مقالة منهجية

الفحص المجهري للتماسك البصري كامل المجال للتحليل الشبيه بالأنسجة لخصائص اللحمة في ترقيع القرنية

DOI:

10.3791/57104

⸱

أكتوبر 21, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vision Institute, Sorbonne University, UM 80 / INSERM, UMR_S 968 / CNRS, UMR_7210, 2Quinze Vingts National Ophthalmology Hospital, 3Laboratory of Ophthalmic Instrument Development, The Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Laboratory for Optics and Biosciences (LOB), École polytechnique, 5LOA - ENSTA Paris, École polytechnique

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف استخدام الفحص المجهري للتماسك البصري كامل المجال كطريقة لتقييم الجودة العالية لسدى المتبرع بالقرنية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد السمات التي تدل على الصحة أو المرض ، ويهدف إلى تحسين فحص واختيار الأنسجة المانحة ، وبالتالي نتائج رأب القرنية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المرجح أن تكون جودة سدى القرنية المانحة، والتي تشكل حوالي 90٪ من إجمالي سمك القرنية، أحد العوامل الرئيسية، إن لم تكن الرئيسية، التي تحد من نجاح رأب القرنية الرقائقي الأمامي العميق والمخترق. هذه هي العمليات الجراحية التي تنطوي على استبدال جزء أو كل طبقات القرنية المريضة ، على التوالي ، عن طريق الأنسجة المتبرع بها ، الكسب غير المشروع ، المأخوذة من شخص متوفى مؤخرا. ومع ذلك ، فإن وسائل تقييم الجودة اللحمية لترقيع القرنية في بنوك العيون محدودة وتفتقر إلى القدرة على التقييم الكمي عالي الدقة لمؤشرات المرض. يعد الفحص المجهري للتماسك البصري كامل المجال (FF-OCM) ، الذي يسمح بتصوير 3D عالي الدقة لعينات الأنسجة البيولوجية الطازجة أو الثابتة خارج الجسم الحي ، تقنية غير جراحية مناسبة تماما لتقييم قرنية المتبرع. هنا نصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لسدى القرنية باستخدام FF-OCM. تم تطبيق البروتوكول بنجاح على قرنيات المتبرع الطبيعي وأزرار القرنية المرضية ، ويمكن استخدامه لتحديد السمات الصحية والمرضية على المستويين العياني والمجهري ، وبالتالي تسهيل الكشف عن الاضطرابات اللحمية التي يمكن أن تضر بنتيجة رأب القرنية. من خلال تحسين مراقبة جودة الكسب غير المشروع ، فإن هذا البروتوكول لديه القدرة على أن يؤدي إلى اختيار (ورفض) أفضل للأنسجة المانحة وبالتالي تقليل فشل الكسب غير المشروع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض القرنية هي من بين الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم1. لا يمكن علاج بعض الأمراض إلا جراحيا ، وغالبا ما تنطوي على استبدال جزء (أي رأب القرنية الرقائقي) أو القرنية المريضة بالكامل (أي رأب القرنية المخترق) ، بأنسجة متبرع بها ، الكسب غير المشروع ، مأخوذة من شخص متوفى مؤخرا. بالنسبة لأمراض القرنية التي لا تؤثر على البطانة (على سبيل المثال ، القرنية المخروطية ، والندوب اللحمية بعد التهاب القرنية المعدي ، والصدمات ، والحثل اللحمي) ، يعتبر رأب القرنية الصفائحي الأمامي العميق (DALK) حاليا التقنية الجراحية المفضلة2،3،4،5. تتيح هذه التقنية الحفاظ على بطانة القرنية للمتلقي ، عن طريق استبدال ظهارة القرنية المركزية والسدى فقط ، والتي ترتبط بانخفاض معدل رفض الكسب غير المشروع ، وغياب الرفض البطاني ، وانخفاض فقدان الخلايا البطانية ، ونسبة فعالية التكلفةالمواتية 6،7،8،9،10،11 . يسمح DALK أيضا باستخدام القرنيات ذات جودة البطانة الأقل من المثلى كطعوم ، حيث لن يتم زرع هذه الطبقة المعرضة للخطر12. على العكس من ذلك ، من المرجح أن تكون جودة سدى القرنية المانحة هي العامل الرئيسي المحدد لنجاح الكسب غير المشروع واستعادة الرؤية لأن السدى هي طبقة القرنية المانحة الوحيدة المتبقية ، في حين سيتم استبدال ظهارة المتبرع بظهارة المتلقي. لسوء الحظ ، فإن وسائل تقييم سدى القرنية المانحة في بنوك العيون محدودة. وعادة ما تشمل فحص المصباح الشقي لمقلة العين المانحة عندما يتم استرجاع الأنسجة عن طريق الاستئصال والفحص المجهري الضوئي للسدىالمانحة 13. بدأت بعض بنوك العيون في استكمال هذه الإجراءات القياسية باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري بمجال فورييه (FD-OCT)14.

