أننا في هذه الورقة تقديم تفاصيل لأساليب الإنتاج ومراقبة الجودة البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10. نعرض أيضا كيفية اختبار فعالية هذا البروتين لحل الألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من الصعب علاج الألم المزمن، وهناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لحل الألم المستمر. السيتوكينات المضادة للالتهابات هي المرشحين الواعدين لعلاج الحالات ألم المنهكة بسبب قدرتها على تنظيم التفاعلات المناعية العصبية الشاذة. بيد أن الناحية الفسيولوجية وهي تعمل في شبكة السيتوكينات المختلفة وذلك قد لا يكون تأثيرها العلاجي الأمثل عند استخدامها كالمخدرات ذاتها. للتغلب على هذا التحديد، قمنا بتطوير بروتين انصهار السيتوكينات المضادة للالتهابات IL4 و IL10. هنا، يمكننا وصف الأساليب للإنتاج ومراقبة الجودة من البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10 ونقوم باختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 لحل ألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية المستمرة.
المقدمة
الألم المزمن لا تزال واحدة من المشاكل الطبية الأكثر المنهكة والمعالجة بموجب القرن الحادي والعشرين، التي تمس > 20 في المائة من السكان البالغين1،2. ومع ذلك، علاجات لتقديم الإغاثة من الألم المزمن غالباً ما تكون غير فعالة أو يجب أن توقف بسبب الآثار الجانبية الحادة3. الأهم من ذلك، حاليا الأدوية المتاحة فقط توفير تخفيف الأعراض، ولكن ليس إلى حد كبير تعديل أو علاج الألم المزمن. على الرغم من أن الألم المزمن، على ما يبدو، اضطراب عصبي، تشير الأدلة إلى تورط الجهاز المناعي في الألم المزمن التنمية4،5. وعلاوة على ذلك، تبرز النهج المستندة إلى جهاز المناعة لعلاج الألم. على سبيل المثال، السيتوكينات المضادة للالتهابات تمنع الألم في عدة نماذج من الألم المزمن6،،من78. ومع ذلك، قد السيتوكينات المضادة للالتهابات نصف عمر قصيرة، الحد من آثارها المحتملة التي تحول دون الألم. وعلاوة على ذلك، تعمل السيتوكينات المضادة للالتهابات الأكثر على النحو الأمثل في تناسق مع بعضها البعض. للتغلب على هذه القيود، ونحن مؤخرا تنصهر السيتوكينات المضادة للالتهابات انترلوكين-4 (IL4) وانترلوكين-10 (IL10) في جزيء واحد. يظهر البروتين الانصهار IL4-10 كفاءة متفوقة في تثبيط الألم المزمن التحريضية والأعصاب مقارنة ب الفردية السيتوكينات9. هنا يصف لنا كيف يتم إنتاج هذا البروتين الانصهار، تنقية، وكيف يتم التحكم في الجودة.
وتنتج البروتين الانصهار IL4-10 في الخلايا البشرية عابر تعداء الخلايا و HEK293 مع ناقل تعبير بوب يحمل التسلسل كدنا ترميز البروتين الانصهار IL4-10. ويتم اختيار الخلايا و HEK293 لتسمح بتعديل بوستترانسلاشونال من البروتين، الأمر الذي لا يحدث في أنظمة تعبير البكتيرية. لتحسين وضع سقف جليكان مع حمض اللعابي، كدنا الترميز بيتا-جالاكتوسيدي-2، 3-سياليل-ترانسفيراز قد أدرج في الناقل التحوير ثاني. هو تنقية البروتين الانصهار باستخدام تنقية البروتين تقارب الثقافة طاف لأنها أقوى من تنقية بأساليب مثل حجم الاستبعاد أو التبادل الأيوني اللوني10،11أخرى. لتنقية البروتين الانصهار IL4-10، استخدمنا داخلية مونوكلونل الصنع ضد IL4. يتم إجراء تقييم لنقاء وبيواكتيفيتي لتنقية البروتين الانصهار IL4-10 كجزء من مراقبة الجودة. يتم تقييم نقاء دفعات المنتجة بالصوديوم دوديسيل كبريتات Polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وارتفاع ضغط حجم الاستبعاد اللوني (إتش بي-ثانية). يتم تقييم بيواكتيفيتي البروتين الانصهار IL4-10 بقياس قدرته على تمنع lipopolysaccharide (LPS)-التي يسببها إنتاج عامل نخر الورم-ألفا (TNFα) في الثقافات الدم كله، ومقارنتها بالجمع بين الفرد السيتوكينات.
