يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

13ج الأحماض الدهنية إيسوتوبولوجوي التنميط يوفر نظرة ثاقبة نقل الكربون التغذوية والايض الدهني للمستهلكين اللافقاريات

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57110

⸱

أبريل 17, 2018

 ,  ,  , 
1Ecology, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

في هذه المقالة

ملخص

نهج علامة المستوى الغذائي الأحماض الدهنية، أي استيعاب الأحماض الدهنية كجزيء كامل ونقل الأنسجة المستهلك مع عدم وجود ثانوية أو التعديل، ويعوقها عن الثغرات المعرفية في استقلاب الأحماض الدهنية من اللافقاريات الصغيرة التربة. إيسوتوبولوجوي التنميط يتم توفيرها كأداة قيمة تشابك التفاعلات التغذوية.

الملخص

الأحماض الدهنية (فاس) هي المؤشرات الحيوية مفيدة في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية لأنها عادة استيعابهم كجزيء كاملة وتحويلها إلى أنسجة المستهلك مع قاصر أو أي تعديل، مما يسمح توجيه الغذائية بين مختلف المستويات الغذائية. بيد يعوقها نهج العلامة التغذوية اتحاد كرة القدم لا تزال المعرفة المحدودة في الأيض الدهون الحيوانية التربة. هذه الدراسة بلميتيك تماما المسمى (13C16:0، 99 في المائة الذرة) تتبع في مسارات استقلاب الأحماض الدهنية للتربة على نطاق واسع هما Collembola، فيماتا بروتافورورا ونيتيدوس هيتيروموروس. من أجل التحقيق في مصير والتعديلات الأيضية لهذه السلائف، يرد أسلوب التنميط إيسوتوبولوجوي، يؤديها الكتلي باستخدام الرصد أيون واحد. وعلاوة على ذلك، هو وصف للمختبر المنبع تغذية التجربة، فضلا عن استخراج ومثلايشن الكسور المهيمنة في الدهون (الدهون محايدة، فوسفوليبيدات) وصيغة ذات الصلة والعمليات الحسابية. إيسوتوبولوجوي التنميط لا فقط الغلة إثراء 13ج عموما في الأحماض الدهنية المستمدة من 13ج المسمى السلائف بل تنتج أيضا نمط إيسوتوبولوجويس تتجاوز كتلة أيون الأصل (أي أيون الجزيئية اتحاد كرة القدم م+) كل المسمى اتحاد كرة القدم بواحد أو أكثر من وحدات جماعية (M+ 1، M+ 2، M+ 3، إلخ). تسمح هذه المعرفة الاستنتاجات على نسبة التوجيه الغذائية من FA المستهلكة تماما بالمقارنة مع حيثياته الحيوي. التنميط إيسوتوبولوجوي يقترح كأداة مفيدة لتقييم الأيض الأحماض الدهنية في الحيوانات التربة تشابك التفاعلات التغذوية.

المقدمة

في موطن خفي مثل التربة، يصعب معالجة العلاقات التغذوية وكذلك مقيدة بصغر حجم الحيوانات. العقد الماضي قد شهد تقدما في الإيكولوجيا الكيميائية الحيوية، لا سيما في استخدام الأحماض الدهنية كالمؤشرات الحيوية لتحديد استراتيجيات تغذية الحيوانات التربة تحت حقل الشروط1،،من23. وهذا يستند إلى حقيقة أن الأحماض الدهنية من الموارد يمكن إدراجها في الأنسجة المستهلك كجزيئات كامل، وصف عملية التوجيه الغذائي4. وذكر نقل الأحماض الدهنية على ثلاثة مستويات غذائية، أي من الفطريات للديدان الخيطية إلى Collembola5. مؤخرا، واعتبرت أن الحيوانات المفترسة6،7 والاستعراضات الأولى على الأحماض الدهنية كعلامات المستوى الغذائي في الشبكات الغذائية التربة قد تم نشر8،9.

معلومات أكثر تفصيلاً عن التفاعلات التغذوية يتحقق بالأحماض الدهنية النظائر المستقرة السبر (اتحاد كرة القدم-المسبار). تحديد 13ج/12ج نسب الأحماض الدهنية في الوجبات الغذائية والمستهلكين يمكن أن تنسب الروابط الثنائية وتقدير تدفق الكربون المرتبطة بها، وقد استخدمت في الأرضية والمياه العذبة، والشبكات الغذائية البحرية10،11 ،،من1213. والافتراض الأساسي أن الأحماض الدهنية الموجه الغذائية لا تخضع العمليات الانزيمية؛ ولذلك، على 13ج إشارة، أي 13ج/12ج نسبة الأحماض الدهنية، في المستهلك مشابه لذلك في النظام الغذائي1. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن استنفاد تدريجي لتوقيع 13ج في سلسلة الغذاء في النظم المائية، مما يعرقل تطبيق FA-المسبار على نطاق واسع في الدراسات التغذوية14،،من1516. وعلاوة على ذلك، المعرفة في استقلاب الدهون في معظم اللافقاريات في شبكات الأغذية الأرضية ما زالت محدودة.