يستخدم التصوير المقطعي للتماسك البصري العيني (OCT) ، وهو تناظري بصري للتصوير بالموجات فوق الصوتية15 ، تداخل النطاق العريض أو الضوء القابل للضبط لتوليد أقسام بصرية من شبكية العين 16 والجزء الأمامي17. في OCT للمجال الزمني ، وهو أساس الأنظمة السريرية المبكرة ، يتم تغيير موضع المرآة المرجعية ، بحيث تظهر أنماط التداخل كلما سافر الشعاع المرجعي تقريبا نفس مقدار الوقت الذي تسلكه الحزمة المنعكسة في واجهات الأنسجة المختلفة ، مع إنشاء A-scans كدالة للوقت. في FD-OCT (وتسمى أيضا OCT الطيفية أو مجال التردد) ، أساس معظم الأنظمة السريرية الحديثة ، يتم تثبيت المرآة المرجعية في موضع واحد ويتم الحصول على A-scan، مع خلط جميع أنماط التداخل معا، في وقت واحد، وتشريحها بعيدا عن طريق تحليل فورييه.

في حين أن أنظمة OCT السريرية (الوقت أو المجال الطيفي) تسمح بمناظر مقطعية للقرنية واكتشاف العتامة اللحمية بدقة محورية أعلى من الفحص المجهري الحيوي للمصباح الشقي ، فإن دقتها الجانبية محدودة. يسمح الفحص المجهري متحد البؤر18 بفحص القرنية بدقة جانبية تقترب من التفاصيل النسيجية ، ولكنه محدود محوريا.

يجمع الفحص المجهري المقطعي للتماسك البصري كامل المجال (FF-OCT أو FF-OCM)19,20 بين عناصر كل من الفحص المجهري متحد البؤر و OCT ، مما يحقق دقة جانبية مماثلة للدقة المحورية التي تبلغ حوالي 1 ميكرومتر. وبشكل أكثر تحديدا ، يستخدم FF-OCM مصادر ضوء عريضة النطاق غير متماسكة (على سبيل المثال ، مصباح هالوجين) وبصريات ذات فتحة عددية عالية للحصول على صور مقطعية 2D بدون مسح جانبي. من خلال المسح في اتجاه العمق ، يتيح FF-OCM التصوير 3D غير الغازية لعينات الأنسجة البيولوجية الطازجة أو الثابتة خارج الجسم الحي. تم استخدامه لتصوير القرنية21،22،23. من خلال توفير كل من وجهات النظر عالية الدقة في الوجه والمقطع العرضي ، يوفر FF-OCM معلومات عن كل من التركيب النسيجي والتفاصيل الخلوية للقرنية. في الواقع ، ثبت أن FF-OCM يوفر معلومات هيكلية متفوقة على علم الأنسجة وكان قادرا على تحديد المزيد من مؤشرات المرض قدر الإمكان مع الجمع بين OCT المجال الطيفي والمجهر متحد البؤر24,25.

هنا نصف بروتوكولا للتقييم النوعي والكمي لسدى المتبرع بالقرنية باستخدام FF-OCM. تعتمد الطريقة على التحليل الشبيه بالأنسجة للخصائص العيانية والمجهرية التي تدل على الحالة اللحمية ، بما في ذلك ثلاثة معلمات انسجة كمية (أي سمك طبقة بومان وتنوعها ، والانعكاسية اللحمية). لذلك يتم تطبيق البروتوكول الموصوف على أنسجة القرنية الطبيعية وغير الطبيعية ويسمح بتمييز أنسجة القرنية البشرية المريضة عن الطبيعية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الطرق الموضحة هنا وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي واتبعت المتطلبات الأخلاقية الدولية للأنسجة البشرية. كانت هذه دراسة مستقبلية للمراقبة للحالة. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى. ولم تدخل أي تعديلات على المعايير الفرنسية للعلاج أو المتابعة. تم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) من لجنة حماية المرضى ، Ile-de-France V (14944).

1. اختيار الأنسجة وإعدادها

  1. حدد قرنيات المتبرع.
    1. نقل القرنيات المانحة المخزنة في وسط زراعة الأعضاء 26 إلى وسط زراعة الأعضاء المكمل بديكستران لمدة 3 أيام للسماح بإزالة التورم27 قبل تصوير FF-OCM28 (انظر جدول المواد).
  2. تحضير العينات.
    1. ضع القرنية ، مغمورة في وسط التخزين ، في حامل العينة مع توجيه الظهارة لأعلى.
    2. ضع غطاء سيليكا نظيفا (مرفق مع حامل العينة) أعلى القرنية وأغلق الحامل عن طريق تدوير قاعدته برفق حتى يتم تسطيح العينة قليلا وتثبيتها تحت غطاء الغطاء مما يوفر سطح تصوير متساو نسبيا. اتخذ الاحتياطات اللازمة لتجنب أي فقاعات هواء.
    3. ضع طبقة سميكة من الجل العيني أو البصري على غطاء الغطاء كوسيط غمر.