وأخيراً، من أجل اختبار قدرة IL4-10 الانصهار البروتينات تمنع الألم المزمن، يمكننا وصف كيف يمكن اختبار البروتين الانصهار كمسكن في نماذج الماوس المستخدمة على نطاق واسع من الألم التحريضية المستمرة12،13،14 . هنا يصف لنا أساليب نموذج الألم التحريضية. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن نماذج الألم أخرى يمكن استخدامها (مثلنماذج الأم الأعصاب)، اعتماداً على البحث الأسئلة التي تحتاج إلى إجابة. لتقييم الألم في هذه النماذج، من المهم أن استخدام مجموعة متنوعة من التدابير السلوكية التي تشمل آثار والتدابير غير أثارت الألم. هنا، يمكننا وصف أساليب التقييم للتغيرات في الاستجابة السلوكية مقولة ميكانيكيا وحراريا. يتم تقييم حساسية الميكانيكية للمحفزات حميدة باستخدام اختبار فراي فون، في حين يتم تقييم حساسية الحرارية باستخدام اختبار هارجريفز. الأهم من ذلك، يتم قياس غير أثارت هايبرالجيسيا/اللودينيا باستخدام اختبار "تحمل الوزن الحيوي". هذه التدابير مقبولة على نطاق واسع كتدابير الألم وتسفر عن معلومات هامة عن عتبات الألم والألم محتملة تتعرض لها الحيوانات15،،من1617. أخرى تدابير لتقييم الألم غير أثارت (مثلاً، حافزا مستقلة)، مثل اختبار تفضيل المكان المكيفة، قد تكون قيمة18. لتقييم إمكانات المخدرات لتمنع الألم، أجرينا الإدارة إينتراثيكال من البروتين الانصهار، كما مع هذا الطريق من الإدارة أقل جرعة البروتين ضروري للوصول إلى المناطق ذات الصلة بالألم وتجنب الجهازية (الجانب) آثار19، 20.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية، والحصول على موافقة مسبقة من اللجنة الأخلاقية التجريبية المحلية. تم الحصول على الدم كله من "دائرة المانحين مصغرة" (ميني المانحة الطبوغرافيا، MDD) في أوتريخت المركز الطبي الجامعي (أومكو) في هولندا. MDD تلقت موافقة إيجابية من "لجنة الأخلاقيات الطبية" أومكو (ميديش إتش توتسكوميسي) للبروتوكول رقم 07-125/C.
1-البروتين إنتاج وتوصيف
- خلية ثقافة
ملاحظة: انظر الجدول للمواد اللازمة لثقافة الوسيلة المستخدمة.- ذوبان الجليد الخلايا HEK293-F عند 37 درجة مئوية حتى يكون هناك أجمة صغيرة من الجليد. نقل الخلايا المذابة فورا إلى 10 مل من المثلج المتوسطة (4 درجة مئوية) والطرد المركزي بتعليق خلية في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 4 دقائق (دقيقة) في 500 x ز.
- إزالة المتوسطة وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة جديدة في الرايت، متبوعاً بالطرد المركزي في ز 500 x لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل متوسطة في الرايت إضافة تعليق خلية مباشرة في قارورة 125 مل التي تحتوي على 25 مل من قبل حرارة متوسطة (37 درجة مئوية). ثقافة الخلايا في 8% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% على شاكر مداري التناوب بسرعة 125 لفة في الدقيقة.