فهم مسارات الأيض الدهني في المستهلكين ضروري لاستخدام الأحماض الدهنية علامة المستوى الغذائي كوسيلة لتحديد تدفق كمية الكربون في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية. مع وضع هذا في الاعتبار، 13ج-إيسوتوبولوجوي التنميط، يمكن تطبيق المبدأ الذي في التحقيق في استقلاب الكربون من أي نظام بيولوجي17، أسلوب يبشر بالخير. عقب إدخال الركازة الكربون المسمى ج 13، توزيع 13ج في شبكة الأيضية يمكن تتبعها منذ المنتجات الأيضية التي تم إنشاؤها في إظهار المستهلك بتوزيع إيسوتوبولوجوي محددة. يمكن تقييم هذا التحليل الطيفي الكمي الرنين النووي الأيضية18،19 أو الكتلي20،21، مع العينات البيولوجية يفضل في الأخير مع الكتلة الحيوية منخفضة بسبب لها أعلى حساسية.

على الرغم من أن التنميط إيسوتوبولوجوي بنجاح طبق للأحماض الأمينية وتوفر نظرة ثاقبة في فيفو استقلاب الكربون من مسببات الأمراض البكتيرية17،،من2223، تنفيذه في الدهنية وقد تخلفت الأحماض. أول تحليل مفصل عن مصير النظائر المستقرة التي تسمى الأحماض الدهنية السلائف والغذائية التوجيه أو التدهور عن طريق الأكسدة بيتا، في التربة المستهلكين اللافقاريات، أنجز مؤخرا بمنزل et al. 24-وترد هنا، أساسيات المنهجية لإدماج التجارب مع 13ج المسمى الأحماض الدهنية التي يتبعها التحليل إيسوتوبولوجوي من أحفاد الرئيسية في التربة متكررة اللافقاريات، Collembola،. هذه ميكروارثروبودس مجموعة نموذجا جيدا كما أنها تشكل عناصر هامة في الشبكة الغذائية للتربة وهي كذلك التحقيق على علامة المستوى الغذائي الأحماض الدهنية8،25.

فهم مسارات الأيض الدهني في المستهلكين ضروري لاستخدام الأحماض الدهنية علامة المستوى الغذائي كوسيلة لتحديد تدفق كمية الكربون في الإيكولوجيا الشبكة الغذائية. يعطي هذا البروتوكول بتصميم وإعداد لمختبر تغذية التجربة، والبيوكيميائية إجراءات استخراج ومثلايشن من الكسور المهيمنة الدهون (الدهون محايدة، فوسفوليبيدات) من Collembola. فإنه يوضح كيف يتم تحليل تكوين إيسوتوبولوجوي الأحماض الدهنية بالطيف الكتلي وتوضح الصيغة ذات الصلة والعمليات الحسابية. ينتج عن هذا الإجراء: (ط) نسب إيسوتوبولوجويس تتجاوز كتلة أيون الأصل (أي أيون الأحماض الدهنية الجزيئية م+) واحد أو أكثر الكتلة وحدات (M+ 1، M+ 2، M+ 3، إلخ) و (ii) الشاملة 13 ج الإثراء في الأحماض الدهنية المستمدة من السلائف توسم 13ج. على الرغم من أن يستخدم Collembola، هذا النهج يمكن تطبيقها عموما على أي تفاعل الفرائس الأخرى على فرضية أن هذه كولتورابل في كمية كافية تحت ظروف خاضعة للرقابة لضمان امتصاص تسمية ناجحة واللاحقة التحقق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بروتوكول وصف لا تقع تحت الاختصاص من "أخلاقيات الحيوان". ومع ذلك، العناية عند تكييف الناس وصف بروتوكولات الحيوانات العليا، أن وافقت اللجنة "الحيوان الأخلاقيات" المؤسسية في البروتوكول للتعامل مع الحيوانات.

1-زراعة الحيوانات

ملاحظة: جميع شرح الخطوات التجريبية تستند إلى بروتوكولات راسخة26،،من2728. بيوتيستس في المختبر بحاجة إلى إمدادات مستمرة من الكائنات كولتورابل بسهولة. هنا، وقد استخدمت هذه الأنواع Collembola فيماتا بروتافورورا (جيسين، 1952) نيتيدوس هيتيرموروس (تمبلتون، 1835). كل الأنواع بسيطة للحفاظ على كثقافات المختبرات المنتجة التي تتغذى على بيكر للخميرة.

