Method Article

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

DOI:

10.3791/57092

⸱

December 12th, 2017

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد إجراء ريفولدينج مجال ملزم يجند بيريبلاسميك dCACHE chemoreceptor والعطيفه الصائمية Tlp3 من إدراج الهيئات وتنقية تؤتي مليغرام كميات من البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تسهيل تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس ودراسات هيكلية تهدف إلى توضيح الأساس الجزيئي لخصوصية يجند إلى حد كبير بإنتاج كميات مليغرام من المجالات ملزم يجند نقية، مطوية. محاولات هيتيرولوجوسلي التعبير عن مجالات ملزم يجند بيريبلاسميك تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية (كولاي) غالباً ما يسفر عن استهدافهم في الهيئات المعنية بإدراج. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام المجال ملزم يجند من العطيفة الصائمية (C. الصائمية) تشيموريسيبتور Tlp3 dCACHE بيريبلاسميك كمثال. هذا النهج ينطوي على التعبير عن البروتين يحظى باهتمام كليفابل له6-الوسم، والعزلة واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، بروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا، وتنقية عن طريق التقارب اللوني، متبوعاً بعلامة الإزالة وحجم الاستبعاد اللوني. يتم استخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية لتأكيد الدولة مطوية من البروتين النقي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول عموما مفيد لإنتاج كميات مليغرام dCACHE يجند بيريبلاسميك ربط مجالات أخرى تشيموريسيبتورس البكتيرية في نموذج قابل للذوبان وكريستاليسابل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنزيمية وحركية قد أظهرت أن تلعب أدواراً هامة في إمراضية والعطيفه الصائمية بتشجيع الاستعمار الجرثومي وغزو من المضيف2،،من13. يسمح به البكتيريا للتحرك نحو بيئة أفضل للنمو، كما يسترشد بالإشارات الكيميائية. تنطوي هذه العملية على الاعتراف بالإشارات الكيميائية داخل الخلايا والبيئة بمجموعة من البروتينات يسمى تشيموريسيبتورس، أو محول الطاقة مثل البروتينات (قوة). تشيموريسيبتورس معظم هي جزءا لا يتجزأ من غشاء بروتينات مع يجند اكستراسيتوبلاسميك ملزمة المجال (الإعلان) وفي مجال ترانسميمبراني وفي مجال التنبيه هيولى، هذه الأخيرة التي تتفاعل مع البروتينات التنبيه سيتوسوليك التي ترسل إشارة أن المحركات فلاجلر4،5،،من67.

تم تحديد أحد عشر تشيموريسيبتورس مختلفة في4،الجينوم الصائمية جيم- 8. وحتى الآن، سوى بعض من هذه تشيموريسيبتورس وصفت وهو معروف خصوصية يجند Tlp19و10،Tlp311، Tlp411، Tlp712، و Tlp1113 . تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس المتبقية في هذه الأنواع، والعديد من تشيموريسيبتورس في البكتيريا الأخرى، يمكن أن يتيسر إلى حد كبير بإنتاج مطوية ونقية جداً المؤتلف تشيموريسيبتور، لبدس14 15 , 16-بيد أن محاولات للتعبير عن هيتيرولوجوسلي لبدس بيريبلاسميك من تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية غالباً ما يؤدي في استهدافها في الهيئات إدراج17،18،19 . ومع ذلك، يمكن تسهيل هذه الظاهرة العزلة سهلة والانتعاش من البروتين في متناول اليد. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور جيم الصائمية Tlp3 كمثال. وقد اختير هذا المثال للإعلان Tlp3 ينتمي إلى الأسرة dCACHE20 من مجالات الاستشعار التي توجد وفرة في مؤنزم الحامض الأميني مكون اثنين وتشيموريسيبتورس في بدائيات النوى20،21، 22 , 23.