- ثقافة فرعية الخلايا مرتين في أسبوع. استخدام خلية الآلي مواجهة (انظر الجدول للمواد) لتقدير عدد الخلايا وبقاء الخلية. خلايا قابلة للحياة البذور بتركيز 3 × 105 خلايا/مل في قوارير ارلينمييير. الحفاظ على الحجم الإجمالي للمتوسط الثقافة في 1/5 الحجم الإجمالي لقوارير Erlenmeyer الثقافة في جميع الأوقات للحفاظ على تهوية أفضل.
- تعداء
ملاحظة: ثقافة فرعية الخلايا ثلاث إلى أربع مرات قبل تعداء وترانسفيكت لهم عندما يكون بقاء الخلية > 90%. يتم تقييم جدوى خلية من الآلي (المجال الكهربائي متعدد القنوات) سيلكونتينج نظام يستند إلى سلامة غشاء البلازما. انظر الجدول للمواد اللازمة للكاشف تعداء.- الطرد المركزي الخلايا في RT لمدة 4 دقائق في 500 x ز؛ ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة (37 درجة مئوية)، وتمييع تعليق الخلية إلى ~1.0 x 106 خلايا/مل في إجمالي حجم 1 ل. قاسمة تعليق خلية في مختبرين 10 من 100 مل في قوارير Erlenmeyer 500 مل.
- تمييع 1 مغ بلازميد الحمض النووي في 33 مل المصل خفض الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM، انظر الجدول للمواد) بمزج لطيف. في أنبوب منفصل، تضعف 1,330 ميليلتر من تعداء الكاشف في MEM بخلط لطيف. احتضان كل الحلول على RT لأدنى 5 إضافة ومزيج الحمض النووي تضعف في MEM للكاشف تعداء في MEM واحتضان هذا المزيج لمدة 30 دقيقة في الرايت
- إضافة خليط كاشف تعداء الحمض النووي للخلايا (مثقف في القسم 1)؛ إضافة 6.6 مل المزيج لكل 500 مل قارورة Erlenmeyer تحتوي على 100 مل خلايا في الثقافة المتوسطة. الحفاظ على الخلايا في ظروف الثقافة المذكورة سابقا. حصاد الثقافة المادة طافية يحتوي على بروتين الانصهار IL4-10 يفرز ثلاثة أيام بعد تعداء.
- تحديد تركيز البروتين IL4-10 الانصهار في ثقافة طافية بأداء أليسا IL10 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: في ظروف الثقافة المثلى، وتركيز البروتين الانصهار يمكن أن يتوقع أن يكون بين 2.5 و 5 ميكروغرام/مل.
- تنقية البروتين بالتقارب اللوني
ملاحظة: يتم التقارب اللوني في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ كافة الكسور (ثقافة المادة طافية والتحميل والتدفق من خلال وشطف الكسور) على الجليد أثناء الإجراء.- تنشيط الزوجين 10 مغ من الصنع إلى منزل في جسم [مونوكلونل] ضد IL4 إلى 1 غرام من كنبر-سيفاروسي 4B، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). صب 2.5 مل خرز سيفاروسي المقرونة ببطء في العمود اللوني للزجاج (طولها 30 سم وقطرها 1.5 سم الداخلية، انظر الجدول للمواد).
- حظر مواقع الخرز الربط عن طريق تمرير 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يحتوي على 1% المتبقية "ألبومين المصل البقري" من خلال العمود. أغسل العمود مع 25 مل من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4) تليها 12.5 مل م 0.1 جليكاين المخزن المؤقت ل (الأس الهيدروجيني = 2.5) و 25 مل من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4).
- اجتياز 100 مل من HEK293 إذ تتركز خلية ثقافة طافية عبر العمود بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة أغسل العمود مع 50 مل من برنامج تلفزيوني.
- الوت البروتين الانصهار IL4-10 ملزمة مع 12.5 مل م 0.1 جليكاين المخزن المؤقت (pH = 2.5) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة وكسور جمع 2.5 مل. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس م 1 (pH = 9) لكل جزء لتحقيق درجة الحموضة إلى 7. دياليزي الكسور معادلتها بين عشية وضحاها ضد ل 2 من برنامج تلفزيوني (pH = 7.4).