  1. في ميكروكوسمس بلاستيكية بأغطية مناسبة ضيق (قطرها 7 سم، ارتفاع 4.5 سم) وإضافة خليط فحم المنشط، جص باريس، والمقطر المياه لتوفير ركيزة خصبة جداً رطبة (الشكل 1A).
    1. عند إعداد مزيج ميكروكوسمس ما يكفي من الركازة، مثلاً، ميكروكوسمس 10 في دفعة. أجزاء 9 مزيج من الجص باريس (225 غ) والجزء 1 من جفاف الفحم المنشط (25 غ) معا في وعاء من جص، إضافة بعناية نحو 10 أجزاء من الماء المقطر (250 مل) والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق دون إثارة في درجة حرارة الغرفة.
    2. يقلب بملعقة معمل بسرعة معتدلة في اتجاه عقارب الساعة لتجنب فقاعات الهواء حتى يتحقق اتساق الرغوية سميكة. تصب مباشرة في ميكروكوسمس بارتفاع حوالي 1 سم.
    3. بالتنصت على مقاعد البدلاء لطيف ويحوم على نحو سلس الجص. علما بأن الثقوب (منتجات عشوائية من فقاعات الهواء) والشقوق (أضيف بنشاط مع ملعقة معقمة) قد يشجع Collembola خصبة تضع بيضها هناك. تجنب هذه الدراسة الثقوب والشقوق صالح بعد استنساخه بنفس الشروط. ومع ذلك، يعرض الشكل 1B لأغراض العرض التوضيحي بعض الثقوب.
    4. السماح لتجفيف لحوالي 1-2 أيام في درجة حرارة الغرفة؛ الحضانة عند 60 درجة مئوية قد يقلل ذلك الوقت إلى ح 1-2.
    5. ترطيب ميكروكوسمس قبل الاستخدام بإضافة ماء الصنبور مع ماصة حتى الركيزة مبللة قليلاً. تبقى مصغراً رطبة بإضافة الماء المقطر بانتظام كما Collembola بشرة ناعمة، وهو عرضه للجفاف.
  2. نقل Collembola بسهولة إلى قاعدة الجص استخدام أنبوب شفط بسيطة، أي أنبوب سيليكون طويل حوالي 25 سم طويلة مع تلميح ماصة مزودة بشبكة صغيرة لمنع شفط حيوانات في الأنبوب. وبدلاً من ذلك، نقل الحيوانات بالسماح لهم بالانضمام في شعيرات فرشاة صغيرة.
  3. نقل (راجع الخطوة 1، 2) 30 طازجة فقست Collembola إلى ميكروكوسمس جديدة وتوفر حبيبات الخميرة الشعبية بيكر الجافة كغذاء (حول تلميح سكين) (الشكل 1B)؛ تجديد على الأقل مرتين في أسبوع. الخطة ثلاثة مستقلة وإنشاء نسخ متماثلة يوميا أخذ العينات؛ في هذه الدراسة أيام 0-7 و 14. احتضان عند 15 درجة مئوية في الظلام. يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة ومن الضروري، الأحماض الدهنية يغير الأيض الحيواني الوفاء بمتطلبات السيولة الغشاء.
  4. تغذية Collembola مع بيكر للخميرة لمدة أربعة أسابيع قبل بدء تجارب التعرض للحصول على متجانسة 13ج/12ج إشارة ونمط في الأحماض الدهنية. استخدام أنبوب شفط أو فرشاة لإزالة جميع البيض (الشكل 1)، الكريات البراز، واكسوفياي بانتظام كالحيوانات قد تتغذى عليها وبالتالي تغيير صورتهم الدهن.

figure-protocol-1
رقم 1: زراعة Collembola. (أ) صورة مصغرة مليئة بتربية الركازة، وخليط مجفف من باريس الجبس والفحم المنشط والماء المقطر. (ب) و (ج) عينة تمثيلية من ثقافة فيماتا بروتافورورا ؛ ملاحظة شذرات صغيرة من الخميرة الجافة بيكر لاستخدامه كمصدر للغذاء، وأيضا كالثقوب في الركيزة تربية (السهم الأسود) (ب) فضلا عن اثنين من البيض (السهم الأبيض) (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-وضع العلامات النظام الغذائي، والحصاد، والتعامل مع عينة

  1. وضع العلامات
    1. أربعة أسابيع بعد إنشاء ثقافات Collembola، ضع كل 30 شخصا في ميكروكوسمس الجديدة واحتضان عند 15 درجة مئوية في الظلام.
    2. عرض التسمية النبض باطعامهم الخميرة بيكر الذي يحتوي على تماما 13ج المسمى بلميتيك (13C16:0، 99 في المائة الذرة) بخلط حمض النخليك المسمى ج 13مع بيكر للخميرة مع ملعقة في نسبة 0.5:1، مثلاً، 5 غ 13 C16:0 و 10 جرام الجاف خميرة بيكر. ضع حول تلميح سكين على كل مصغر.
    3. بعد ح 6، يحل محل هذا المسمى الغذاء مع بيكر غير مسمى تماما للخميرة.
  2. زراعة مزيد
    1. وأثناء التجربة تجديد النظام الغذائي الخميرة كل ثلاثة أيام وإضافة مبالغ تزيد على ما سوف تستهلك Collembola خلال تلك الفترة. الأهم من ذلك، استخدام أنبوب الشفط أو فرشاة لإزالة كوليمبولان البيض والكريات البراز واكسوفياي بانتظام لضمان تغذية الحصري بالحيوانات على الطعام المتوفر.
  3. الحصاد
    1. عينة ميكروكوسمس مدمر يوميا حتى يوم 7. ثم في يوم 14، جمع ثلاثة replicates مستقلة في كل وقت أخذ العينات؛ مرات أخذ العينات المختلفة الممكنة.
    2. إعداد أنابيب زجاجية 10 مل مزودة بالاغطية اللولبية تفلون المغلفة، واحدة لكل عينة. مسبقاً تنظيف هذه الأنابيب في غسالة الأواني زجاجية وشطف مرتين بالمياه بعد ذلك. وأخيراً، لإزالة أي آثار مسعور الملوثات يغسل مرتين بإضافة 2 مل كلوروفورم ([هبلك] الصف)، دوامة تقريبا وتجاهل المذيب.
    3. لمراقبة أخذ العينات (يوم 0)، 3 30 Collembola غير مكشوف من ثقافات ما قبل كعينات اليوم 0.
    4. لعينات المكشوفة (اليوم 1 وما بعدة)، تتخذ بالنسبة للعينات اليومية في كل حالة 3 30 تعرض Collembola من الثقافات العولم تغذية مع المزيج من حمض النخليك المسمى ج 13والخميرة الشعبية بيكر.
    5. تسجيل الوزن الطازج Collembola الترا-ميكروبالانسي. نقل الحيوانات استخدام مصاصة أو فرشاة للأحواض الحجم المناسب. لضمان سهولة التعامل من Collembola أثناء وزنها في النطاق الأحواض، الحيوانات صدمة باردة قبل (-80 درجة مئوية ح 2). وبدلاً من ذلك، يمكن بأمان صاعقة تيار2 CO لمدة 10 دقائق الحيوانات.
  4. وزنها مباشرة بعد وضع الحيوانات من المقياس-كعك بعناية في 10 مل زجاج أنابيب الاختبار. ملء الأنابيب مع 1 مل من الميثانول ([هبلك] الصف) ومخزن في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، تجنب التعامل مع عينة مع معدات البلاستيك كما تشارك المذيبات العضوية؛ بدلاً من ذلك استخدام موزعات والماصات التي تصلح للمذيبات وكذلك الأوعية الزجاجية.

3-الدهن الاستخراج من الأنسجة الحيوانية وميثانوليسيس

  1. إعداد ثلاثة الزجاج-أنابيب الاختبار (مجهزة بأغطية المسمار تفلون المغلفة) كل مجموعة التي تحتوي على فقط 1 مل ميثانول كقيم فارغة. الأهم من ذلك، إضافة أو نقل أي المذيبات المستخدمة في هذا البروتوكول إلا من خلال الزجاج الماصات أو كلوروفورم/الميثانول تشطف موزعات المقاوم للمذيبات.
  2. في بداية عملية استخراج الدهن، الحد من الميثانول تطبيقها للتخزين (أو تقطيع) عن طريق التبخر؛ ويوصي من benchtop مدمجة مركزات فراغ التناوب (RVC) مزودة بمضخة فراغ وفخ باردة. نقل أنابيب مفتوحة إلى RVC وتتبخر حتى الجاف عند ضغط 50 درجة مئوية، والفراغ من hPa 200 لمدة 20 دقيقة.
  3. إضافة 5 مل مذيب الاستخراج على مرحلة واحدة (1:2:0.8 العازلة فوسفات chloroform/methanol/0.05 م، ودرجة الحموضة 7.4) لكل عينة (بما في ذلك الفراغات)، واستخراج الدهون كوليمبولان في درجة حرارة الغرفة بالمصافحة بين عشية وضحاها (~ 200 لفة في الدقيقة).
  4. نقل المذيب لأنابيب جديدة وإعادة استخراج عينات من الهز ح 3 مع مل 2.5 إضافية لاستخراج المذيبات. وبعد ذلك، تجمع بين مقتطفات من كل الخطوات؛ يوصي باستخدام الزجاج الماصات باستور. إضافة 0.8 مل كلوروفورم و 0.8 مل من الماء المقطر، ثم تخلط والطرد المركزي في ز 2,000 في 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وأخيراً، تسمح العينات إلى الوقوف لمدة 5 دقائق لفصل مائي كلوروفورم المراحل.
  5. لتحليل أنماط الأحماض الدهنية، تقسيم الدهون الخلوية مجموع من Collembola إلى المادة الدهنية محايدة وشحمي سكري والكسور فسفوليبيد.
    1. لكل عينة، وإعداد عمود حمض السيليكا (العمود التجاري مع حمض السليكى ز 0.5، مش حجم 100-200 ميكرومتر، انظر الجدول للمواد) بإضافة 1 مل كلوروفورم (حدد). لتسريع هذه العملية، جبل الأعمدة على كتلة فراغ كما يشيع استخدامها في الفصل اللوني لاستخراج المرحلة الصلبة. عدم استخدام الإبر النايلون؛ استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ أعلى الأنابيب.
    2. بعد كلوروفورم المستخدمة ل preconditioning مرت نقل العمود في مرحلة كلوروفورم السفلي كاملة لكل عينة لعمود فردي. لتبسيط هذا الإجراء، يمكن إزالة المرحلة المائية العليا مسبقاً. استخدام الماصات باستور من الزجاج، ومع ذلك، والعناية بأن الأعمدة لا تجف.
    3. تباعا الوت الكسور الدهن مع 5 مل كلوروفورم (بما في ذلك المادة الدهنية محايدة الأحماض الدهنية، نلفاس)، 10 مل من الأسيتون (جليكوليبيدس--لم يتم تحليلها في هذا المشروع) و 5 مل من الميثانول (بما في ذلك الأحماض الدهنية فسفوليبيد، بلفاس). جمع كل جزء في الأوعية الزجاجية الفردية.
    4. في نهاية الاستخراج، تخفيض كلوروفورم (نلفاس) والميثانول (بلفاس) عن طريق التبخر في RVC. نقل أنابيب مفتوحة إلى RVC وتتبخر حتى الجاف، ~ 90 دقيقة في 60 درجة مئوية وفراغ من 24 hPa.
  6. بدء تصبن الدهون (نلفا وبلفا الكسور) يتبع البروتوكول من وولش (1991)29 مع إضافة 1 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم-الميثانول (45 غ هيدروكسيد الصوديوم و 150 مل من الميثانول و 150 مل من الماء المقطر) واحتضان في 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي. بارد العينة في المياه الجليدية لمدة 2 دقيقة، ثم وضع العينات مرة أخرى على مقاعد البدلاء ومواصلة العمل في درجة حرارة الغرفة.
  7. إضافة معيار داخلي لكل عينة بما فيها الفراغات. اختر الأحماض الدهنية ليست شائعة في الكائنات الحية التجريبية؛ أيضا استخدام الأحماض الدهنية مشبعة لتقليل الخسارة بالانقسام وحدد جزيء مع طول سلسلة الوسيطة. لأغراض عديدة، يعمل حمض (19:0) الوترية نوناديكانويك جيدا. لذا، إضافة 30 ميليلتر من حل 0.74 ملم في إيسوكتاني. كمية الدقيق مهم جداً--تأكد من فحص دقة الخاص بك ماصة مع ميكروبالانسي مقدما.
  8. إضافة 2 مل من حمض الهيدروكلوريك-الميثانول (ميكس 325 مل حمض الهيدروكلوريك ن 6.0 مع مل 275 من الميثانول)، واحتضان عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حوض ماء وباردة سريعاً على الجليد لمدة 2 دقيقة. هذه الخطوة هي الوقت ودرجة الحرارة الحساسة؛ استخدام 80 ± 1 درجة مئوية و 10 ± 1 دقيقة الاختيار مع عينات كثيرة كيف يمكن الذهاب إلى حوض ماء في وقت واحد للحفاظ على 80 درجة مئوية.
    ملاحظة: نتائج هذا الإجراء في الأحماض الدهنية استرات الميثيل (الشهرهشهره)، أي، تحليلها الأحماض الدهنية التي استقرت للتبخير في الفصل اللوني للغاز.
  9. وأخيراً، إضافة 1.25 مل الهكسين/الميثيل بوتيل العالي خماسي البروم ثنائي الفينيل (1:1) وإزالة الصخور بلطف ل 10 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 2,000 ز للحد الأدنى 5 في المرحلة السفلي وتبقى مرحلة أعلى يتألف من الشهرهشهره؛ استخدام الزجاج الماصات باستور. أضف 3 مل هيدروكسيد الصوديوم المائية (10.8 غرام من هيدروكسيد الصوديوم المذابة في 900 مل ماء المقطر) لخطوة غسيل.
    1. موسيقى الروك وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
  10. تأخذ كامل العلوي المحتوية على الدهن مرحلة استخدام الزجاج ماصة باستور ونقل إلى قنينة نموذج الفصل لوني للغاز مجهزة حاجز تفلون. تجنب بما في ذلك كميات صغيرة حتى المرحلة المائية، وأن هذا سوف يسبب مشاكل مع قياس GC. تغليف القنينة وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى التحليل.