في هذا النهج، تم تصميم بنية التعبير، استناداً إلى ناقل pET151/د-توبو، إلى إدراج ن--المحطة طرفية له6-العلامة متبوعاً التبغ أحفر موقع الانقسام مبطلات الفيروس (TEV)، ل إزالة العلامة اللاحقة19. ويصف البروتوكول overexpression البروتين في كولاي، والعزلة، واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، والبروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا. بعد ريفولدينج، هو تنقية العينة بالتقارب اللوني، مع علامة اختياري إزالة وحجم الاستبعاد اللوني. ويؤكد الدولة مطوية من البروتين المنقي باستخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية. هذا هو نسخة معدلة من الأسلوب الذي تم وضعه مسبقاً لاسترداد وتنقية قام تشيموريسيبتور المختلفة، الملوية البوابية تلبك19. غلة هذا الإجراء، تلخص في الشكل 1، 10-20 ملغ قام Tlp3 نقية، وليس تمييز كل 1 لتر ثقافة البكتيرية، بدرجة نقاء بروتين من > 90% حسب تقديرات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التعبير عن بلده6-Tlp3-الإعلان في كولاي

  1. تلقيح 150 مل مرق لوريا بيرتاني (رطل) العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين مع BL21 كودون-زائد (DE3)-RIPL الخلايا تتحول مع ناقل pET151/د-توبو للتعبير عن بلده6-Tlp3-قام (مخلفات الأحماض الأمينية 42-291)، و احتضان أنه عند 37 درجة مئوية في شاكر (قطر المدار، 25 مم) مع 200 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  2. إعداد ست قوارير ارلينمييير 2 L يحتوي على 800 مل مرق LB العقيمة و 50 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين. تطعيم كل قارورة مع 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها تم الحصول عليها من الخطوة 1، 1. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر 200 لفة في الدقيقة حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر تصل إلى 0.6.
  3. أن 1 مل اليكووت من واحد من قوارير (نموذج عنصر تحكم أونيندوسيد)، بيليه باستخدام أجهزة الطرد مركزي benchtop (13,000 س ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة) وتجاهل المادة طافية. تخزين بيليه البكتيرية في-20 درجة مئوية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل اللاحق.
  4. حمل التعبير البروتين بإضافة 1 مم من الأيزوبروبيل β-د-ثيوجالاكتوسيدي (إيبتج) لكل قارورة مع الثقافة. تستمر حضانة في قوارير في 37 درجة مئوية في شاكر 200 لفة في الدقيقة ح 4 إضافية.
  5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 5,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الإجراء الذي يمكن أن يكون مؤقتاً بوضع بيليه خلية في ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين.