2. تهيئة FF-OCM والإعداد والحصول على الصور

  1. تهيئة الجهاز.
    1. قم بتشغيل الجهاز عن طريق تشغيل مفتاح الطاقة في الجزء الخلفي من الجهاز ؛ تشير إضاءة مؤشر LED الأخضر في مقدمة الجهاز إلى أن الطاقة قيد التشغيل.
    2. قم بتشغيل الكمبيوتر المخصص ومصدر ضوء الهالوجين عن طريق تشغيل مفتاح الطاقة في المقدمة.
    3. قم بتشغيل برنامج الاستحواذ (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج على اختصار سطح المكتب.
    4. تأكد من أن مرحلة التصوير واضحة باستثناء الدرج المتحرك. ثم انقر فوق "موافق" لتهيئة المحركات عند المطالبة.
    5. اسحب الدرج للخارج وأدخل حامل العينة في الحاوية المخصصة ، ثم ادفع الدرج للخلف برفق.
  2. قم بإعداد الجهاز.
    1. أدخل "نموذج معرف" في الحقل المعين والإلزامي ؛ اختياريا أدخل "وصف العينة" و / أو "وصف الدراسة".
    2. انقر فوق "الحصول على صورة ماكرو" عندما تكون جاهزا ، لإنشاء لقطة للعينة يمكن استخدامها لأغراض تحديد المواقع الجانبية والتنقل لاحقا ؛ بمجرد الرضا ، تحقق من صحة الصورة عند المطالبة بالنقر فوق "نعم" ، وبعد ذلك يحرك الجهاز درج العينة أسفل الهدف ويقوم بإجراء ضبط تلقائي.
    3. تأكد من أن هدف المجهر مغمور جيدا في الجل البصري قبل المضي قدما.
  3. الحصول على المداخن.
    1. حدد علامة التبويب "استكشاف" لإعداد عملية استحواذ.
      1. قبل الحصول على كومة من الصور ، انتقل إلى مركز القرنية ، عبر ترجمة عصا التحكم أو التحديد اليدوي على الشاشة (أي عن طريق النقر وسحب المربع الأحمر على صورة الماكرو المكتسبة إلى الموقع المطلوب).
      2. قم بتغيير عمق التصوير عن طريق تدوير عصا التحكم أو ضبط شريط التمرير أو إدخال لوحة المفاتيح اليدوي في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) ، واضبط متوسط القيمة (يوصى عموما بمتوسط 40 لتصوير القرنية الأمثل).
        ملاحظة: يتم ذلك لتحديد سمك عينة القرنية والمتوسط اللازم لتصوير سمك القرنية بالكامل مع ملاحظة موقع الصورة الأول والأخير بعمق. يخلق السطح السفلي لغطاء الغطاء أهداب تداخل متوازية تظهر على الصورة المقطعية (على الجانب الأيمن من واجهة المستخدم الرسومية) ، مما يسهل تحديد موقع سطح القرنية.
      3. أدخل قيمة سطح القرنية أو موقع الصورة الأولى بعمق في حقل "العمق".
    2. حدد علامة التبويب "اكتساب" ، للحصول على الصور.
      1. حدد "تباعد الشرائح" (الإعداد الافتراضي والموصى به هو 1 ميكرومتر ، مطابقا للدقة المحورية للجهاز) وأدخل قيمة سمك القرنية وفقا لذلك ، ضمن "عدد الشرائح".
      2. راجع المعلمات ووقت الاستحواذ ، وعند الرضا ، اضغط على "موافق" لبدء عملية الاستحواذ.
      3. أثناء الاستحواذ ، تجنب أي اتصال بالجدول الذي تم وضع FF-OCM عليه.

3. إدارة الصور المكتسبة

  1. عرض الصور وتصديرها.
    1. قم بتشغيل برنامج عرض FF-OCM (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج على اختصار سطح المكتب ؛ تظهر الصور التي تم الحصول عليها (المحددة بواسطة معرف العينة) في قائمة "الدراسات المحلية".
    2. حدد الدراسة باستخدام معرف العينة المقابل ، والذي يحتوي على كل من صورة الماكرو ومكدس الصور المكتسبة ، و "تصدير" الأخير بالنقر بزر الماوس الأيمن على سلسلة الصور وتحديد تنسيق "DICOM" للاحتفاظ ببيانات البكسل الخام والبيانات الوصفية لمزيد من التحليل.
    3. عرض مكدسات الصور 3D في وجه en وطرق العرض باستخدام وضع إعادة البناء متعدد المستويات (MPR) ، عن طريق النقر المزدوج على سلسلة الصور ؛ تنقل عبر الصور (على سبيل المثال ، عبر تمرير عجلة الماوس أو ضبط شريط التمرير) وحدد تمثيلية وجها لوجه وطرق عرض مستعرضة لكل مكدس.
    4. قم بتصدير طرق العرض المحددة بالنقر فوق الرمز الموجود أسفل يمين النافذة ، باستخدام تنسيق "DICOM".
  2. استيراد الصور.
    1. افتح برنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج على اختصار سطح المكتب ، وانتقل إلى "التنسيقات الحيوية" "المستورد" ضمن "المكونات الإضافية" لاستيراد صور DICOM ؛ تأكد من تحديد "تجميع الملفات ذات الأسماء المتشابهة" في نافذة "خيارات استيراد التنسيقات الحيوية".