4-التحديد الكمي للأحماض الدهنية التي GC FID

  1. استخدام الفصل اللوني للغاز لتحديد وتقدير حجم الشهرهشهره في الكسور نفلا وبلفا الدهون Collembola (الحيوان). الغاز اللوني (GC) مجهزة مكشاف تاين الاشتعال (FID) هو معدات ثابتة ومجربة30.
  2. لتحديد الشهرهشهره، قارن الاحتفاظ بوقت الذروة في العينة لتلك الموجودة في معيار شهرة. هذه خليط القياسية النوعي أو الكمي لمفتاح الشهرهشهره تغطي مجموعة متنوعة من المنتجات الغذائية والكائنات الحية.
  3. وتستخدم المزائج الشهرة القياسية تتألف من ممثل منظمة تضامن النساء الأفريقيات لفريق التحقيق في الكائن الحي والحمية التجريبية. في Collembola، هذه خصائص الأحماض الدهنية حقيقيات النوى، مثلاً، سلسلة طويلة الأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض اراسيدونيك (20:4ω6). عند استخدام الخميرة كالنظام الغذائي وهذه علامات الفطرية مثل حمض اللينوليك (18:2ω6). حسن اختيار هو ما يسمى المزيج الشهرة، تتألف من 37 من الأحماض الدهنية المختلفة المتكررة في الحيوان، والفطريات وخلط المواد النباتية، واستر الميثيل حمض البكتيرية (بام) (انظر الجدول للمواد).
  4. لتشغيل هذه العينات على GC-FID، إعداد تسلسل مع البرمجيات الخاصة بكل منها للصك. للحصول على إرشادات، الرجوع إلى الدليل الخاص بالشركة المصنعة. ويبدأ التسلسل الخلائط الخارجية القياسية (مثل الشهرة ومزيج بامي)، تليها العينات. علما أن هناك تحولاً وقت استبقاء أي تأخير بسيط في وقت شطف من الأحماض الدهنية من العمود GC مع كل تشغيل أثناء تشغيل عينات! أما تضمين معيار كل 10th تشغيل في تسلسل نموذج أو استخدام الوقت الاحتفاظ تأمين لحمض النخليك (16:0).
  5. التكيف مع إعدادات GC تعتمد على الصك. ويقترح البرنامج التالي لعمود شعرية عالية أداء (HP) (25 م × 0.2 مم i.d., فيلم سمك 0.33 ميكرومتر. حقن تعيين وحدة التخزين إلى 1 ميليلتر في وضع سبليتلس واستخدام الهيدروجين كالغاز الناقل. توظيف بداية برنامج درجة حرارة على 50 درجة مئوية (عقد لمدة 1 دقيقة)، وزيادة من 25 درجة مئوية دقيقة-1 إلى 175 درجة مئوية، تليها 3 درجة مئوية دقيقة-1 إلى 230 درجة مئوية (عقد لمدة دقيقة 5.7).
  6. حساب الأحماض الدهنية نمول كل غرام وزن (الجاف) جديدة من الكائنات باستخدام الاستجابة التي حصلت عليها FID للشهرة كل تطبيق المبالغ المعروفة للأحماض الدهنية كل منها باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-2
    الشهرة: منطقة الذروة من شهرة كل منهما في العينة
    ميغاواطFM: الوزن الجزيئي لكل منهما وشهرة في ميكروغرام/µmol
    جهي: تركيز القياسية الداخلية في ميكروغرام
    هي: منطقة ذروة مستوى الداخلية
    مCol: الوزن (الجاف) جديدة لكل عينة Collembola في ز
    1000: معامل التحويل من µmol نمول
    جالأسلحة البيولوجية: تركيز كل منهما وشهرة في متوسط القيم الفارغة المقابلة في نمول

5-تحليل 13ج بالتنميط إيسوتوبولوجوي

  1. استخدام نظام GC مقترنة إلى الجماهيري انتقائية كاشف (MS) المتوفرة مع مصدر تاين (الصناعات الاستخراجية) إلكترون لتحديد إيسوتوبولوجوي.
    1. استخدام عمود شعري قطبية (مثلاً DB 23، 88 CP-سيل) كما يسمح هذا زيادة الفصل بين الأحماض الدهنية غير المشبعة حتى مع نفس أرقام سندات مزدوجة. اختيار العمود GC حاسم بالنسبة للنتائج كما أنه يحدد تمثيل جيد لايون الجزيء في الأحماض الدهنية.
    2. لعمود DB 23 (60 م × 0.25 مم الهوية، وفيلم سمك 0.15 ميكرون) وتبدأ درجة حرارة الفرن 130 درجة مئوية ونسبة 6.5 درجة مئوية/دقيقة إلى 170 درجة مئوية. اتبع مع زيادة قدرها 3 درجة مئوية/دقيقة إلى 203 درجة مئوية وعقد 1.9 دقيقة اتبع مع زيادة قدرها 40 درجة مئوية/دقيقة إلى 230 درجة مئوية، وعقد لنقل مجموعة 8.3 دقيقة خط درجة الحرارة إلى 280 درجة مئوية. مرة أخرى، قم بضبط الأسلوب GC للصك.
    3. استخدام المعايير الكمية تضم كميات معروفة من الشهرهشهره لجميع الأحماض الدهنية للتحقيق لإدراج 13ج. وضع هذه المعايير في بداية ونهاية كل تسلسل نموذج تشغيل. أن زمن الاحتفاظ بالأحماض الدهنية للفائدة من هذه المعايير.
    4. قياس عينات من التجارب دائماً بدءاً بالعينات غير مسمى، وتحقيقات المسمى بعد ذلك. تطبيق نسبة تقسيم مناسب لتركيزات عينة، مثلاً 1:12.5.If المتاحة للصك، تنطبق باكفلوش مع الهليوم بعد كل عينة تشغيل لإلغاء إيقاف عمود من تحليلها المتبقية.
    5. تطبيق وقت الاحتفاظ تأمين إلى الأسلوب GC-MS حيث أن اقتناء سيم لا يعاني من التحول، وهناك أوقات استبقاء أكثر استنساخه.
  2. تحديد تضمين 13ج أيون الجزيئية من الأحماض الدهنية قبل GC/الصناعات الاستخراجية-MS استخدام أيون المحدد مراقبة الوضع (SIM) من الصك. تشغيل في وضع سيم يسمح للكشف عن تحليلها محددة مع زيادة الحساسية بالنسبة إلى وضع التفحص الكامل.
    1. تشغيل المسح الضوئي عبر أولى أولاً لمعرفة ما هو هذا، ثم قم بتشغيل SIM على أيونات المناسبة. الحصول على البيانات في الجماهير الجزيئية للاهتمام بتحديد m/z مسح windows (مجموعات سيم) يشمل وقت الذروة الكروماتوغرافي الأحماض الدهنية الخاصة بكل منها. بشكل عام، رصد اثنين إلى أربعة أيونات كل إطار أكثر والوقت.
    2. وبغية زيادة الحساسية وضبط معدل المسح الشامل ويسكن مرات (الوقت الذي يقضيه تبحث في كل كتلة). يتم الحصول على أفضل جودة البيانات بأقل سرعة ممكنة، وعموما القاعدة في سيم مسح 8 إلى 12 خلال ذروة أكثر. وكيل لإعدادات أداة وقت يسكن متوسط كل كتلة ms 9، وقت دورة 6 s ووقت المسح الضوئي ل سيل 175 ms-1.
    3. الكشف عن أيون الجزيئية (م+) الأحماض الدهنية منها وجميع إيسوتوبولوجويس به (M+ 1، و M+ 2 ، وهكذا). للحصول على أمثلة، راجع نتائج الممثل.
    4. سجل الوفرة من كل جزء أيون (إيسوتوبولوجوي). علما أن وفرة أيون الجزيء وبه إيسوتوبولوجويس منخفض نسبيا ونوعية الكمي يعتمد إلى حد كبير على أداء نظام MS. تشغيل نغمة قبل بدء تسلسل عينة كبيرة (التجربة) وتنظيف المصدر أيون إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: أولاً، هذه البيانات العائد الإجمالي 13ج الفاسدون من كل الأحماض الدهنية بالسلائف المستهلكة (هنا 16:0).
    5. استخدام نسبة تركيبة النظائر المسمى الأحماض الدهنية من نظرائهم غير مميزة لتعيين تدفق الكربون التغذوية. استخدام الصيغة % ذرة في الخطوة 6، 1 لحساب النسبة المئوية للكربون المسمى (% ذرة، ذرة ٪) في الأحماض الدهنية الخاصة بكل منها. مقارنة النسبة المئوية ل 13ج في الأحماض الدهنية من Collembola بين المسمى (اليوم 1 والإصدارات الأحدث) والحيوانات غير مسمى (يوم 0) كمؤشر نسبي لتدفق 13ج من النظام الغذائي إلى المستهلك.
    6. تعيين موضع إدراج 13ج في سلسلة الأحماض الدهنية. على أساس التوزيع لتشابك إيسوتوبولوجويس التوجيه الغذائي للأحماض الدهنية الراسم ملحوظ كامل (هنا 16:0) من استطالة السلسلة بدهن الأيض. في حين يزيد الاستيعاب جزيء علامة كامل وفرة إيسوتوبولوجويس الأبعد لايون الأصل (م+)، مثلاً، M+ 15، م+ 16، مع استطالة السلسلة بالاستخدام 13ج المسمى C2 الأجزاء (13ج البيروفات) الحصول على إيسوتوبولوجويس القرب من أيون الجزيئية أكثر تواترا.

