مقالة منهجية

تجفف الدم والبقع المصل كأداة مفيدة لتخزين نموذج لتقييم المؤشرات الحيوية السرطان

10.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57113

⸱

يونيو 11, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومفيدة لتخزين الدم المحيطي والمصل/بلازما لتحليلات المصب مثل النوكليوتيدات واحدة تعدد الأشكال (SNP) تقييم وفحص إليزا.

الملخص

جودة عينة الدم أمر حاسم لضمان دقة التحاليل المصب مثل PCR الوقت الحقيقي أو أليسا. التخزين الصحيح للمواد البيولوجية هو نقطة الانطلاق لتحقيق النتائج استنساخه وموثوق بها. ينبغي أن يعامل جميع العينات بنفس الطريقة من جمع الدم للتخزين. اعتماداً على التحليلات التي يتعين القيام بها، يجب تخزين الدم كله وعينات المصل في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. وينبغي أيضا عينات مصل الدم/الكوتيد لتجنب ذوبان التجميد متعددة. مسألة هامة أخرى هي شروط عينة أثناء الشحن من معمل واحد إلى آخر. إذا لم يتوفر الثلج الجاف أو الشحنة وقتاً أطول من بضعة أيام، هناك حاجة النهج البديلة. خيار واحد استخدام ورق الترشيح لجمع الدم. هنا، فإننا نقترح أسلوب للدم وجمع عينة المصل الذي يستفيد من المجففة بقع الدم (DBS) والمجفف البقع المصل (DSS). قمنا بتطوير الإجراءات استخراج الحمض النووي من DBS لتقييم بعض النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) المتلقين للمعلومات بالوقت الحقيقي PCR. ونحن أيضا الأمثل مقايسة أليسا بدءاً من البروتينات التيد من مفاجآت. يمكن استخدام هذا الأسلوب مع أليسا فحوصات أو إجراءات تقييم البروتينات الأخرى.

المقدمة

والهدف الرئيسي للبحث في السرطان المؤشرات الحيوية هو تحديد البارامترات البيولوجية الجديدة التي يمكن استخدامها لتشخيص لتشخيص المريض التنبؤ لتحديد ما إذا كان مريض سوف تستجيب لعلاج محدد. هذا المجال البحوث الأساسية لاكتشاف علاجات السرطان مبتكرة ويلعب دوراً رئيسيا في العلاج مصممة خصيصا.

يجب أن تكون الإجراءات التي نفذت خلال كل خطوة وتحديد العلامات البيولوجية والتحقق من صحة موثوقة واستنساخه. هو حجر زاوية في نجاح البحوث متعدية التخزين الصحيح للعينات البيولوجية مثل الدم والمصل. هذه هي الخطوة الأولى نحو الحصول على جودة عالية من المواد البيولوجية التي يمكن استخدامها لإجراء تجارب البيولوجيا الجزيئية أو فحوصات البروتين.

دراسات متعددة المراكز غالباً ما يلزم لتجنيد ما يكفي من المرضى للحصول على بيانات قوية. ليست كل المعاهد قادرة على تخزين العينات في-80 درجة مئوية أو إرسال عينات إلى المراكز الدولية الأخرى في الثلج الجاف. استخدام ورق الترشيح لجمع الدم هو طريقة بسيطة لتخزين الدم والمصل ولا تتطلب التجميد الفوري لعينات1،2. يمكن رصدها قطره من الدم أو المصل على الورق، غادر إلى الجافة بين عشية وضحاها، وثم تخزينها لمدة تصل إلى 14 يوما في درجة حرارة الغرفة1،2. وهذا يعطي الباحثين الوقت لإرسال العينات إلى مختبرات أخرى. استخدام الدم المجفف البقع (DBS) والبقع المصل المجففة (DSS) وبالتالي يمكن تبسيط التعاون بين المعاهد في البلدان المتقدمة والنامية.

