مقالة منهجية

ميكروديلوشن مرق في المختبر الفرز: طريقة سهلة وسريعة للكشف عن المركبات المضادة للفطور جديدة

DOI:

10.3791/57127

⸱

فبراير 14, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Department of Cellular Biology, Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Faculty of Ceilândia, University of Brasília

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسلوب ميكروديلوشن مرق سهلة وقابلة للتكيف لفحص المركبات المضادة للفطور ومقتطفات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الأمراض الفطرية شرط طبية هامة في العقود الماضية، ولكن عدد الأدوية المضادة للفطور المتاحة محدودة. في هذا السيناريو، من الضروري البحث عن الأدوية الجديدة المضادة للفطور. تفاصيل البروتوكول ذكرت هنا طريقة إلى الشاشة الببتيدات لخصائصها المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع بعض التعديلات لتناسب بحث الببتيدات المضادة للميكروبات كالأنواع الجديدة المحتملة. هذا البروتوكول وصف مقايسة وظيفية تقييم نشاط المركبات المضادة للفطور ويمكن تعديلها بسهولة لتناسب أي فئة خاصة من الجزيئات قيد التحقيق. منذ فحوصات تتم في لوحات 96-جيدا باستخدام كميات صغيرة، يمكن إكمال فرز على نطاق واسع في فترة قصيرة من الزمن، لا سيما إذا أجريت في بيئة التشغيل الآلي للمكاتب. يوضح هذا الإجراء كيفية مساعدة بروتوكول سريرية موحدة وقابلة للتعديل السعي إلى مقاعد البدلاء-عمل الجزيئات الجديدة لتحسين علاج الأمراض الفطرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمراض الفطرية وقد أصبحت شاغلا هاما طبية في العقود الأخيرة، قد ارتفعت إلى حد كبير يرجع ذلك أساسا إلى ارتفاع في عدد الأفراد المناعة مثل الذين يخضعون لعلاج السرطان، وأولئك الذين يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز أو زرع أجهزة1،2. ومع ذلك، مجموعة محدودة جداً من الأدوية المضادة للفطور المتاحة وتزايد عدد التقارير بشأن المقاومة الفطرية لهم تساهم المشاكل الرئيسية المتعلقة بالعلاجات الجهازية mycoses3.

هي مصدر محتمل للمركبات المضادة للفطور الجديدة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، الببتيدات الموجبة الصغيرة التي تنتجها العديد من الكائنات الحية كجزء من استجابتها المناعة الفطرية للإصابة4. ومع ذلك، أسلوب الفحص لاختبار هذه المركبات ضد مسببات الأمراض الفطرية ليست موحدة. وقد استخدمت إجراءات مختلفة لتقييم نشاط مضاد للمكاتب الإقليمية للمرأة، أحياناً لنفس نموذج الكائنات الدقيقة5،،من67. هذه الاختلافات وعدم التفصيل في بعض البروتوكولات تعقد مقارنات بين المركبات ويعوق إمكانية تكرار نتائج.

طريقة واحدة لتوحيد معايير اختبار المرشحين المخدرات الجدد اتباع المبادئ التوجيهية المستخدمة لتحديد قابلية المضادة للفطور في إعدادات السريرية، مثل السريرية والمبادئ التوجيهية معهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3. ومع ذلك، هذه الاختبارات حساسية الفطريات تقييدية للغاية، ولا تأخذ في الاعتبار التباين في الأيض عبر الأنواع، كما أنشئت فقط لعدد قليل من العوامل المختارة. على سبيل المثال، أنها لا تراعي احتياجات الأيضية للخمائر غير تخمر.

هذا البروتوكول يسمح تقييم نشاط مركبات المضادة للفطور المحتملين، وتنفذ هنا للبحث عن الببتيدات المضادة للفطور. ويستند على اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية كلسي M27-A3 مع التعديلات التي تحسين فحص المركبات الجديدة8،9. تسمح هذه التغييرات لاستخدام كميات صغيرة من المجمع، التغيرات في درجة الحرارة أو العدوى الأولية، ووسائل الإعلام المختلفة للنمو قبل الاختبار الأمثل، بينما توحيد النتائج مع استخدام الأنواع المرجعية كعناصر تحكم. هذا الأسلوب، مع استخدام لوحات الثقافة المتعددة جيدا، ويجعل من الممكن الشاشة بسرعة وبشكل موثوق عدد كبير من المركبات.

بسبب المرونة المتأصلة، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع فئات كيميائية مختلفة من المركبات وضد الكائنات الدقيقة الأخرى، مع بعض التعديلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الحلول ووسائل الإعلام

  1. إعداد 2 X روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 المتوسطة، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومرق سكر العنب سابورو أجار سابورو سكر العنب وفقا الجدول 1.

2. ظروف نمو العدوى الفطرية

  1. تخزين جميع السلالات الفطرية الأرصدة المجمدة في والغليسيرول 35% في-80 درجة مئوية، حتى المطلوبة.
  2. قم بالخطوات التالية قبل كل تجربة.
    1. لسلالات المبيضات البيض :
      1. ذوبان الجليد قنينة أسهم ونقل 200 ميكروليتر إلى 10 مل مرق سكر العنب سابورو في أنبوب البولي بروبلين عقيمة 50 مل بغطاء والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع إثارة الشغب (200 لفة في الدقيقة). تذكر أن انحدر الأنبوب وترك الغطاء مفتوحاً قليلاً لتهوية أفضل للثقافة.
    2. لسلالات المرسلة بين :
      1. كشط سطح قنينة الأرصدة المجمدة. لوحة الخلايا على لوحات أجار سكر العنب سابورو واحتضانها ح 48 في 30 درجة مئوية. بعد تظهر نمو المستعمرات المعزولة، تبقى اللوحات في الثلاجة (4 درجات مئوية) مختومة مع الفيلم البارافين لمدة تصل إلى 15 يوما.
      2. جمع مستعمرة معزولة متوسطة الحجم من لوحة باستخدام مسواك عقيم أو عقيمة حلقة تطعيم وتلقيح 10 مل مرق سكر العنب سابورو في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل. احتضانها لقرابة 24 ساعة في 30 درجة مئوية تحت التحريض (200 لفة في الدقيقة).
      3. لا تتجاوز في الحضانة ح 24. تذكر أن انحدر الأنبوب وترك الغطاء مفتوحاً قليلاً لتهوية أفضل. أنها دائماً جيدة لتوحيد مرحلة نمو الخلايا قبل كل اختبار، لأن هذا عامل هام يؤثر على مقاومة مضادات الميكروبات.
        ملاحظة: كانت تزرع كل الفطريات عند 30 درجة مئوية للنشر السريع في تجاربنا، ولكن يمكن تغيير درجة الحرارة تعكس أهداف الدراسة، والعلاج السريري على سبيل المثال (37 درجة مئوية). الأهم من ذلك، ينبغي إنشاء مسبقاً لكل عزل الفطريات هذه المرة الأولى حضانة واستمر طوال كافة الاختبارات للتأكد من إمكانية تكرار نتائج.
  3. بعد نمو الفطريات، جمع الخلايا من سينتريفوجينج الأنابيب المخروطية في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. ريسوسبيند الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تكرار الغسيل برنامج تلفزيوني والطرد المركزي أكثر من مرتين. بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند الخلايا في 5 مل (وفقا لحجم بيليه) 2 X ربمي-1640 متوسطة.
  6. إعداد 1 مل إضعاف 1: 100 أو 1:1,000 في أنبوب ميكروسينتريفوجي (اعتماداً على التعكر تعليق الخلية).
  7. وضعه في دائرة هيموسيتوميتير الكوة ميليلتر 10 من هذا التخفيف، وحساب إجمالي عدد الخلايا في الأرباع الأربعة الزاوية تحت المجهر. حساب التركيز بالصيغة: (مجموع عدد الخلايا/4) × إضعاف عامل x 104 (دائرة تمييع ثابتة).
    1. النظر صلاحية 100% إذا كانت شروط صلاحية التهم والنمو قد تم يرتبط بشكل منهجي لعزل تجري دراستها.
      ملاحظة: توحيد ومراقبة الجودة من صلاحية التهم يمكن أن يتم بالطلاء مرة أخرى وفقا "اللجنة الأوروبية" لاختبار حساسية الميكروبات (يوكاست) طريقة تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) مضاد للخمائر10 .
    2. إذا لم تم تأسيس ارتباط النمو/البقاء لعزل قيد الدراسة، قياس جدوى الفطرية التي عد الخلايا الحية في هيموسيتوميتير مع معونة الأصباغ التي اللون بشكل انتقائي الخلايا الميتة، مثل فلوكسيني ب11، تريبان الأزرق 12، أو جانوس الخضراء13. تستخدم الخلايا الفطرية لهذا البروتوكول إلا إذا كان بقاء السكان في هذه المرحلة هو 90% أو أعلى.
      ملاحظة: قد لا تعمل الأصباغ الميت/حيا جيدا مع الفطريات الاختيار. يرجى اختبارها قبل الاستخدام. على سبيل المثال، صبغ تريبان الأزرق لا يعمل جيدا مع جيم-المرسلة.
  8. وبعد ذلك إعداد تعليق خلية في 2 X ربمي-1640 المتوسطة (2 X ضبط العدوى في المتوسط RPMI 1640). 96-جيدا لوحات النظر حجم 5 مل لكل لوحة.
    1. لجميع سلالات المبيضة ، وإعداد تعليق خلية أسهم 4 × 103 خلايا/مل. وهذا التركيز هو 2 X تركيز الخلية النهائية في كل بئر (2 × 103 خلايا/مل).
    2. لسلالات المرسلة جيم ، إعداد ثقافة أسهم من الخلايا 2 × 104 خلايا/مل. وهذا التركيز هو تركيز الخلية النهائي مرتين في كل بئر (1 × 104 خلايا/مل).
    3. للفطريات الأخرى، اختبار مع مضاد معروفة التي تركز سيكون مثاليا للدراسة خاصة فيما يتعلق بفترة الحضانة. مراعاة الوقت الأيض والازدواجية من الفطريات.

3-الببتيدات (عامل غير معروف)

  1. تخزين الببتيدات المجففة بالتبريد في-20 درجة مئوية، وحل لهم في المياه قبل كل تجربة. الوقت الأقصى للتخزين مرة المذابة في الماء سيتوقف على طبيعة كل الببتيد.
  2. تحضير مختبرين لمرتين أعلى تركيز النهائي اختباره في المقايسة (2 X). ومن الناحية المثالية، إعداد عدد صغير من مختبرين مع الببتيد كافية للاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد أذاب دورات.
    ملاحظة: اختيار التركيز ينبغي أن تستند المؤلفات وخصائص الببتيد. من المستحسن لبدء تخفيف المسلسل مع حوالي 100 ميكرون من الببتيد، وثم إنقاص أو زيادة نطاق تركيز هذا اعتماداً على النتائج التي يتم الحصول عليها.

4-إشارة انتيفونغلس (عناصر إيجابية)

  1. لتلك التي تضعف في المياه: تعد حلاً X 2 لأعلى تركيز للتحليل (انظر الفرع 5: "مقايسة مضاد" لتمييع الخطوات).
    1. لسلالات المبيضة ، تعد حلاً 128 ميكروغرام/مل من الفلوكونازول أو 128 ميكروغرام/مل من كاسبوفونجين. وسيكون تركيز لوحة على حد سواء 64 ميكروغرام/مل.
    2. لسلالات المرسلة جيم ، تعد حلاً 32 ميكروغرام/مل من الامفوتريسين ب (الحل للذوبان في الماء). وسيكون تركيز لوحة 16 ميكروغرام/مل.
      ملاحظة: عادة الامفوتريسين B هو المخفف في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، نظراً لهذا المضادة للفطريات ضعيف قابل للذوبان في الماء. ومع ذلك، هناك استعدادات للذوبان في الماء الامفوتريسين بالمتاحه تجارياً.
  2. للأنواع التي تضعف في مذيب عضوي: إعداد 100 × الحل الأسهم في [دمس]، ثم تمييع إلى 10 X في المياه للاستخدام.
    ملاحظة: وهكذا في البئر، التركيز [دمس] النهائية لن تتجاوز 1%. مطلوب جيدا حيث سوف تنمو الفطريات في الوسائط التي تحتوي على 1% [دمس] كعنصر التحكم نظراً لأن بعض الفطريات لا تسمح أيضا تركيز هذا المذيب. تذكر أن [دمس] حساس، حتى تغطي اللوحة بإحباط أو وضعه في غرفة مظلمة لمدة فترة الحضانة.

5-مضاد الإنزيم

ملاحظة: تجري في المختبر فحوصات مضاد استناداً إلى اختبار قابلية مرق ميكروديلوشن من المبادئ التوجيهية السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) M27-A3 مع إدخال بعض التعديلات عليها.

  1. إعداد إضعاف مسلسل شقين كل الببتيد والتحكم مضاد في البوليسترين 96-بئر ميكروبلاتيس إلى وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر.
    1. استخدام ماصة إضافة 100 ميليلتر من مضاد/الببتيد في تركيز X 2 أعلى المطلوب التركيز النهائي في الأعمدة 1-3، في صف أ
    2. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من الماء المعقم في الآبار الأخرى، في صفوف ب إلى ه.
    3. إزالة 50 ميليلتر من الآبار مع أعلى تركيز (صف أ) ونقل إلى التالي جيدا لتركيز القادم (صف ب) وتجانسه.
    4. كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى البئر مع أدنى تركيز وتجاهل 50 ميليلتر من هذا البئر (صف ح). ترك الأعمدة 11 و 12 (صفوف أ، ب، ج) مع الماء فقط لعنصر التحكم فارغاً أو مراقبة سلبية/النمو.
    5. إضافة 50 ميليلتر من 2 × العدوى المعدل في المتوسط RPMI 1640 لكل بئر (أعمدة 1-3 بالإضافة إلى العمود 11 (مكافحة السلبية/نمو))؛ وسيكون التركيز النهائي المبيضة 2 × 103 خلايا/مل، وتركيز النهائي لسلالات المرسلة جيم- سيكون 104 خلايا/مل.
    6. إعداد عناصر التحكم فارغة (50 ميليلتر ماء + 50 ميليلتر 2 X ربمي-1640 المتوسطة دون الخلايا) والمراقبة السلبية/النمو (50 ميليلتر ماء + 50 ميليلتر ضبط العدوى 2 X ربمي-1640 المتوسطة دون مضاد)، وتحميل إلى لوحة جيدا كما هو موضح أعلاه.
  2. كرر الإجراء لكل مجمع اختبار ومراقبة الأدوية المضادة للفطور المختار (الأعمدة 4-10).
    ملاحظة: يمكن القيام به تخفيف المسلسل عمودياً كالتجربة أدناه، أو أفقياً في اللوحة (أي، إذا كان العدد تخفيف الاستخراج/المجمع معين يحتاج إلى اختبار ثمانية أو أكثر).
    1. إذا كان يشير إلى أن المركبات، المخدرات، أو أي من مكوناته حساس، والقيام التحليل في ضوء انخفاض، تغطي اللوحات مع إحباط، أو وضع في غرفة مظلمة أثناء إينكوباتيونس.
  3. النظر في التوصيات التالية اختيارية.
    1. ختم اللوحة مع لوحة غطاء واضحة تسمح بتبادل الغازات، كما يساعد هذا على تقليل التبخر.
    2. ضع اللوحة في غرفة رطبة؛ كما أنه سيساعد على تقليل التبخر.
  4. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة أو 48 ساعة لجميع سلالات المبيضة ، وعن ح 48 مع 200 لفة في الدقيقة تهتز جيم-المرسلة. انخفاض حجم النهائي (100 ميليلتر) يضمن عدم حدوث لا تسرب.
    ملاحظة: لوحظ لا يوجد فرق كبير بين القراءات هيئة التصنيع العسكري في ح 24 و 48 ساعة لسلالات المبيضة . ومع ذلك، قراءات في 48 ساعة أسهل لتصور.
  5. مراقبة جميع الآبار، مستعينة المجهر الضوئي مقلوب، قبل فترة الحضانة وبعد التحقق من التغييرات في التشكل، وكذلك فيما يتعلق بالتحقق من علامات التلوث.
    ملاحظة: يمكن القيام به بصريا قراءات وتصويرها في نهاية التجربة. قبل كل قراءة، مجانسة قليلاً اللوحة. يقرأ أيضا يمكن أن يؤديها إلى قياس في التطوير التنظيمي في 600 نانومتر، إذا كانت الخلية كتل أو فيلامينتيشن لا تحترم.
  6. إجراء التجارب على الأقل ثلاث مرات في مواعيد منفصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعريف هيئة التصنيع العسكري كأدنى تركيز مركب مضادات الميكروبات التي تثبط نمو الفطريات مرئية في نهاية فترة الحضانة تماما. نظراً للهدف من هذا البروتوكول أن يكون وسيلة سريعة للأنواع المحتملة الشاشة، أي جيدا مع وسائل الإعلام واضحة مماثلة إلى الآبار فارغة يعتبر نتيجة إيجابية، بينما أي جيدا مع تعكر شبيهة بابار المراقبة السلبية/النمو تعتبر سلبية. ومع ذلك، إذا لم يكن هناك مصلحة في معرفة ما إذا كانت أمبير معين فونجيستاتيك أو فطريات، وسائط الإعلام من الآبار الإيجابية يمكن أيضا مطلي على "أجار ساب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبارات ميكروديلوشن يمكن تحليل النشاط المضادة للفطور المحتملة من مجمع باستخدام كميات صغيرة من المجمع المستهدف، وفي نفس الوقت باختباره في طائفة من التركيزات. وبناء على ذلك، يوصي بهذا البروتوكول كخطوة أولى في الفحص للمركبات المضادة للفطور الجديدة المحتملة. البروتوكول المعروضة هنا يستند إلى بروتوكول M27-A3، في البداية مصمم للمساعدة في اختيار المعالجة بمضادات الفطور في العيادات، ويمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من المركبات المضادة للفطور الجديدة. عموما، يمكن أن يركز هذا البروتوكول على الخصائص الفيزيائية للاستخراج أو مركب. على س...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الرؤوس-البرازيل، CNPq-البرازيل، يندرج/مدافع للدعم المالي. ونحن ممتنون "الدكتور هوغو كوستا آيس" لتنقيح هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > الوسائط والكواشف < / قوي >
RPMI 1640 متوسط مع L-الجلوتامين ، بدون بيكربونات الصوديومThermo Fisher31800-022
3- (N< / em>-morpholino) حمض البروبان السلفونيك (MOPS) (o que a gente usa tem um s & oacute; dio, completa o nome dele من فضلك)< / em>Sigma-Aldrichاستخدم للتخزين المؤقت 2X RPMI متوسط
كلوريد الصوديوم (NaCl)Din & acirc ؛ الميكا1528-1137 ملي مولار للمحلول الملحي المخزنة بالفوسفات (PBS)
كلوريد البوتاسيوم (KCl)جي تي بيكر3040-012.7 ملي مولار للمحلول الملحي الممخزن بالفوسفات (PBS)
ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (Na2HPO4)سيجما ألدريتشV00012910 ملي مولار للمحلول الملحي المخزنة بالفوسفات (PBS)
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4)سيجما ألدريتش602302 ملي مولار للمحلول الملحي الممخزن بالفوسفات (PBS)
BD Difco Sabouraud مرق سكر العنبBD238230
BD Difco Sabouraud Dextrose AgarBD210950
GlycerolSigma-AldrichV00012335٪ ل (solu & ccedil; ã يا دي استوك؟ Criopreservaç ã س؟)
المياهPara dilui & ccedil; ã o das drogas na diluiç ã س سيريادا
<قوية >الأدوية المضادة للفطريات< / قوي>
الأمفوتريسين بسيجما ألدريتشA2942
فلوكونازولسيجما ألدريتشF8929
كاسبوفونجينسيجما ألدريتشPHR1160
<قوي>بلاستيك< قوي>
50 مل أنبوبمخروطيSarstedt62.547.254
طبق بتريJ.Prolab0304-5
96 لوحة بئرCorning3595
خزان محلول معقمKASVIK30-208استخدم لنقل الحلول باستخدام ماصة
متعددة القنوات <قوية > ومعدات أخرى < / قوية >
مجهر بصرينيكونE200MV
الطرد المركزيالحرارية فيشرMegaFuge 16R
حاضنةEthik Technology403-3Dضبط على 37 درجة ؛ C
شاكرنيو برونزويك ScientificExcella E25ضبط على 37 درجة ؛ C، غرفة عد الخلايا 200 دورة
في الدقيقة، NeubauerBOECO ألمانياBOE 13
ماصة متعددة القنواتHTL5123
المعقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
  2. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
  3. Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
  4. Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
  5. Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217(2008).
  6. Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
  7. Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
  8. CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
  9. Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844(2016).
  10. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
  11. Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
  12. Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
  13. Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
  14. Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
  15. Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
  16. Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
  17. Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
  18. Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
  19. Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CLSI M27 A3 96

مقالات ذات صلة