6-العمليات الحسابية لتخصيب 13ج

  1. وفقا لتوزيع إيسوتوبولوجويس، حساب النسبة المئوية الإجمالية للكربون المسمى (في ذرة ٪) في الأحماض الدهنية كل منها باستخدام العلاقة التالية: ذرة % = (نسبة 13ج إيسوتوبولوجوي أدرجت) x (التردد إيسوتوبولوجوي كل منهما)
    ويحسب هذا بعد كوباردت et al. 31 حسب:figure-protocol-3
    حيث N هو عدد ذرات الكربون في الأحماض الدهنية، ي عدد النظائر 13ج، م + J هو الوفرة من إيسوتوبولوجوي الخاصة بكل منها، و T إجمالي الوفرة من جميع إيسوتوبولوجويس.
  2. للحساب، جمع القيم منطقة الذروة لايون الجزيئية (م+) اتحاد كرة القدم في كل وجميع إيسوتوبولوجويس (M+ 1م+ 2وهكذا)، الكشف عنها بواسطة تحليل سيم--مرض التصلب العصبي المتعدد، وتعيين إلى الوفرة النسبية 100%. حساب الجزء من كل إيسوتوبولوجوي تم الكشف عنها بسهولة باتباع القاعدة من ثلاثة.
  3. طرح قيمة عنصر التحكم غير المسمى اليوم 0 (الخلفية الطبيعية 13ج) من القيم التجريبية للحصول على البيانات النهائية ترجع فقط إلى أداء خارجي 13ج-وضع العلامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

محتوى جديد الوزن والدهن من Collembola
أثناء التجربة وصف المحتوى الموجود في نلفاس وبلفاس لم تتغير كثيرا مع مرور الوقت، بينما وزن العينات الطازجة زيادة طفيفة ولكن ليس إلى حد كبير24. كلا المعلمتين تشير إلى مستوى جيد من اللياقة البدنية للعينات Collembola. كن على علم بالتحقيق محتوى ل Collembola الوزن والدهن الطازج طوال التجربة المقابلة لأيام أخذ العينات للأحماض الدهنية وتحليل النظائر. علما أن فقدان الوزن و/أو انخفاض محتوى الدهون خلال الفترة التجريبية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إيسوتوبولوجوي التنميط