2-العزلة وتمسخ إدراج الهيئات

  1. نقل جميع الكريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 5 إلى كوب 250 مل وإضافة 100 مل من المخزن المؤقت A (10 ملم تريس-HCl، pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم). السماح للخلايا لذوبان الجليد تماما (إذا كانت مجمدة)، وريسوسبيند بيليه. الاحتفاظ عينة على الجليد ما لم يشر إلى خلاف ذلك.
  2. تمر الخلايا ريسوسبينديد من خلال هوموجينيسير الضغط العالي ثلاث مرات الخلايا وضمان القص كاملة من الحمض النووي الجينوم.
  3. الطرد المركزي ليساتي في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع عينة 1 مل من المادة طافية (جزء قابل للذوبان) وتخزينها في-20 درجة مئوية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل اللاحق. تجاهل بقية المادة طافية ومكان بيليه على الجليد.
    ملاحظة: هذا بيليه أبيض اللون (يمكن تمييزها بسهولة من خلايا غير منقطعة وهي ظلال البنى اللون) ويحتوي على إدراج الهيئات.
  4. ريسوسبيند بيليه الهيئات إدراج دقيق في 20 مل من المثلج المخزن المؤقت ب (10 ملم تريس-HCl pH 8.0، 0.2 مم فينيلميثانيسولفونيل الفلوريد (بمسف)، 1% Triton X-100). وهذا يسهل سولوبيليسيشن الغشاء وبروتينات الغشاء. دوامة لمدة 1-2 دقيقة للمساعدة في استثارة.
  5. الطرد المركزي العينة في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
  6. ريسوسبيند بيليه جيدا في 20 مل من المثلج المخزن المؤقت ب واسطة فورتيكسينج الأنبوبة لضمان أن بيليه هو تقسيم إلى قطع صغيرة كحد أدنى 1-2. بيبيت العينة صعودا وهبوطاً للمساعدة في استثارة بيليه.
    ملاحظة: من المهم ريسوسبيند بيليه دقة للحصول على إدراج الهيئات خالية من الشوائب.
  7. كرر الخطوة 2، 5. إذا كانت المادة طافية غائمة أو الملونة، كرر الخطوات 2.6 و 2.5 (بهذا الترتيب) حتى المادة طافية واضح وعديم اللون.
  8. ريسوسبيند بيليه في 20 مل من المخزن المؤقت المثلج ج (pH تريس-HCl 10 ملم 8.0، 0.2 مم بمسف) التي فورتيكسينج الأنبوبة لمدة 1-2 دقيقة.
  9. كرر الخطوة 2، 5.
  10. إضافة 25 مل من المخزن المؤقت يشوه المثلج د (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، اليوريا م 8، 0.2 مم بمسف مم 10 ديثيوثريتول (DTT)،) بحل الهيئات إدراج بيليه. ريسوسبيند تماما من فورتيكسينج لمدة 1-2 دقيقة، أو حتى يتم تقسيم بيليه إلى قطع صغيرة.
  11. مزيج التعليق بتدوير محوري بمعدل دوران 30 دورة في الدقيقة لمدة 30-120 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  12. توضيح حل البروتين التشويه والتحريف بالطرد المركزي في س 30,000 ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ووضع المادة طافية على الجليد وتجاهل بيليه.
  13. قياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. 24 تأخذ قاسمة لتحليل جل الحزب الديمقراطي الصربي ووضعه في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الإجراء الذي يمكن أن يكون مؤقتاً بالأداة الإضافية-تجميد العينة الكوتيد في النتروجين السائل وإبقائه في-80 درجة مئوية للتخزين.

3-البروتين ريفولدينج

  1. تحضير 250 مل من المخزن المؤقت ه (م 3 اليوريا، 100 ملم تريس-HCl pH 8.0، 0.4 م ارجينين مونوهيدروتشلوريدي، ل مم انخفاض 20-الجلوتاثيون, 2 لتر-الجلوتاثيون المؤكسد مم) في كوب 500 مل وتبريد المخزن المؤقت وصولاً إلى 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 60 ملغ مزيج البروتين التشويه والتحريف التي تتضمن له6-Tlp3-قام التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.13 إلى 250 مل من المخزن المؤقت ه، حين إثارة المخزن المؤقت 500 لفة في الدقيقة. احتضان هذا المزيج ريفولدينج في 4 درجات مئوية مع التحريك المستمر 500 لفة في الدقيقة ح 24-48. أن تركيز البروتين النهائي في هذه الخطوة هو 0.2 مغ مل-1.
  3. إعداد ل 7 من المخزن المؤقت A دلو ل 8-10 وبارد عليه وصولاً إلى 4 درجات مئوية في التحضير للخطوة التالية (الخطوة 3، 4) التي ستجري في 24-48 ح (انظر المخطط الانسيابي في الشكل 1).
  4. تزج بقطعة ~ 50 سم للغسيل الكلوي أنابيب قطرها 28 ملم مضخمة، مع الوزن الجزيئي وقف إنتاج المواد الانشطارية في 12-14 كاتشين في 200 مل من 10 مم ملح حمض ثنائي الإيثيلين (نا يدتا2) ويسخن على لهب غاز حتى يغلي. شطف الغشاء الغسيل الكلوي مع 200 مل من ddH2o.
  5. المشبك نهاية واحد من الغشاء الغسيل الكلوي مع إغلاق أنابيب الغسيل الكلوي ونقل 250 مل ريفولدينج الخليط التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 2 في أنبوب الغسيل الكلوي. إغلاق نهاية مفتوحة مع المشبك آخر. التحقق من سلامة الغشاء التأكد من وجود أي تسرب.
  6. وضع أنبوب الغسيل الكلوي في دلو الغسيل الكلوي مع ل 7 يبرد قبل من المخزن المؤقت بإعدادها في الخطوة 3، 3. ضع ضجة مغناطيسية بار، ضمان أن ذلك لا يمس أنابيب الغسيل الكلوي أثناء التحريك.
  7. دياليسي العينة في 4 درجات مئوية مع استمرار التحريك 500 لفة في الدقيقة وتغيير المخزن المؤقت على الأقل أربع مرات على مدى فترة 12 ساعة. بعد تغيير المخزن المؤقت الأخير، ترك العينة دياليسي بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: أثناء الغسيل الكلوي، فائض اليوريا (~ 3 م) تدريجيا إزالة من الحل البروتين التشويه والتحريف، الذي يسمح البروتين ريفولد. ويمكن ملاحظة البروتين الثقيلة هطول الأمطار في نهاية الغسيل الكلوي.
  8. إزالة أنبوب الغسيل الكلوي من الدلو ونقل محتوياته إلى كوب 500 مل. يبقى الحل البروتين على الجليد، ما لم يبين خلاف ذلك.
  9. تصفية الحل البروتين من خلال غشاء حجم مسام ميكرومتر 0.43 في زجاجة زجاج 500 مل لإزالة أي البروتين سرع.

4-تنقية له6-معلم البروتين أيون معدني إيموبيليسيد التقارب اللوني باستخدام

  1. التهمة، وحجته عمود شيلاتينغ شحنت 5 مل.
    1. قم بتوصيل العمود مضخة تمعجية، ضمان عدم وجود لا الهواء محاصرين في أنابيب توصيل.
    2. أغسل العمود بتمرير من خلال 25-50 مل من ddH2o.
    3. شحن العمود بتحميل 3 مل من 0.1 متر نيكل2 وثم يمر عبر 25 مل ddH2o.
    4. حجته العمود مع 25 مل من المخزن المؤقت و (تحميل المخزن المؤقت، 20 مم تريس-HCl pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 مم).
  2. ضبط العينة البروتين ريفولديد التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 9 إلى تكوين المخزن المؤقت و بإضافة 2.5 مل من 1 م تريس-HCl pH 8.0، 25 مل من كلوريد الصوديوم م 5 و 2.5 مل م 2 ايميدازول الحلول الأسهم.
  3. تحميل العينة على العمود معدل 5 مل/دقيقة أو أقل وتجاهل التدفق من خلال (البروتينات غير منضم).
  4. أغسل العمود مع 50-100 مل من المخزن المؤقت و لإزالة البروتينات غير التحديد منضم وتجاهل في التدفق من خلال.
  5. الوت له6-Tlp3-قام مع 25 مل من المخزن المؤقت ز (شطف المخزن المؤقت، 20 مم تريس-HCl، 500 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 500 ملم)، وتجمع من خلال تدفق الكسور التي تحتوي على البروتين (كما يحددها استخدام الكاشف برادفورد).
  6. قياس تركيز البروتين في العينة المجمعة باستخدام مقايسة برادفورد. تأخذ صغيرة الكوة لتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي والمكان عند-20 درجة مئوية.

5-وقال6-الوسم إزالة استخدام حوزتي TEV (اختياري)

  1. إعداد، وتبريد وصولاً إلى 4 درجات مئوية، 4 لتر من المخزن المؤقت ح (المخزن المؤقت لانشقاق TEV، 10 مم تريس-HCl pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% (v/v) الجلسرين، 2 مم DTT).
  2. قطع حوالي 5-7 سم أنابيب الغسيل الكلوي (قطرها 2-3 سم) وتزج أنه في 200 مل ddH2o.
  3. أضف له6-معلم حوزتي TEV له6-البروتين العلامة إعدادها في الخطوة 4، 5 بنسبة مولى نهائية الإجمالية 1: البروتين 8.
  4. المشبك واحدة من نهاية الأنبوب مع إغلاق أنابيب الغسيل الكلوي وملئه بالخليط حوزتي البروتين/TEV. إغلاق الطرف الآخر والتأكد من وجود أي تسرب.
  5. مكان الغسيل الكلوي أنبوب إلى يبرد قبل 4 لتر من المخزن المؤقت ح (من الخطوة 5، 1) واحتضان أنه عند 4 درجة مئوية مع استمرار إثارة ل 2 حاء تغيير المخزن المؤقت ويستمر الغسيل الكلوي بين عشية وضحاها للسماح برد فعل الانقسام بوساطة TEV لإكمال.
  6. وفي الوقت نفسه، إعداد وبارد (4 درجة مئوية) 4 لتر من المخزن المؤقت أنا (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% (v/v) والغليسيرول) استعدادا لليوم التالي.
  7. بعد الغسيل بين عشية وضحاها، تبادل المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت وأنا أعد في الخطوة 5، 6 ودياليسي ح 1-2 زيادة في 4 درجات مئوية.
  8. إزالة الأنبوب من دلو الغسيل الكلوي و unclip واحدة من نهاية الأنبوب ونقل الحل البروتين إلى 50 مل أنبوب فالكون. تصفية الحل من خلال مرشح حقنه حجم مسام ميكرومتر 0.43 وإبقائه على الجليد، ما لم ينص على خلاف ذلك.
  9. قياس حجم العينة وضبط تركيز تريس وكلوريد الصوديوم وايميدازول تكوين المخزن المؤقت و (مثلاً ل 25 مل من محلول البروتين في المخزن المؤقت ي إضافة 0.25 مل من 1 م تريس-HCl pH 8.0، مل 1.75 من 5 م كلوريد الصوديوم، و 0.25 مل من ايميدازول م 2).
  10. إعداد عمود HP خالب هيتراب مل 5 كما هو موضح في الخطوة 4، 1.
  11. تحميل العينة على العمود (معدل التدفق: 5 مل/دقيقة) وجمع في التدفق من خلال، الذي يحتوي على ليس تمييز الإعلان Tlp3 (بقايا 42-291). بروتين أونكليافيد، وملصوق له6-العلامة وله6-TEV يتم الاحتفاظ بالعمود.
  12. أغسل العمود مع المخزن المؤقت 5 مل و (تحميل المخزن المؤقت) للسماح لجميع البروتين غير المميزة من خلال تدفق وجمع النذرة.
  13. التي تم الحصول عليها في الخطوات 5.11 و 5.12 تجمع النذرة وقياس تركيز البروتين. تأخذ صغيرة الكوة وتخزينها في-20 درجة مئوية لتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي.

6-حجم الاستبعاد اللوني (هلام الترشيح) من الإعلان Tlp3

  1. تحضير 1 لتر من المخزن المؤقت A (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم) وتصفية استخدام غشاء 0.43 ميكرومتر.
  2. حجته عمود حجم الاستبعاد 26/60 مع المخزن المؤقت بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة.
  3. تركيز البروتين العينة التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 13 إلى وحدة تخزين من 3-4 مل باستخدام مركزات الطرد المركزي 15 مل مع وقف كاتشين 10 (4 درجة مئوية، 4,000 س ز).
  4. توضيح حل البروتين بالطرد المركزي في 13,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة أي البروتين سرع.
  5. تحميل العينة على العمود الترشيح قبل متوازن جل 26/60. أداء اللوني في المخزن المؤقت بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة رصد تتبع الأشعة فوق البنفسجية. Tlp3--قام الوتيس في احتفاظ بحجم 210-220 مل. تجمع الكسور الذروة.
  6. قياس تركيز البروتين. تأخذ صغيرة الكوة لتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي.

7-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل العينات التي تم جمعها في مراحل مختلفة من تنقية البروتين

  1. إعداد 1 لتر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت قيد التشغيل (المخزن المؤقت ي)، والتي تحتوي على 25 مم تريس و 250 مم جليكاين الأس الهيدروجيني 8.3 دوديسيل الصوديوم 0.1% (w/v) كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي).
  2. إعداد 10 مل 5 × تحميل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت (المخزن المؤقت ك)، الذي يحتوي على 0.25 م تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 10% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي والجلسرين 50% (v/v)، 1 مم DTT وبروموفينول 0.05% الأزرق.
  3. تسمح مختبرين التي جمعت خلال الخطوات المختلفة للتنقية (خطوات 1.3، 2.3، 2.13، 4.6، 5.13، 6.6) لإذابة الجليد.
  4. لكل عينة، مزيج حجم الموافق 15 ميكروغرام من البروتين الكلي مع 2 ميليلتر من 5 س الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل المخزن المؤقت، وضبط مستوى الصوت إلى 10 ميليلتر مع ddH2o.
  5. الحرارة في العينات من 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة، وتدور لهم في 10,000 ز x 30 ثانية ونقل العينات في أنبوب نظيف.
  6. إعداد جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، استخدام polyacrylamide 15% فصل هلام (لمل 5: 2.5 مل 30% (w/v) مكررا-اكريلاميد، 1.2 مل 1.5 M تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، 1.2 مل ddH2س، 50% 10 ميليلتر (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي, 50 ميليلتر الأمونيوم 20% (w/v) فوق كبريتات (الجزائرية)، 3 ميليلتر تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) و 5% polyacrylamide التراص هلام (لمل: 340 2 ميليلتر 30% (w/v) مكررا-مادة اكريلاميد، 250 ميليلتر م 1 تريس الأس الهيدروجيني 6.8 مل 1.37 ddH2س، 20% 10 ميليلتر (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 20% 20 ميليلتر (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية، 2 ميليلتر تيميد).
  7. تجميع جهاز التفريد، وملء مع 1 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تشغيل المخزن المؤقت حسب توصية الشركة المصنعة.
  8. تحميل علامة وزن الجزيئي بروتين والعينات التي تم إعدادها في الخطوة 7، 5. إجراء التفريد في تيار مستمر من 25 اماه.
  9. نقل الهلام في حاوية وشطفه مع ddH2سين إضافة 150 مل من الأزرق أخذ تلطيخ محلول يحتوي على الايزوبروبانول 25% (v/v)، حمض الخليك 10% (v/v) و 0.03% (w/v) R-250 "الزرقاء الرائعة". ضع الحاوية على منصة أفقية دوران لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف الجل مع ddH2س ووضع في حل ديستاينينج التي تحتوي على 5% (v/v) الميثانول وحامض الخليك 7% (v/v). ديستين بينما خلط استخدام منصة أفقية دوران لح 1.
  11. صورة للهلام وتحليلها.

