Method Article

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

DOI:

10.3791/57092

⸱

December 12th, 2017

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد إجراء ريفولدينج مجال ملزم يجند بيريبلاسميك dCACHE chemoreceptor والعطيفه الصائمية Tlp3 من إدراج الهيئات وتنقية تؤتي مليغرام كميات من البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تسهيل تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس ودراسات هيكلية تهدف إلى توضيح الأساس الجزيئي لخصوصية يجند إلى حد كبير بإنتاج كميات مليغرام من المجالات ملزم يجند نقية، مطوية. محاولات هيتيرولوجوسلي التعبير عن مجالات ملزم يجند بيريبلاسميك تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية (كولاي) غالباً ما يسفر عن استهدافهم في الهيئات المعنية بإدراج. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام المجال ملزم يجند من العطيفة الصائمية (C. الصائمية) تشيموريسيبتور Tlp3 dCACHE بيريبلاسميك كمثال. هذا النهج ينطوي على التعبير عن البروتين يحظى باهتمام كليفابل له6-الوسم، والعزلة واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، بروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا، وتنقية عن طريق التقارب اللوني، متبوعاً بعلامة الإزالة وحجم الاستبعاد اللوني. يتم استخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية لتأكيد الدولة مطوية من البروتين النقي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول عموما مفيد لإنتاج كميات مليغرام dCACHE يجند بيريبلاسميك ربط مجالات أخرى تشيموريسيبتورس البكتيرية في نموذج قابل للذوبان وكريستاليسابل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنزيمية وحركية قد أظهرت أن تلعب أدواراً هامة في إمراضية والعطيفه الصائمية بتشجيع الاستعمار الجرثومي وغزو من المضيف2،،من13. يسمح به البكتيريا للتحرك نحو بيئة أفضل للنمو، كما يسترشد بالإشارات الكيميائية. تنطوي هذه العملية على الاعتراف بالإشارات الكيميائية داخل الخلايا والبيئة بمجموعة من البروتينات يسمى تشيموريسيبتورس، أو محول الطاقة مثل البروتينات (قوة). تشيموريسيبتورس معظم هي جزءا لا يتجزأ من غشاء بروتينات مع يجند اكستراسيتوبلاسميك ملزمة المجال (الإعلان) وفي مجال ترانسميمبراني وفي مجال التنبيه هيولى، هذه الأخيرة التي تتفاعل مع البروتينات التنبيه سيتوسوليك التي ترسل إش....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التعبير عن بلده6-Tlp3-الإعلان في كولاي

  1. تلقيح 150 مل مرق لوريا بيرتاني (رطل) العقيمة التي تحتوي على 50 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين مع BL21 كودون-زائد (DE3)-RIPL الخلايا تتحول مع ناقل pET151/د-توبو للتعبير عن بلده6-Tlp3-قام (مخلفات الأحماض الأمينية 42-291)، و احتضان أنه عند 37 درجة مئوية في شاكر (قطر المدار، 25 مم) مع 200 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  2. إعداد ست قوارير ارلينمييير 2 L يحتوي على 800 مل مرق LB العقيمة و 50 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين. تطعيم كل قارورة مع 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها تم الحصول عليها من الخطوة 1، 1. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر 200 لفة في الدقيقة حتى الك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير المؤتلف له6-Tlp3-الإعلان في كولاي أدى إلى ترسب البروتين في إدراج الهيئات. العائد التعبير من 1 لتر ثقافة البكتيرية المحسوبة في الخطوة 2، 13 كان حوالي 100 ملغ من بلده6-Tlp3-قام المودعة في إدراج الهيئات. إجراءات عزل البروتين، الموصوفة هنا وهو موضح في الشكل 1، ويتألف من سولوبيليسيشن إدراج الهيئات والبروتين ريفولدينج وتنقية، عن طريق الفصل اللوني للتقارب وإزالة العلامة وحجم الاستبعاد اللوني ، وينتج 10-20 ملغ قام Tlp3 نقية، ولي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد إجراء بسيط للتعبير وريفولدينج من إدراج الهيئات قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور الجرثومي Tlp3. إعداد البروتين النقي ينطوي التعبير المفرط عن الجينات بلازميد المرمزة الحيوانات الأليفة في كولايوتنقيتها وسولوبيليسيشن لإدراج الهيئات، ريفولدينج البروتين التشويه والتحريف وتنقية واسطة تقارب متتالية و خطوات حجم الاستبعاد اللوني. يسر اليوريا تمسخ وتمييع/الغسيل الكلوي-بوساطة ريفولدينج هي الخطوات الحاسمة في البروتوكول، والأمثل الذي غالباً ما يلزم لضمان ريناتوريشن السليم للبروتين المودعة في إدراج الهيئات

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر ليو يو جيم لعمله المبكر على إنتاج Tlp3-الإعلان. مايرا ألف ماتشوكا مدين ل Departamento أدميستراتيفو دي العلوم، التكنولوجيا الإلكترونية معهد Innovación للحصول على منحة دكتوراه.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
تريس بيسAMRESCO497
كلوريد الصوديوم (NaCl) MERKMILLIPORE1064041000
أمبيسلينG-BIOSCIENCESA051-B
فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) MERCK52332
Triton x-100AMRESCO694
Isopropyl & beta ؛ -D-thiogalactoside (IPTG)ASTTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
اليورياأمريسكوVWRC0568
ديثيوثريتولASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-arginine monohydrochlorideSIGMA-ALDRICHA5131
L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4251
المؤكسد L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4376
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH 2< / sub>PO 4< / sub>)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي الصوديوم مجفف الملح (EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
إيميدازولسيجما-ألدريتشI2399
الجلسرينASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
كلوريد النيكل (NiCl2< / sub>)SIGMA-ALDRICH339350
جلايسينأمريسكوVWRC0167
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
سلم بروتين غير ملوث ، عريض المدى (10-250 كيلو دالتون)نيو إنجلاند بيولابزP7703
مكثف الطرد المركزي Amicon Ultracel (Millipore)MERCKUFC901096
50 مل أنبوب فالكونBDAA352070
أنابيب غسيل الكلىليفينجستون الدولية PTYغسيل
غسيل الكلى جلد الثعبانTHERMO SCIENTIFIC & التجارة ؛68100
معبأة مسبقا HiTrap مخلب HP العمودGE HEALTHCARE LIFESCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 عالي الضغط متجانسAVESTINEmulsiFlex™ - C5
مضخة تمعجية P-1GE HEALTHCARE LIFESCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 عمود استبعاد الحجم  إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم
مطياف جاسكو J-815جاسكوJ-815
AST0487 BIOGB0232 الكلى أنابيب جنرال الحياة 28989336

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemoreceptor Ligand Binding DomainProtein RefoldingInclusion Body SolubilizationUrea Mediated SolubilizationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyCircular Dichroism SpectroscopyHis6 Tag CleavageTEV Protease TreatmentDialysis Buffer Exchange

Related Articles