4. تحليل الصور: التقييم النوعي والكمي لمورفولوجيا اللحمية وخصائصها

  1. تقييم سمك طبقة اللحمية وبومان.
    1. قم بقياس المسافات يدويا على المقاطع العرضية للقرنية ، على سبيل المثال في خمس نقاط متباعدة بشكل متساو عبر المقطع العرضي25.
      1. ارسم خطا بين نقطتين من المسافة المعروفة (مثل ، من اليسار إلى اليمين من الصورة بأكملها ، أي وفقا لمجال الرؤية الافتراضي ، 1024 بكسل أو 780 ميكرومتر) ، انتقل إلى "تحليل" وحدد "تعيين مقياس" ، وأدخل "المسافة المعروفة" و "وحدة الطول" في الحقول المناسبة وانقر فوق "موافق".
      2. ارسم خطا بين نقطتين مجهولتي المسافة ؛ اقرأ الطول أو المسافة المقاسة مباشرة من شريط الحالة.
    2. سجل متوسط ومعامل الاختلاف (COV). ارتبط سمك طبقة بومان أقل من 6.5 ميكرومتر و COV أكبر من 18.6٪ بسدى القرنيةغير الطبيعي 25.
  2. تحديد كثافة الخلايا القرنية.
    1. بعد اتفاقية الفحص المجهري متحد البؤر: مجموع اللحمية en صور الوجه في مجموعات من 7 لإنتاج شرائح ذات سمك مماثل. لهذا ، انتقل إلى علامة التبويب "صورة" وحدد "Reslice Z" ضمن "مكدسات".
    2. ضع في اعتبارك اختلاف (تناقص) كثافة الخلايا عند التقدم عبر السدى24,25. لهذا ، يمكن اعتبار السدى مكونا من 4 مناطق وفقا للعمق: (1) السدى الأمامي جدا أسفل طبقة بومان ، أي 2٪ من سمك اللحمية بالكامل. السدى المتبقي (أي 98٪ من سمك اللحمية بالكامل) ، مع ثلاث مناطق ذات سمك متطابق: (2) سدى أمامي ، (3) سدى منتصف ، و (4) سدى خلفي.
    3. لمزيد من التحليل ، قم بتضمين جميع شرائح الوجه المتاحة للسدى الأمامي للغاية ، و 15 صورة للسدى الأمامي ، و 5 صور للسدى الأوسط ، بالإضافة إلى 5 صور للسدى الخلفي (حيث تم تحديد عدد الصور لكل منطقة المطلوبة لعدد موثوق به من خلال التحليل التدريجي29).
    4. في كل صورة en وجه ، حدد منطقة اهتمام 300 ميكرومتر × 300 ميكرومتر. لتحسين تصور النواة ، اعكس الصورة ، باستخدام "عكس" ضمن علامة التبويب "تحرير" ، واضبط التباين والسطوع. بالنسبة للأخير ، انتقل إلى "الصورة" وانتقل إلى "السطوع / التباين" ضمن "تحليل".
    5. عد نوى الخلية يدويا ، باستخدام وظيفة "عداد الخلايا"25 على سبيل المثال. لهذا ، انتقل إلى "المكونات الإضافية" وانتقل إلى "عداد الخلايا" ضمن "تحليل". اضغط على "تهيئة" ثم حدد نوع عداد. ثم ابدأ في حساب نوى الخلية من خلال النقر على الميزات البيضاوية الداكنة في الصورة المقلوبة ، مع الأخذ في الاعتبار تلك التي تهبط على حدود الصورة فقط لاثنين من الجوانب الأربعة للصورة25.
    6. سجل كثافة الخلية من حيث كثافة المساحة ، أي في الخلايا / مم² (قسم عدد الخلايا المحسوبة على 0.09 ، للتحويل من الخلايا / 90000 ميكرومتر مربع إلى الخلايا / مم²) ، وفقا لاتفاقية الفحص المجهري متحد البؤر حيث ثبت أن كثافة الخلايا القرنية أقل في المرضى (على سبيل المثال ، مع القرنية المخروطية) منها في الأشخاص الأصحاء وترتبط بشدةالمرض 25.
      ملاحظة: من الضروري إجراء مزيد من الدراسات السريرية لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى الحد الأدنى من كثافة الخلايا القرنية للحصول على طعم قرنية واضح تماما بعد الزرع.
  3. تقييم الانعكاس اللحمي.
    1. قم بإنشاء ملفات تعريف عمق متوسط الكثافة لمكدسات الصور اللحمية ، باستخدام وظيفة "ملف تعريف المحور Z" و / أو البرنامج المخصص25،30،31.
      ملاحظة: هذه في الواقع ملامح عمق السعة حيث يقيس FF-OCM سعة الضوء المرتد بواسطة العينة بدلا من شدته.
      1. احسب متوسط المستوى الرمادي لكل مكدس وجه .
      2. اطرح الحد الأدنى للقيمة الرمادية وقم بالتطبيع بالحد الأقصى للقيمة الرمادية.
      3. العرض بمقياس لوغاريتم كدالة للعمق اللحمي (٪ من سمك اللحم).
      4. قم بتقريب المظهر اللوغاريتمي الناتج عن طريق خط الانحدار الخطي ، مما يقلل من مجموع البقايا التربيعية (تناسب المربعات الصغرى).
      5. سجل قيمة مربع R (R²) كمقياس للخطية. يمكن أن تكون القيم الأقل من 0.94 مؤشرا على أمراض القرنية25.
        ملاحظة: للتمييز بين عدم كفاية نموذج الانحدار اللوغاريتمي الخطي (أو نموذج الاضمحلال الأسي الأحادي) بسبب وجود علم الأمراض من مجرد ضوضاء القياس ، يمكن إجراء تحليل الإشارة بواسطة الاستدلال البايزي31. أيضا ، في القرنيات ذات ملامح عمق اللحمة اللوغاريتمية الخطية (أو أحادية الأس) (على سبيل المثال ، ممثلة بقيم مربع R30 أو نسب بيرج 31 قريبة من 1) ، يمكن استخدام حساب المسار الخالي من الفوتون من معدل اضمحلال الإشارة لزيادة تحديد درجة الشفافية31.
  4. تقييم رؤية السمات اللحمية الأخرى ومؤشرات المرض.
    1. تحقق من وجود ندوب أو أنسجة ليفية أو بحيرات أو خطوط فوغت.
    2. تقييم متوسط سمك الأعصاب في السدى، إذا كان مرئيا بما فيه الكفاية للقياس24.
      1. حدد واحدة en صورة الوجه حيث يكون العصب اللحمي أكثر وضوحا (بشكل عام في منطقة منتصف اللحم).
      2. قم بقياس سمك العصب ، على سبيل المثال عند خمس نقاط24 ، ثم احسب المتوسط والانحراف المعياري. قد يكون سمك الأعصاب فوق 9 ميكرومتر مؤشرا إضافيا لعلم الأمراض ، مثل القرنيةالمخروطية 24.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الشكل 1 جهاز FF-OCM (انظر جدول المواد)28 والإعداد العام المستخدم في هذه المخطوطة. يوضح الشكل 2 قرنية متبرع بشري منتفخة بعد تخزينها في وسط زراعة الأعضاء ، مما يعطي نموذجا فسيولوجيا مرضيا للقرنية الوذمية ويمنع الحصول على صورة FF-OCM من خلال سمك القرنية بالكامل بسبب عمق الاختراق المحدود. يؤدي النقل إلى وسط زراعة الأعضاء المكمل بديكستران إلى إزالة التورم وينتج عنه قرنية مانحة ذات سمك طبيعي ، كما هو موضح في الشكل 3. يمكن التعرف على القرنيات المريضة من خلال التغيرات المورفولوجية والسمات اللحمية النموذجية ، بما في ذلك انخفاض وتغير سمك السدى (الشكل 4) و / أو طبقة بومان (الشكل 5). قد يساعد تقييم كثافة الخلايا القرنية (الشكل 6) والانعكاسية اللحمية (الشكل 7) في التحليل الشبيه بالأنسجة والتمايز بين أنسجة القرنية الطبيعية والمرضية مع FF-OCM ، بما يتجاوز قدرات أنظمة OCT السريرية (الشكل 8).