8-التعميم تلوانيه (CD) مطيافية "تحليل من الثانوي هيكل البروتين النقي" ريفولديد

  1. نقل 0.5-1 ملغ بروتين ريفولديد التي تم الحصول عليها في الخطوة 6، 6 في أنبوب الغسيل الكلوي ووضعها في دلو الغسيل الكلوي الذي يحتوي على 5 لتر من المخزن المؤقت ل (50 مم فوسفات الصوديوم الهيدروجيني 7.4)، بريكوليد إلى 4 درجات مئوية. دياليسي العينة في 4 درجات مئوية مع التحريك المستمر وإجراء تغييرات المخزن المؤقت على الأقل 3-4 أكثر من 2-4 ح قبل مغادرته العينة دياليسي بين عشية وضحاها.
  2. تركز حل البروتين دياليسيد 0.06 مغ مل-1 استخدام مركز كاتشين 10 قطع الطرد مركزي.
  3. توضيح الحل باستخدام الطرد المركزي في 13,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. تسجيل الطيف مؤتمر نزع السلاح الآن الأشعة فوق البنفسجية من العينة عند 25 درجة مئوية على مدى نطاق الطول موجي من شمال البحر الأبيض المتوسط 200-260 استخدام سبيكتروبولاريميتير بمعدل 20 دقيقة nm-1المسح الضوئي. استخدام المخزن المؤقت الغسيل الكلوي كعنصر تحكم فارغ. كرر التسجيل في ثلاث نسخ، وتوليد الطيف متوسط.
  5. حساب محتوى الهيكل الثانوي قبل ديكونفولوتينج مؤتمر نزع السلاح قطع الأطياف باستخدام برنامج كدستر من دكروب25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير المؤتلف له6-Tlp3-الإعلان في كولاي أدى إلى ترسب البروتين في إدراج الهيئات. العائد التعبير من 1 لتر ثقافة البكتيرية المحسوبة في الخطوة 2، 13 كان حوالي 100 ملغ من بلده6-Tlp3-قام المودعة في إدراج الهيئات. إجراءات عزل البروتين، الموصوفة هنا وهو موضح في الشكل 1، ويتألف من سولوبيليسيشن إدراج الهيئات والبروتين ريفولدينج وتنقية، عن طريق الفصل اللوني للتقارب وإزالة العلامة وحجم الاستبعاد اللوني ، وينتج 10-20 ملغ قام Tlp3 نقية، ولي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد إجراء بسيط للتعبير وريفولدينج من إدراج الهيئات قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور الجرثومي Tlp3. إعداد البروتين النقي ينطوي التعبير المفرط عن الجينات بلازميد المرمزة الحيوانات الأليفة في كولايوتنقيتها وسولوبيليسيشن لإدراج الهيئات، ريفولدينج البروتين التشويه والتحريف وتنقية واسطة تقارب متتالية و خطوات حجم الاستبعاد اللوني. يسر اليوريا تمسخ وتمييع/الغسيل الكلوي-بوساطة ريفولدينج هي الخطوات الحاسمة في البروتوكول، والأمثل الذي غالباً ما يلزم لضمان ريناتوريشن السليم للبروتين المودعة في إدراج الهيئات

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر ليو يو جيم لعمله المبكر على إنتاج Tlp3-الإعلان. مايرا ألف ماتشوكا مدين ل Departamento أدميستراتيفو دي العلوم، التكنولوجيا الإلكترونية معهد Innovación للحصول على منحة دكتوراه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
تريس بيسAMRESCO497
كلوريد الصوديوم (NaCl) MERKMILLIPORE1064041000
أمبيسلينG-BIOSCIENCESA051-B
فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) MERCK52332
Triton x-100AMRESCO694
Isopropyl & beta ؛ -D-thiogalactoside (IPTG)ASTTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
اليورياأمريسكوVWRC0568
ديثيوثريتولASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-arginine monohydrochlorideSIGMA-ALDRICHA5131
L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4251
المؤكسد L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4376
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH 2< / sub>PO 4< / sub>)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي الصوديوم مجفف الملح (EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
إيميدازولسيجما-ألدريتشI2399
الجلسرينASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
كلوريد النيكل (NiCl2< / sub>)SIGMA-ALDRICH339350
جلايسينأمريسكوVWRC0167
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
سلم بروتين غير ملوث ، عريض المدى (10-250 كيلو دالتون)نيو إنجلاند بيولابزP7703
مكثف الطرد المركزي Amicon Ultracel (Millipore)MERCKUFC901096
50 مل أنبوب فالكونBDAA352070
أنابيب غسيل الكلىليفينجستون الدولية PTYغسيل
غسيل الكلى جلد الثعبانTHERMO SCIENTIFIC & التجارة ؛68100
معبأة مسبقا HiTrap مخلب HP العمودGE HEALTHCARE LIFESCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 عالي الضغط متجانسAVESTINEmulsiFlex™ - C5
مضخة تمعجية P-1GE HEALTHCARE LIFESCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 عمود استبعاد الحجم  إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم
مطياف جاسكو J-815جاسكوJ-815
AST0487 BIOGB0232 الكلى أنابيب جنرال الحياة 28989336

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822(2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206(2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862(2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11(2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemoreceptor Ligand Binding DomainProtein RefoldingInclusion Body SolubilizationUrea Mediated SolubilizationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyCircular Dichroism SpectroscopyHis6 Tag CleavageTEV Protease TreatmentDialysis Buffer Exchange

Related Articles