تحليل مفصل للجوانب الكمية في توزيع 13ج في فاس يحتاج إلى التكنولوجيا المتطورة لتعيين الكربون التقسيم في الشبكات الغذائية. يعمل هذا العمل إيسوتوبولوجوي التنميط لتقييم ال 13ج/نسب12ج في المؤشرات الحيوية فا المشترك لتفاعلات طردية. هذا الأسلوب هو راسخة لتحليل الأحماض الأمينية اللوني السائل (ش-MS) وطبق لتحقيقات أيض الكربون في البكتيريا المسببة للمرض17،23. إلا في الآونة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

هو العرفان بدعم مالي من منزل ر. ول روس قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (RU780 رو/11-1). ومولت نهرينغ ر قبل رو 780/10-1. وأخيراً، نحن نشكر جداً الدكتور هازل روفيمبو مابوريك لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط لدينا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
neoLab-Round الجرارneoLab2-150669 × 40 مم ، 10 باك / عبوة
منشطة بالفحمCarl RothX865.1سنويا ، مسحوق ، CAS رقم 7440-44-0
المرمر لطب الأسنانR & Ouml ؛ HRICH-GIPSEhttp://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
الكلوروفورمكارل روث7331.1HPLC & GE; 99,9 ٪
الميثانولكارل روثP717.1HPLC & GE 99,9 ٪
HexanCarl Roth7339.1HPLC & ge ; 98 ٪
tert< / em> - بوتيل ميثيل الأثير (MTBE)كارلروثT175.1HPLC & GE ؛ 99,5 ٪
أسيتونكارل روث7328.2HPLC & 99,9 ٪
NaOHCarl Roth6771.1p.a. ≥ 99 ٪, في الكريات
di-NatriumhydrogenphosphatCarl RothP030.1p.a. & ge; 99 ٪ ، خال من
الماء ثنائي هيدروجين فوسفات ثنائي هيدروجين كارلروثT879.1سنويا & ge. 99٪
حمض هيبوكلوريك (6 نيوتن)VWR International26،115،000AVS TITRINORM vol. حل
Bond Elut (أعمدة)Agilent Tech.14102037HF Bond Elut-SI ، 500 مجم ، 3 مل ، 50 / PK
Prä ؛ paratenglä ser DuranGlasger ä tebau Ochs135215& Oslash ؛ 16 × 100 مم ، بالإضافة إلى غطاء لولبي مع مخدوش يدوي وحشية PTFE / سيليكون مدمجة
Supelco 37 Component FAME MixSigma-Aldrich47885-U Supelco10 & nbsp ؛ ملغم / مل في كلوريد الميثيلين ، معيار تحليلي
FlowMeshCarl Roth2796.1شبكة بولي بروبيلين ، بسمك 0.3 مم تقريبا ، مع تباعد خيوط 1 مم
مزيج حمض البكتيري ميثيل استر (BAME)Sigma-Aldrich47080-U Supelco10 & nbsp ؛ ملغ / مل في ميثيل كابروات ، المعيار التحليلي
الميثيل نوناديكانواتسيجما ألدريتش74208المعيار التحليلي & 98.0٪
حمض الهيكساديكانويك -1-13C (Palmitic)Larodan Fine Chemicals78-1600GC & 98.0٪ (13< / sup>C: 99.0٪)
RVC 2-25 CDplusMartin Christ Gefrier-trocknungsanlagenمكثف
ميدي مدمج على المنضدةألفا 2-4 LDplusمارتن كريست جيفرير-تروكنونغسانلاجنمشعب التجفيف
MZ 2C NTVacuubrand GMBHمضخة فراغ
روتو شيك جينيالصناعاتجهاز الجمع بين الاهتزاز والدوران
XP64 المقارنة الدقيقةMettler Toledoتوازن فائق الدقة
GC-System 7890AAgilent Tech.كروماتوجراف الغاز
7000 GC / MS ثلاثي رباعيAgilent Tech.مطياف الكتلة الثلاثي رباعي
7683B سلسلة حاقنAgilent Tech.حاقن عينة
Heraeus Multifuge 3SR+< / sup>مركزي علميمع دوار أنبوب 10 مل
--- العلمية جهاز طرد حراري

المراجع

  1. Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
  2. Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
  3. Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
  4. Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
  5. Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
  6. Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
  7. Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
  8. Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
  9. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
  10. Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
  11. Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
  12. Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
  13. Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
  14. Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
  15. Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
  16. Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059(2012).
  17. Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
  18. Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
  19. Garton, N. J., O'Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
  20. Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
  21. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
  22. Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
  23. Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
  24. Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
  25. Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
  26. Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
  27. Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
  28. ISO, I. O. fS. Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , ISO 11267:1999 (1999).
  29. Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
  30. Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
  31. Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
  32. Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
  33. Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
  34. Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
  35. Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنميط نظائر الأحماض الدهنيةتحليل تتبع الكربون-13مسارات استقلاب الدهونالمستهلكات من اللافقاريات التربويةاستخلاص الدهون المتعادلةالأحماض الدهنية للفوسفوليبيداترصد الأيونات المختارةتحليل الكروماتوغرافيا الغازيةكشف نمط نظائر الجزيئات
13ج الأحماض الدهنية إيسوتوبولوجوي التنميط يوفر نظرة ثاقبة نقل الكربون التغذوية والايض الدهني للمستهلكين اللافقاريات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.