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي وصور فوتوغرافية للإعداد العام وجهاز FF-OCM المستخدم في هذا العمل. (أ) صورة فوتوغرافية لجهاز FF-OCM (انظر جدول المواد)28. (ب) الإعداد التخطيطي والبصري للجهاز. ج: صورة قرنية متبرع بشري في حامل العينة. (د) تكبير هدف الغمر وحامل العينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: القرنية البشرية الطبيعية المزروعة بالأعضاء قبل الانتفاخ. عرض المقطع العرضي (A) و en face (B ، شريحة من خلال السدى) للقرنية المتضخمة ("الوذمة") الناتجة عن التخزين في وسط زراعة الأعضاء ، حيث يمكن رؤية البحيرات كمناطق مظلمة (كما هو موضح بالأسهم). تضاعف سمك القرنية إلى أكثر من 1100 ميكرومتر ، مما يمنع التقاط الصور من خلال العمق بأكمله. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: القرنية البشرية الطبيعية المزروعة بالأعضاء بعد التورم . عرض مقطعي من خلال القرنية بأكملها (A) وعرض لحمية الوجه (B) للقرنية المتضخمة المغمورة في وسط مكمل بديكستران ، مما يدل على خلايا القرنية شديدة الانعكاس (البيضاء) الموزعة بانتظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التقييم الشامل لمورفولوجيا اللحمية وخصائصها ، بما في ذلك سمك اللحم. بالمقارنة مع القرنية البشرية الطبيعية (A) ، فإن القرنيات ذات القرنية المخروطية (B) تتميز بانخفاض وسمك اللحمية المتغير ، جنبا إلى جنب مع العديد من خطوط Vogt المتوازية التي يمكن ملاحظتها كأشرطة عمودية داكنة في مناظر مقطعية ، والأعصاب اللحمية السميكة التي يمكن العثور عليها في منتصف اللحمة en شرائح الوجه (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تقييم سمك طبقة بومان، الذي يحدده الغشاء القاعدي الطلائي مفرط الانعكاس من الأمام، ومن الخلف بواسطة الخلايا القرنية شديدة الانعكاس في السدى الأمامي. بالمقارنة مع القرنية البشرية الطبيعية (A) ، فإن القرنية المرضية (على سبيل المثال ، القرنية المخروطية) (B) تتميز بانخفاض وتغير سمك طبقة بومان بسبب الانقطاع والتندب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تقييم كثافة الخلايا القرنية. (أ) تحسب نوى الخلايا القرنية يدويا على صور الوجه المحسنة والمقلوبة بعد اختيار منطقة ذات أهمية تبلغ 300 ميكرومتر × 300 ميكرومتر. (ب) يشار إلى النوى المعدودة بالأسهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تقييم الانعكاسية اللحمية. تتناقص كمية الضوء المرتد (أضعافا مضاعفة) مع العمق في سدى قرنيات المتبرع الطبيعي (انظر الشكل 3 والشكل 4 أ) ، مما يؤدي إلى ملامح عمق لوغاريتمية خطية ، ممثلة بقيم مربع R قريبة من 1 (أثر أخضر). قد لا ينطبق هذا على القرنيات المرضية التي تتميز بمناطق انسجة من التشتت العكسي المتزايد للضوء (انظر الشكل 4 ب). إن وجود مثل هذه السمات العيانية ، كما في مثال القرنية ذات الندبة اللحمية بعد التهاب القرنية المعدي (الموضح في الجزء الداخلي) ، سيخلق ملامح عمق شدة لوغاريتمية غير خطية ، ممثلة بقيمة مربع R أقل من عتبة معينة (على سبيل المثال ، أقل من 0.9425 ؛ أثر أحمر). لاحظ أن ملامح عمق السعة اللوغاريتمية تظهر في الواقع حيث يقيس FF-OCM سعة الضوء المتناثر بواسطة العينة بدلا من شدته.  يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: عرض توضيحي لفوائد FF-OCM على علم الأنسجة والمجال الطيفي OCT. (أ) علم الأنسجة و (ب) صورة المجال الطيفي OCT المقابلة المكتسبة على نفس القرنية في الجسم الحي قبل رأب القرنية. (C) المقطع العرضي المقابل FF-OCM لزر القرنية خارج الجسم الحي بعد رأب القرنية ، مما يوضح دقة فائقة مقارنة بصور OCT ذات المجال الطيفي السريري. كما أن التليف مرئي بشكل أكثر وضوحا في صور FF-OCM منه في الأنسجة. يمكن رؤية الكثافة العالية للخلايا القرنية في السدى العلوي بوضوح في كل من المقطع العرضي (C) و (D) في الوجه . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد البروتوكول الموصوف هنا للتقييم النوعي والكمي للسدى المانحة للقرنية باستخدام FF-OCM على التحليل الشبيه بالأنسجة للسمات العيانية والمجهرية التي تشير إلى الحالة اللحمية ، بما يتجاوز قدرات المجال الطيفي OCT والمجهر متحد البؤر21،24،25 ، ويتيح التمييز بين الأنسجة البشرية المريضة والطبيعية.