- استخدام أنابيب الغسيل الكلوي مع 16 مم الجافة ووقف وزن الجزيئي 3.5 ك. عقيمة تصفية الكسور دياليزيد استخدام المرشحات المتاح مع 0.45 ميكرومتر المسامية القطر. تخزين العقيمة IL4-10 الانصهار البروتين الحل في مختبرين في-80 درجة مئوية.
- تقييم نقاء التيد IL4-10 الانصهار البروتين الملطخة بأخذ جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% وحصان-ثانية (العمود 3 ميكرومتر في الثانية-2000). لتحليل إتش-ثانية، تحميل 40 ميليلتر من البروتين في التركيز ~ 1 ملغ/مل في العمود. استخدام 100 ملم العازلة فوسفات الصوديوم مع كلوريد الصوديوم 150 مم (pH = 6.8) كمرحلة متنقلة. تعيين معدل التدفق في 1 مل/دقيقة.
- تحديد تركيز كل دفعة من IL4-10 الانصهار البروتين المنقي من أليسا IL10 ومقايسة البروتين حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي البروتين المقايسة كيت، انظر الجدول للمواد) وفقا للبروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
- استخدم المؤتلف IL10 البشرية لإنشاء منحنى قياسي في مقايسة أليسا. لتصحيح حجم الاختلاف بين IL10 المؤتلف (18 كاتشين) و IL4-10 الانصهار البروتين (كاتشين 34)، تضاعف تركيز تم الحصول عليها بعامل 1.8.
- بيواكتيفيتي IL4-10 الانصهار البروتين
ملاحظة: يتم فحص الدم الكامل لكل دفعة من IL4-10 الانصهار البروتين المنتجة وهو مقارنة نشاط دفعات مختلفة كجزء من مراقبة الجودة. يتم إجراء فحص الدم كله في الدم البشري الطازج المجمعة يوم المقايسة في أنابيب الهيبارين. تم الحصول على الدم من المتطوعين صحية في خدمتنا المانحين داخل المنظمة. ينبغي معالجة العينات كالمخاطر البيولوجية المحتملة.- إعداد 3-fold تخفيف قبل المسلسل المنقي IL4-10 الانصهار البروتين في المتوسط ربمي (انظر الجدول للمواد) على مدى تركيز تتراوح 5-1,215 نانوغرام/مليلتر.
- إعداد ما قبل تخفيف لبس (100 نانوغرام/مل) والدم البشري هو المخفف 4 مرات في المتوسط ربمي.
- "الماصة؛" تخفيف قبل البروتين الانصهار IL4-10 ولبس، والدم البشري إلى لوحة 48-جيدا. لكل بئر، إضافة 50 ميليلتر IL4-10 الانصهار البروتين (التركيز النهائي 1 243 نانوغرام/ملليلتر)، 75 المتوسطة ربمي ميليلتر، 25 ميليلتر لبس (تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل)، والدم البشري 100 ميليلتر (النهائي المخفف).
ملاحظة: الحجم الإجمالي للبئر الواحد هو 250 ميليلتر. - احتضان اللوحة في 8% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ح 18.
- تقييم تركيز TNFα في supernatants ثقافة استخدام أليسا TNFα، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- حساب تثبيط الاستجابة الالتهابية من IL4-10 الانصهار البروتين وفقا للصيغة: تثبيط % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
ملاحظة: A هنا = مستويات TNFα في الثقافات حفز لبس تعامل مع IL4-10 الانصهار البروتين، ب = مستويات TNFα في ثقافة أونستيمولاتيد، وج = مستويات TNFα في حفز ثقافة لبس.