نظراً لسهولة استخدامه، أخذ العينات DBS يستخدم على نطاق واسع في عدة أنواع من الاختبارات المصلية أو الوراثية بتحليل المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، في الماضي، كثيرا ما كانت المستخدمة DBS لفيروس نقص المناعة البشرية الفرز في البلدان النامية1،2،3،،من45. وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب التخزين أنه يمكن جمع عينات دم من يحرك الإصبع، مما يمكن استعماله للأطفال حديثي الولادة فحص الاختبارات 6،،من78. العينة سهلة المناولة والنقل زيادة مزايا DBS، خاصة بالنسبة للعينات التي تم جمعها في المواقع النائية حيث لا يوجد أي معدات المختبرات. في منشور سابق، استخدمنا DBS والترصد لاختبار فيتامين (د) وفيتامين (د) البروتين (دبة) في سلسلة من المرضى والقوقاز وأفريقيا9. زملائنا الأفارقة لم تكن قادرة على الحصول على الثلج الجاف. لمقارنة العلامات البيولوجية لفهم الاختلافات في مسار فيتامين (د) بين اثنين من السكان العرقية، علينا مواصلة تحسين الإجراء باستخدام عينات المطابقة المخزنة تحت الظروف القياسية وعلى ورق الترشيح. بعد تحسين الإجراء DBS/DSS، كنا قادرين على تحليل دبة وفيتامين D في مصل المريض في كل الأفواج. ونحن أيضا تقييم عدد من النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) بعد استخراج الحمض النووي من الدم كله للقوقازيين ومن DBS للأفارقة9. ويسمح هذا البروتوكول عينات الدم عالية الجودة ليتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة دون التأثير على أنواع مختلفة من تحليلات المصب تتراوح بين البيولوجيا الجزيئية لفحوصات أليسا. من المستحسن استخدام إدارة المواد البيولوجية في دراسات متعددة المراكز أو المراكز التي لا تملك تسهيلات لظروف التخزين القياسية. ويمثل البروتوكول التالي تتويجا لهذه الإجراءات المحسنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الدم والمصل تم جمعها وتخزينها من المانحين صحي والمرضى الذين أعطوا الموافقة الخطية على المشاركة في الدراسة. وأقر البروتوكول دراسة "لجنة الأخلاقيات" المحلية وفقا للمعايير الأخلاقية المنصوص عليها في "إعلان هلسنكي" عام 1964.

1-الدم مخزن في DBS

  1. جمع عينات الدم
    1. جمع 3 مل عينة الدم المحيطي في أنبوب 3 مل مع 5.4 ملغ حمض الإيثيلين (يدتا).
      ملاحظة: تخزين الدم المحيطي ك DBS في أسرع وقت ممكن وضمن ح 8.
    2. كتابة رقم الشفرة المريض في الركن الأيمن السفلي من البطاقة التوقف.
    3. ريسوسبيند الدم مع ماصة 5 مل عناية.
  2. الدم شاهد على DBS
    1. "الماصة؛" ونقل بقعة واحدة من الدم (50 ميليلتر) على بطاقة التوقف (جدول المواد) مع تلميح 50 – 200 ميليلتر.
    2. كرر الخطوة 1.2.1. ليكون إجمالي من 3 – 5 بقع الدم. تجاهل هذه المعلومة القديمة وتأخذ واحد جديد لكل الدم الكوة.
    3. اترك DBS الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في وضع أفقي سطح ماصة غير مفتوحة، تجنب أشعة الشمس المباشرة. ترك غلاف البطاقة التوقف المفتوح لتسهيل تجفيف الدم.
      ملاحظة: لا يؤثر أي الجسيمات في الهواء أو الغبار خلال هذه الخطوة التجفيف التطبيقات المتلقين للمعلومات.
    4. تخزين على بطاقة في درجة حرارة الغرفة في كيس من بلاستيك مع ديسيككانت حتى الاستخدام.

2-استخراج الحمض النووي بدءاً من DBS وفقا لورقة البيانات أدوات استخراج الحمض النووي (قسم لبقع الدم المجفف)

  1. إعداد نموذج
    1. استخدم 3 بقع الدم المجفف من البطاقة. قص كل من بقع الدم المجفف من البطاقة وفصلها عن البطاقة بالملقط. قطع بقع الدم المجفف المنفصل إلى قطع صغيرة (قطرها حوالي 1 مم).
    2. وضع القطع الصغيرة في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
  2. الهضم عينة
    1. إضافة ميليلتر 180 تحلل المخزن المؤقت 1 المقدمة في الطقم (جدول المواد) إلى الأنبوبة. إضافة 20 ميليلتر من البروتيناز ك. لا تخلط تحلل المخزن المؤقت 1 مع ك بروتيناز قبل بيبيتينج في أنبوب 1.5 مل مع الدم رصدت بطاقة. مزيج من فورتيكسينج.
    2. ضع الأنبوبة في ثيرموينكوباتور واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إذا ثيرموينكوباتور غير مجهز بشاكر، دوامة العينة كل 10-15 دقيقة على الأقل 10 ق، مع الحرص على عدم السماح لإنقاص درجة حرارة العينة. باختصار الطرد المركزي هذه الأنابيب لإزالة قطرات من الغطاء.
  3. خطوة الغسيل
    1. إضافة 200 ميليلتر من تحلل العازلة 2 (جدول المواد) ودوامه لمدة 10 ق.
    2. ضع الأنابيب في ثيرموميكسير أو حاضنة المدارية ساخنة واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان ثيرموينكوباتور ليس مزودًا شاكر، دوامة عينات مرة واحدة على الأقل من 10 ق، مع الحرص على عدم السماح لإنقاص درجة حرارة العينات.
    3. كرر الخطوة 2.3.1. نقل ميليلتر 400 من ليساتي من أنبوب 1.5 مل شطف العمود (جدول المواد). الطرد المركزي العمود في 6,000 غ س ل 1 دقيقة.
    4. ضع شطف العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديد ونبذ القديم.
    5. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 (جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 غ س ل 1 دقيقة.
    6. ضع العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديد ونبذ القديم.
    7. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 (جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 غ س ل 1 دقيقة.
    8. ضع العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديد ونبذ القديم.
    9. الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 3 دقيقة حتى يجف الغشاء.
  4. خطوة شطف
    1. مكان العمود في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل جديدة وتجاهل أنبوب جمع.
    2. مكان 50 ميليلتر من الماء المقطر في وسط الغشاء. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي الأنبوب في 20,000 x ز 1 دقيقة جمع النذرة ووضعه مرة أخرى في مركز للغشاء.
    4. تجاهل أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 20,000 x ز 1 كحد أدنى للغشاء.
    5. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    6. تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي المستخرج من DBS لإجراء تحليلات عدة مثل SNP التقييم حسب تسلسلها PCR الوقت الحقيقي أو سانجر DNA.

3-مصل التخزين لإدارة السلامة والأمن

  1. جمع عينات الدم
    1. جمع 7 مل عينة الدم المحيطي في أنبوب مل 7 دون يدتا. ترك عينة الدم يتجمد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. كتابة رقم الشفرة المريض في الركن الأيمن السفلي من البطاقة التوقف.
    3. الطرد المركزي عينة الدم في 980 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تخزين المصل كمفاجآت في أسرع وقت ممكن وضمن ح 8.
    4. إزالة المادة طافية من الأنبوب وأنه نقل إلى أنبوب 15 مل جديدة بعناية. ريسوسبيند الدم مع ماصة 5 مل عناية.
  2. مصل الاكتشاف في مفاجآت صيف دبي
    1. "الماصة؛" ونقل بقعة واحدة من المصل (50 ميليلتر) على بطاقة التوقف. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 3 – 5 بقع الدم.
      ملاحظة: يكون حريصا جداً على "الماصة؛" بالضبط 50 ميليلتر من المصل في كل بقعة. لا يجب أن تتجاوز المصل من خط متقطع للبطاقة.
    2. ترك نظام الترصد الديموغرافي للمبيت جاف في درجة حرارة الغرفة. ترك غلاف البطاقة التوقف المفتوح لتسهيل تجفيف الدم.
    3. تخزين على بطاقة في درجة حرارة الغرفة في كيس من بلاستيك مع ديسيككانت حتى الاستخدام. إذا كان التخزين أكثر من 14 يوما، تخزين البطاقة عند-20 درجة مئوية.