بصرف النظر عن تقييم الجودة البطانية الممتازة للقرنيات المانحة البشرية عن طريق الفحص المجهري المرآوي ، فإن تقييم جودة اللحمة يمثل تحديا في بنوك العيون ، ويقتصر عموما على المراقبة الإجمالية باستخدام المجهر الحيوي للمصباح الشقي و / أو الفحص المجهري الضوئي في البروتوكولات الحالية. إن عدم وجود دقة دقيقة مع الطرق الحالية لا يعني فقط أنه يمكن اختيار القرنيات المصابة ببعض أمراض اللحمة التي تعرض نتيجة رأب القرنية للخطر ، ولكن أيضا أنه قد يتم رفض القرنيات بسبب عتامة اللحمة التي هي في الواقع قيد على السدى الأمامي أو المناطق الظهارية ولا يزال من الممكن استخدامها لإجراءات رأب القرنية البطاني14.

يمكن استكمال بروتوكول بنك العين الحالي بإضافة FF-OCM ، والذي نظرا لدقته الفائقة ، يشكل أداة قوية وغير جراحية لإكمال تقييم جودة القرنية ، وخاصة السدى (بما في ذلك طبقة بومان). على عكس فحص المصباح الشقي ، يظل الكسب غير المشروع مغمورا في غرفة مغلقة مملوءة بوسط تخزين طوال فترة الحصول على صورة FF-OCM ، مما يقلل من أي خطر محتمل للتلوث.