2-نموذج الماوس لألم التهابات مستمرة
ملاحظة: من المهم استخدام الفئران الذكور والإناث على حد سواء (C57Bl/6) لأن هذا سيمكن تحديد الآثار تعتمد على الجنس. وبصفة عامة، الفئران المستخدمة بين 8-16 أسبوعا القديمة. لتحديد عدد الحيوانات المطلوب، ينبغي إجراء حسابات السلطة. هي سهولة العثور على الأدوات المستندة إلى ويب للقيام بهذه الحسابات على شبكة الإنترنت (مثلاً، http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
-
تحريض الألم التهاب مزمن
ملاحظة: حمل الألم التحريضية المستمرة في الفئران الكبار مع حقن إينترابلانتار الكاراجينان أو Adjuvant (CFA فرويد كاملة). الاختبارات المختلفة لا تتداخل مع بعضها البعض.- تحضير الكاراجينان (2% w/v) بتذويب الكاراجينان λ (انظر الجدول للمواد) في 0.9% كلوريد الصوديوم بتمرير الحل عن طريق إبرة 23-قياس التأكد من أن الكاراجينان حل بشكل صحيح. تعد حلاً طازجة مباشرة قبل إجراء الحقن.
- بدلاً من ذلك، إذا تم استخدام فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، مزيج الحل فرنكات الجماعة المالية الأفريقية بشكل صحيح قبل الحقن من إينترابلانتارلي، لأن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية مستحلب الماء في النفط الذي يحتوي على 1 ملغ من الحرارة السل (H37Ra) قتل والمجففة وزيت البارافين مل 0.85 ماندي 0.15 مل متفطره مونوليتي (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يوصي المحاقن هاملتون زجاج مع بلونجيرس معدنية حقن هذا المركب نظراً لأن بلونجيرس المطاط قد تتفاعل مع الزيت في adjuvant. -
حقن إينترابلانتار
- المحافظة على المجمع (الخطوات 2.1.1 أو 2.1.2) في المحاقن في RT لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن للسماح بتعديل الرايت ضخ 20 ميليلتر من المجمع (أو ديسولفينت كعنصر تحكم) تحت الجلد في مخلب هند الماوس تخديره من غير استخدام مقياس 30 إبرة.
- أدخل الإبرة في قاعدة توجيه الإبهام الكعب وحقن المجمع عندما يتم إدخال الإبرة 0.5 سم تقريبا. بعد الحقن، تتراجع ببطء الإبرة بينما قليلاً بالتناوب حقنه لتجنب تسرب للحل من موقع الحقن.
3-ألم القياسات
ملاحظة: ضمان أن الباحثين إجراء التجارب السلوكية الأعمى لمعاملة الماوس. من المهم أن التأقلم الحيوانات إلى بيئة الاختبار قبل تنفيذ أي قياس. ويفضل الأسبوع قبل بدء التجارب، توضع الحيوانات 1-2 مرات عن 15-30 دقيقة في كل من الأجهزة المختلفة المستخدمة لإجراء الاختبارات. عند التعامل مع الذكور والإناث في نفس التجربة، تقييم الذكور مستقلة عن الإناث. تنظيف الأقفاص والسطوح على نطاق واسع بين المجموعات المختلفة لتجنب الآثار غير المرغوب فيها المحتملة على سلوك جنسين مختلفين. قياس خط الانسحاب الاختفاء أو عتبات الميكانيكية اثنين إلى ثلاثة إضعاف دقة تحديد عتبات الأساس وتحديد ما إذا كانت هذه مستقرة قبل الحقن إينترابلانتار أي مركب.
-
اختبار فون فري: حساسية الميكانيكية للمحفزات حميدة
- ضع الحيوانات فردياً في أقفاص اﻷكريليك على الوقوف شبكة أسلاك والسماح للفئران التأقلم لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل القياسات.
- تقييم حساسية الميكانيكية عن طريق قياس عتبة انسحاب مخلب ردا على سلسلة معايرة للشعر فري فون تتراوح بين 0.02 إلى 4 غ. النظر في أي حركة مخلب بعيداً عن الشعر التطبيقية كاستجابة إيجابية انسحاب. تطبيق خيوط لا تطور عمودي على السطح مخلب بقوة كافية تسبب الانحناء الطفيف ضد الجلد وعقد لجعل س. ~ 3 تأكد من الشعر أثناء التطبيق مخلب.