4-أليسا المقايسة بدءاً من إدارة السلامة والأمن

  1. الوتي البروتين من مفاجآت.
    1. إذا لزم الأمر، تحسن من إدارة السلامة والأمن لكل عينة. قطع DSS إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم في القطر). وضع القطع في أنبوب 1.5 مل مع 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
    2. هز العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يهز لهم بكثافة منخفضة. وينبغي أن الرطب برنامج تلفزيوني لا غلاف الأنبوب أثناء الهز.
  2. استخدام النذرة البروتين كعينة مصل لتحليل عامل يفرز البروتين/النمو وفقا لتعليمات طقم أليسا، بعد تخفيف مناسبة.
    ملاحظة: يعمل هذا الإجراء أيضا ل الكشف عن دبة9. وقد يلزم لفحوصات أليسا الأخرى، خطوة الأمثل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ونحن استغل الإجراءات DBS والترصد لتخزين الدم والمصل في درجة حرارة الغرفة دون التأثير على نوعية المواد البيولوجية. ويبين الشكل 1 مثال التوقف بطاقة البروتين دون الدم وبعد جمع الدم. للتأكد من أن التخزين على ورق الترشيح والإجراءات الوتي الدم لا تتداخل مع نوعية العينة، أجرينا مقارنة مع أساليب التخزين القياسية. نحن استخراج الحمض النووي من عينات مطابقة 3 من الدم كله تجمع في أنبوب 2 مل أو تخزينها ك DBS، حسبما ورد في قسم البروتوكول. وجرى تحليل بطانات خمسة بالوقت الحقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويحقق هذا البروتوكول إمكانية تخزين الدم والمصل على ورق الترشيح عندما لا يكون المعامل على الموظفين أو الهياكل الأساسية اللازمة للتعامل الصحيح مع عينات الدم. على وجه الخصوص، كل الدم أو مصل الدم التي تم جمعها في أنابيب القياسية أو بوخز الإصبع يمكن تخزينها باستخدام هذا الأسلوب، وليس هناك حاجة تجميد عينات من-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية فورا بعد جمع الدم. DBS/مفاجآت يمكن أن تبقى في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 14 يوما دون أي تغيير في مصل الدم/سلامة. وهو مسألة حاسمة للتخزين وجود الرطوبة التي تؤثر على خصائص المواد البيولوجي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

شكر وتقدير

نود أن نشكر تيرني Gráinne للمساعدة التحريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بطاقات توفير البروتين Whatman 903 بطاقة توفير البروتين ، 100 / pk & lrm ؛سيجماZ761575مفيد لتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة لتحليلات المصب Falcon
Serological Pipettes ، 5 ملخلية جذعية# 38003
50-200 & نصائح LStar-LabS1120-8810
أنبوب طرد مركزي 1.5 ملEppendorf4036-3204
QIAamp DNA microkitQiagen56304هذه مجموعة استخراج الحمض النووي مصممة لعزل كميات صغيرة من الحمض النووي & nbsp ؛  
Buffer ATL (مدرج في مجموعة QIAamp DNA microkit)Qiagenتم الإبلاغ عن هذا على أنه Lysis Buffer 1 في النص
Buffer AL (مدرج في QIAamp DNA microkit)Qiagenتم الإبلاغ عن هذا على أنه Lysis Buffer 2 في النص
QIAamp mini elute columnQiagenالإبلاغ عن هذا كعمود في النص
AW1   (مضمنة في مجموعة QIAamp DNA المصغرة)Qiagenتم الإبلاغ عن هذا باسم Wash Buffer 1 في النص
AW2   (مضمنة في مجموعة QIAamp DNA المصغرة)Qiagenتم الإبلاغ عن هذا باسم Wash Buffer 2 في النص
البشري فيتامين د BP Quantikine ELISA KitR & أنظمة DDVDBP0
تم

المراجع

  1. Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
  2. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
  3. Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
  4. Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
  5. Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
  6. Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).
  7. Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
  8. Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
  9. Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
  10. Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
  11. Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
  12. Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
  13. St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710(2013).
  14. Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISA

مقالات ذات صلة