للحصول على صورة ناجحة باستخدام FF-OCM (انظر جدول المواد) ، من المهم أن يكون هدف المجهر مغمورا جيدا في الجل البصري الذي يتم تطبيقه أعلى غطاء حامل العينة (الخطوة 2.2.3). يوصى أيضا بالتحقق بانتظام من معايرة الجهاز ، وهو إجراء يتم تنفيذه أيضا بعد الضبط التلقائي غير الناجح (الخطوة 2.2.2) ويتم الوصول إليه عبر "الأدوات والخيارات" في برنامج الاستحواذ (انظر جدول المواد). الإجراء ، الذي يتضمن استخدام مرآة معايرة في حامل العينة ، هو نفس إعداد العينة المعتاد (انظر الخطوة 1.2) باستثناء أنه يجب وضع الجل البصري على المرآة قبل وضع غطاء الغطاء.

تم استخدام سلسلة من ترقيع القرنية المانحة ، التي تعتبر ذات سدى طبيعية وفقا لإجراءات بنك العين الحالية ، لوصف البروتوكول في هذه المخطوطة وعلى وجه التحديد إظهار مدى ملاءمة FF-OCM لإجراء تقييم دقيق وموثوق لجودة انسجة المانحين. تمت مقارنة قرنيات المتبرع الطبيعي هذه مع القرنيات المرضية المغمورة في وسط التخزين ، مما يدل على أن التحليل الشبيه بالأنسجة أصبح ممكنا باستخدام FF-OCM للعديد من السمات اللحمية (الموضحة في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 والشكل 7 والشكل 8) في ترقيع القرنية يسمح بالتمييز بين أنسجة القرنية البشرية المريضة والطبيعية.

بصرف النظر عن التغيرات المورفولوجية ، مثل وجود ندوب (الشكل 5 والشكل 7) ، أو الأنسجة الليفية (الشكل 8) ، أو البحيرات (الشكل 2) ، أو خطوط Vogt (الشكل 4) ، أو زيادة قطر العصب اللحمي (الشكل 4) ، توجد سمات انسجة نموذجية في القرنيات المريضة. يبدو أن المعلمات اللحمية ذات الصلة بشكل خاص في تقييم الجودة اللحمية هي سمك طبقة بومان وتنوعها ، والانعكاسية اللحمية. وبالتالي فإن الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي الخطوتان 4.1 و 4.3.

أثناء إفرازها أثناء نمو القرنية البشرية ، تصبح طبقة بومان ، على وجه الخصوص ، متميزة بحلول 19 أسبوعا من الحمل ولا يتم إصلاحها أبدا بعد الولادة32. وبالتالي فإن الأضرار التي لحقت بطبقة بومان لا رجعة فيها وتعمل كمؤشر مثالي للتلف اللحمي السابق في أنسجة القرنية المانحة ، بما في ذلك الأضرار الناجمة عن الجراحة الانكسارية والتهاب القرنية المعدية والقرنية المخروطية. ترتبط أمراض القرنية هذه ، التي تشكل موانع لاستخدام قرنية المتبرع ، بانخفاض وتغير سمك طبقة بومان بسبب الانقطاع والتندب (الشكل 5) ، ومن المحتمل أن تفوتها بروتوكولات بنك العين الحالية عندما لا يكون تاريخ المتبرع معروفا بدقة.

على الرغم من ضعف شفافية القرنية بعد وفاة المتبرع بسبب وذمة القرنية بعد الوفاة ، فمن المتوقع أن تنخفض كمية الضوء المتناثر أو الانعكاسية اللحمية أضعافا مضاعفة مع العمق في السدى (انظر الشكل 3 والشكل 4 أ) ؛ نتيجة لذلك ، سيكون لوغاريتم الانعكاسية اللحمية الطبيعية دالة خطية للعمق اللحمي في قرنية المانحين الطبيعية ، ممثلة بقيم مربع R قريبة من 1. على العكس من ذلك ، يرتبط وجود السمات العيانية بملامح العمق اللوغاريتمي غير الخطي ويدل على مرض انسجة (الشكل 4B والشكل 7)25.