- حساب عتبة مخلب-انسحاب 50% باستخدام أسلوب صعودا ونزولاً15،21.
ملاحظة: الشعيرة الأولى لتطبيق ز 0.4 (يمكن استخدام خيوط انطلاق أخرى اعتماداً على عتبات عرض هذه الفئران في الأساس). عدم الاستجابة خيوط تشير إلى أن يستخدم خيوط سمكا القادم في تحفيز التالية، بينما استجابة إيجابية تشير إلى استخدام خيوط أرق القادم. يتم تحديد العدد عروض الشعر بأول استجابة التفاضلية؛ وبعد ذلك، يتم تنفيذ 5 المزيد من التطبيقات. حساب عتبة 50% وفقا للأساليب الموصوفة سابقا15،21.
-
الحساسية الحرارية: اختبار هارجريفز
- ضع الحيوانات في أقفاص على لوح زجاج المعالجون مسبقاً (30 درجة مئوية) والسماح للفئران التأقلم لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل القياسات، والانتظار حتى الحيوانات تقف مكتوفة.
- تحديد أوقات الكمون سحب الحرارة بتسخين مخلب الحيوانات بشعاع ضوء مرئية مركزة باستخدام جهاز هارجريفز (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يتم تعيين كثافة الشعاع نظراً لأن هذا الإعداد كثافة تصميماً تجريبيا، يستحضر شعاع ضوء استجابة انسحاب من وقت متوسط من 8 إلى 12%، s في الأساس على الفئران C57Bl/6. وينبغي تحديد الإعداد كثافة كل الجهاز الفردي وضغط الماوس. أوقات التوقف القصوى من 20 ثانية أو أكثر يتم استخدامها لتجنب الإصابة بالحيوانات. - قياس مرات الكمون انسحاب ~ 4 مرات للحيوان الواحد. متوسط كافة الاستجابات قياسه. قياس كل مخلب بشكل مستقل، ومع فترات دقيقة على الأقل 1 بين القياسات اللاحقة في نفس مخلب.
-
العجز الوضعي: اختبار تأثير الوزن الحيوي
- قياس وزن الجسم كل حيوان قبل الاختبار، حيث يتطلب تحمل تحليل الوزن وزن الجسم كل حيوان الفردية كمعلمة إدخال.
- ضع الحيوانات فردياً في تجهيزها الكلمة تحمل الوزن نظام ديناميكي تجميعها على غطاء دعم كاميرا التي سيقوم بتسجيل حركات الماوس. واسمحوا الحيوانات التأقلم ل 0.5 إلى 1 دقيقة قبل أن يسجل لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: في هذا الاختبار، يمكن تقييم الحيوانات تتحرك بحرية واحدة فقط في كل مرة. - ضبط الإعدادات لإجراء تأثير الوزن وتحليل البيانات.
ملاحظة: في هذه التجارب، ونحن استخدام المعلمات التالية: (ط) منخفض الوزن عتبة من 0.6 g: هذا هو وزن الحد الأدنى اللازم لتنشيط إحدى الخلايا من أجهزة الاستشعار. (ثانيا) الوزن ارتفاع عتبة 1 g: يشير هذا العدد إلى الوزن اللازم لتنشيط خلية واحدة بالكامل. (ثالثا) عتبة السطحية من الخلايا 2: يشير هذا العدد إلى العدد الخلايا المجاورة لبعضها البعض التي تحتاج إلى تنشيط لتؤخذ في الاعتبار. (رابعا) الحد الأدنى لعدد الصور هو 5: يستغرق 0.1 s لالتقاط كل صورة. يشير الرقم أقل عدد ممكن من الإطارات التي لا يتحرك الماوس. على هذا النحو، قيمة 5 يعني أن الموقف الماوس يجب أن يكون مستقرا > 0.5 s للحصول على قياس التي يتم أخذها في الاعتبار للتحليل. - إجراء التحليل لكل الفيديو التي تعيد الفيديو، وضمان الاعتراف بكل أطرافه بشكل صحيح قبل البرنامج في الإطار الزمني الذي يحدده البرنامج.
ملاحظة: الحد أدنى من 1 دقيقة من الوقت المسجل يحتاج إلى التحقق من صحتها. يحسب الوزن الحيوي إذ تضع برامج وتوفر المعلمات التالية: (ط) الوزن الذي يتحمله كل مخلب الفردية في غرام، كنسبة مئوية من وزن الجسم كله. (ثانيا) وزن تتحملها مخلب الجبهة الموحدة أو الكفوف الخلفي مجتمعة في غرام كنسبة مئوية من وزن الجسم كله. الكفوف (ثالثا) نسبة يسار/يمين الوزن تأثير أو تأثير الوزن أمامي/خلفي. (رابعا) المساحة السطحية لكل مخلب أو الجمع بين آثار أقدام أمامي/خلفي بتنشيط لوحة المفاتيح الضغط الحساسة. (ت) يعني ومعيار الانحراف لكل معلمة. (سادسا) المدة للمواقف المختلفة (تربية أو آثار أقدام 3 أو 4 آثار أقدام) خلال التجربة بأكملها. (سابعا) الوقت (s) كل مخلب يحمل وزنا خلال التجربة بأكملها.
4-إينتراثيكال حقن من IL4-10 الانصهار البروتين للتسكين
ملاحظة: التأكد من أن التهوية في غرفة مفتوحة لضمان تدفق الهواء السليم. لاختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 (1 ميكروغرام/الماوس؛ 5 حجم مجموع الحقن ميليلتر) فإنه ينبغي اختبار ضد المركبات الحقن والحقن من مزيج السيتوكينات الفردية (IL10, IL4 + 0.5 ميكروغرام/الماوس، 5 ميليلتر حقن إجمالي حجم، 0.5 ميكروغرام).
- تخدير الماوس مع إيسوفلوراني 3-4% بمعدل 2 لتر في الدقيقة في قاعة التعريفي تدفق الأوكسجين. تحقق من أن الماوس يتم تخديره بشكل صحيح معسر مخلب التأكد من أنه لا توجد استجابة للحيوان.
- وضعت في مخروط الآنف الجهاز مكان الماوس على الجدول مع رئيسها والحفاظ على التخدير الماوس مع إيسوفلوراني 1.5-2 في المائة مع معدل تدفق الأوكسجين 2 لتر في الدقيقة أثناء حقن intrathecal.
- مرة أخرى في ملء المركبات القابلة للحقن في زجاجة نظيفة 25 ميليلتر هاملتون حقنه متصلة بإبرة قياس 27.
- أمسك الماوس بقوة بالعمود الفقري الخلفي للاضلاع ورفع الماوس قليلاً. ضع الإبرة عمودياً بين الفقرات القطنية L5 و L6 وإدراجه بعناية عن طريق الجلد الحق في منتصف الفقرات القطنية. ضع الإبرة في الفضاء الفقرية.
ملاحظة: إيجاد مساحة الفقرية قد تتطلب بعض 'البحث' بتحرك الإبرة على طول المحور البطني روسترال، طفيفة الضغط الإبرة حتى تشعر بفقدان مقاومة أنسجة العظام.- تأكيد تستهدف الصحيح عن طريق التحقق من حدوث نفض ذيل. حقن 5 ميليلتر من المجمع ببطء، انتظر بضع ثوان، ومن ثم تسحب الإبرة ببطء. إلا إذا كان من الملاحظ نفض مخلب واحد، يرجح الإبرة لا توضع بشكل صحيح.
- بعد الحقن، تحقق الماوس عن كثب للأولى و 30 دقيقة بعد التعافي من التخدير ضمان عدم وجود أي إعاقة السيارات/الشلل.
ملاحظة: يمكن أن سلوكيات الألم يقاس (كما هو موضح في القسم 3) 15 دقيقة بعد الشفاء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1ألفصورة تمثيلية جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها خلال التقارب اللوني لتنقية. ولوحظت في تحميل (ل) والتدفق من خلال كسور (قدم)، جميع البروتينات الموجودة في المادة طافية HEK293. ويلاحظ لا البروتين في الكسر يغسل (W). في الكسر شطف (ه)، لوحظت شريطين من كاتشين 35 و 37 المقابلة لاثنين جليكوفورمس مختلفة من IL4-10 الانصهار البروتين (الأسهم). ويرد في الشكل 1ب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويصف هذه المخطوطة أساليب للإنتاج وتوصيف المؤتلف IL4-10 الانصهار البروتين، وأساليب لاختبار فعاليته في منع التهاب هايبرالجيسيا في نماذج الماوس من الألم التحريضية المستمرة. إنتاج وتنقية البروتين الانصهار IL4-10 يتم على نطاق صغير. يتم تحديد الخلايا HEK293 كنظام لتعبير لإنتاج البروتين لأنها تمكن التعديلات بوستترانسلاشونال لا يمكن أن تتحقق في أنظمة تعبير بدائية. بوستترانسلاشونال التعديلات ذات الصلة لوظيفة البروتين، وغياب مثل هذه التعديلات المحتملة يمكن أن تؤثر على الفعالية العلاجية للبروتين الانصهار IL4-10. البروتين هو تنقيته ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
جزء من هذا العمل قد تم تمويلها "علوم الحياة" بجامعة أوتريخت منح
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| FreeStyle 293-F الخلايا | Invitrogen | R790-07 | خلايا الكلى الجنينية البشرية |
| جيبكو فري ستايل 293 إكسبريشن ميد | لايف | 12338018 | كاشف |
| 293 فكتين | كاشف إنفيتروجين | 12347019 | كاشف النفقة |
| جيبكو تقنيات أوبتي-ميم + جلوتاماكس | لايف | 51985026 | وسط مصل مخفض للاستخدام أثناء عمليات النفش الدهني الميونية |
| جيبكو RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | وسائط منشطة مسبقا لاقتران الأجسام المضادة أو البروتينات الكبيرة الأخرى |
| دخان حمض الهيدروكلوريك 37٪ | ميرك | 1003171000 | |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S7653-1kg | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما | 31437 | |
| تريزما هيدروكلوريد | سيجما | T3253-500G | تريس هيدروكلوريد |
| حمض الخليك 100٪ | ميرك | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | سيجما | G2879 | |
| PBS | صيدلية ، UMCU | محلول ملحي مخزن بالفوسفات | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | عازلة تريس / جلايسين / SDS للرحلان الكهربائي SDS |
| جل MINI-PROTEAN TGX | BIO-RAD | 456-1046 | 12٪ المواد الهلامية مسبقة الصب |
| SDS Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | حزم نقل اللطخة الغربية |
| Yarra 3u SEC-2000 عمود | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | جاهز للاستخدام صبغة بروتين Coomassie لمواد هلامية بولي أكريلاميد |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R & D | DY217B | |
| عامل نخر الورم البشري &alpha ؛ مجموعة ELISA | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | نبات عديد السكاريد المخاطي |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | لقاح مساعد |
| حقنة هاميلتون | Sigma-Aldrich | 20779 | حقنة زجاجية |
| حاوية حيوانية | IITC Life Science | 433 | الضميمة الحيوانية |
| Von Frey شبكة الوقوف | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | اختبار | 58011 | الاختبارات الحسية |
| اختبار الأخمصية (طريقة هارجريفز) اختبار أخمصي | IITC Life | Science 390G | مع اختبار تحمل الوزن الديناميكي للزجاج |
| الساخن اختبار العجز | الوضعي | Bioseb BIO-DWB-AUTO-M | |
| أعمدة عمود اقتصادي زجاجية ، 1.5 & مرات 30 سم | BIO-RAD | 7371532 | عمود كروماتوغرافيا زجاجي ؛ |
| أنابيب غسيل الكلى SnakeSkin | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML حقنة فلتر | Sartorius | 16555-K | وحدة تصفية للاستخدام الفردي ، 0.45 & M |
| CASY عداد الخلايا ومحلل | Roche |
المراجع
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102(2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682(2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
