعرب أيضا عن علامات كثيرة أعربت عن طريق مي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia لديها القدرة على أن برو والمضادة للالتهابات، غيرت من المحفزات البيئة. وقد أظهرت الدراسات السابقة يمكن أن يضفي تحوير microglia التنشيط نيوروبروتيكشن. قدرتها على توفير الحماية للخلايا العصبية وإصلاح الضرر يتطلب إجراء مزيد من البحوث مزيد من الفهم الحالي لهذه الخلايا معقدة. وهكذا، عزل microglia الأولية عالية النقاء تقنية هامة ومفيدة. هذا طريقة سريعة نسبيا للحصول على microglia الأولية عالية نقية جاهزة للتجريب في المختبر خلال يومين.

وهناك مجموعة من البروتوكولات المذكورة في الأدب ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, منخفض الجلوكوز, بيروفاتجيبكو11885084
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X)Gibco15240062
DNaseI من الدرجة الثانية من البنكرياس البقريسيجما ألدريتش10104159001
غراء من البابايا لاتكس, محلول عكوئيوسمخزن سيجما-ألدريتشP3125-100mg
مصل الأبقار الجنينية, مؤهل, معطل الحرارةGibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
محلول الملح المتوازن من هانك (1X)Gibco14175-103
محلول الملح المتوازن من هانك (10X)Gibco14185052
EasySep Mouse CD11b مجموعة الاختيار الإيجابيStemCell Technologies18770المغناطيس
EasySepتقنيات EasySep magnetStemCell18000
EasySep BufferStemCell Technologies20144
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco14040182
Trypsin (2.5٪) (10X)Gibco15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 (Mouse BD Fc Block & trade;)BD Biosciences553141
Falcon 5 مل أنبوب اختبار PP ذو قاع دائري عالي الوضوح ، مع غطاء مفاجئ ،352063كورنينج
175 سم & sup2 ؛ قارورة ثقافة خلايا الرقبة الزاوية مع غطاء تنفيسCorning431080
عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية O127: B8Sigma-AldrichL5024
96 ألواح دقيقة معالجة بئر TC بحجم 96 بئر ، شفاف ، بوليسترين ، قاعدائري كورنينجCLS3799
بارافورمالدهيد (مسحوق ، 95٪)سيجما ألدريتش158127
تريتون-XSigma-AldrichX100
Rabbit Anti-Iba1Wako01919741 
الماعز المضادة للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS Antibodies < / strong > Company < / strong >< strong > Catalog Number < / strong >
V450 ، الفئران ، المضادة للماوس ، CD45 ، 30-F11 ، RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b & nbsp ؛eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ContringateThermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
محلول يوديد PropodiumMiltenyi Biotech130-093-233
متغير معقم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia IsolationDensity Gradient CentrifugationMagnetic SeparationPrimary MicrogliaPercoll GradientCell CountingTrypan Blue StainingCD11b LabelingHemocytometer AnalysisPercoll Layering

Related Articles