نظرا لأن كثافة الخلايا القرنية مسؤولة عن تخليق وتجديد ألياف الكولاجين اللحمية ومصفوفة خارج الخلية ، يبدو من المعقول افتراض أن كثافة الخلايا القرنية هي معلمة أخرى ذات صلة لتقييم جودة انسجة المتبرع ، وأنه لا ينبغي زرع الأنسجة التي تظهر عددا منخفضا جدا من الخلايا القرنية. لذلك يتضمن البروتوكول طريقة دقيقة وموثوقة لقياس كثافة الخلايا القرنية من صور FF-OCM التي يمكن استخدامها بسهولة في بنوك العيون25 وتتبع اتفاقية الفحص المجهري متحد البؤر. لاحظ أنه مع FF-OCM ، يمكن أيضا تحديد كثافة الخلايا القرنية عن طريق حساب الخلايا القرنية مباشرة في عرض المقطعالعرضي 33 ، وهي ميزة محتملة على الفحص المجهري متحد البؤر ، والذي يتطلب حساب الخلايا القرنية على شرائح متعددة في الوجه. ومع ذلك ، على عكس المرضى الأحياء ، حيث ثبت أن كثافة الخلايا القرنية أقل في مرضى المرض منها في الضوابط العادية 34،35،36،37 وترتبط مع شدة المرض34،38 ، لم يكن هذا هو الحال في عينات الأنسجة البشرية خارج الجسم الحي 25 ، ومن الضروري إجراء مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كان الحد الأدنى من الخلايا القرنية مطلوبا في قرنيات المتبرع بها ليؤدي إلى انتعاش بصري جيد بعد الزرع. يمكن تفسير انخفاض كثافة الخلايا القرنية في أنسجة المتبرع كما هو الحال في الأنسجة المرضية بالشيخوخة ، وفقدان الخلايا بعد الوفاة الناجم عن نقص التروية ، و / أو تخزين أنسجة المتبرع27،39،40،41. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن قرنيات المتبرع الطبيعي التي تم الحصول عليها وتصويرها في هذا البروتوكول إما تم تخزينها وذمها أو تفريغها ، أو تم التخلص منها من قبل بنك العيون قبل الزرع بسبب رداءة جودة البطانة وفقا لمعايير جمعية بنك العيون في الاتحاد الأوروبي. إذا تم تضمين تصوير FF-OCM جنبا إلى جنب مع البروتوكول الموصوف في إعداد بنك العين ، تقييم القرنيات عادة في حالة أعذب مما كان ممكنا هنا ، مما قد يؤثر على كثافة الخلايا القرنية.

يمكن تمديد البروتوكول الموصوف هنا لتحليل الجودة اللحمية لتقييم غشاء Descemet ، والذي يمكن حله أيضا باستخدام FF-OCM من حيث السماكة والهيكل21,24. قد يكون هذا مفيدا لاختيار الأنسجة لرأب القرنية البطاني الغشائي ل Descemet ، حيث قد يكون من الصعب فصل أغشية Descemet الرقيقة عن السدى.

في الختام ، يتيح FF-OCM تقييما دقيقا وموثوقا لسدى القرنية من متبرع بشري أثناء التخزين. من خلال تحسين جودة الكسب غير المشروع ، فإن إضافة هذا البروتوكول إلى إجراءات بنك العين الحالية لديها القدرة على تحسين فحص واختيار الأنسجة المانحة ، وبالتالي نتائج رأب القرنية. يجب تسهيل التكامل الواقعي لجهاز FF-OCM في روتين بنك العين من خلال التحديثات التكنولوجية الأخيرة ، بما في ذلك الحصول على الصور بشكل أسرع ومجال رؤية أكبر بفضل تطوير كاميرا CMOS مخصصة ، وتصميم أشرطة كاسيت معقمة مخصصة يمكن التخلص منها لتخزين القرنية والتعامل معها أثناء التصوير.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى هذا العمل تمويلا من الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) ، في إطار منحة PRTS (مشروع البحوث الترجمية في الصحة) رقم ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) ومن برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي في إطار اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 709104 (K.I.). يشكر المؤلفون سيلين دي سوزا على المساعدة في عد الخلايا والمعالجة النسيجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماسح ضوئي للأشعة المقطعيةالخفيف LLTech ، فرنساhttp://www.lltechimaging.com/products-applications/products/جهاز FF-OCM المستخدم في هذه المخطوطة لتصوير
CorneaJetEuroBio ، فرنساhttp://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.htmlوسط زراعة الأعضاء الذي يتم فيه تخزين قرنيات المتبرعين
CorneaMaxEuroBio ، فرنساhttp://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.htmlوسط زراعة الأعضاء المكملة بالديكستران المستخدم في إزالة التورج   ؛
فيجي (ImageJ)المعهدالوطني للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكيةhttps://fiji.sc/برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر
MatlabMathworks، Inc. ، Natick ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlبرامج الحوسبة الرياضية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment. Br J Ophthalmol. 96, 614-618 (2010).
  2. Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
  3. Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
  4. Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
  5. Amayem, A. F., Anwar, M. Fluid lamellar keratoplasty in keratoconus. Ophthalmology. 107, 76-79 (2000).
  6. Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
  7. Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
  8. Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
  9. Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
  10. Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
  11. Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
  12. Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
  13. Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
  14. Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
  15. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  16. Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
  17. Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
  18. Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
  19. Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H. Full-field optical coherence microscopy. Opt Lett. 23, 244-246 (1998).
  20. Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
  21. Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
  22. Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202(2007).
  23. Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006(2010).
  24. Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
  25. Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
  26. Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
  27. Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
  28. Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
  29. Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
  30. Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
  31. Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
  32. Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
  33. Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
  34. Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
  35. Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
  36. Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik. Ophthalmology. 102, 140-146 (2005).
  37. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
  38. Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
  39. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
  40. Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة