مقالة منهجية

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DOI:

10.3791/57146

⸱

أبريل 30, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واستخدمت مؤخرا الزرد كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي أثناء التطوير. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام الأجنة الزرد إلى توقيت النسخ المتماثل الشخصية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لدراسة توقيت النسخ المتماثل في طفرات وأنواع الخلايا الفردية ونماذج الأمراض والأنواع الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توقيت تكرار الحمض النووي سمة هامة خلوية، نستعرض علاقات هامة مع هيكل الكروماتين، والنسخ، ومعدلات الطفرة في الحمض النووي. تحدث التغييرات في توقيت النسخ المتماثل أثناء التطوير والسرطان، ولكن توقيت النسخ المتماثل دور يؤديه في التنمية والمرض غير معروف. الزرد أنشئت مؤخرا كنظام نموذجي في فيفو لدراسة توقيت النسخ المتماثل. وإليك تفاصيل البروتوكولات لاستخدام في الزرد لتحديد توقيت تكرار الحمض النووي. وبعد فرز الخلايا من الأجنة والبالغين الزرد، يمكن بناؤها على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها النقوش ذات الدقة العالية بتحديد التغيرات في عدد نسخ الحمض النووي من خلال تحليل البيانات تسلسل الجيل القادم. يتيح هذا النظام النموذجي الزرد لتقييم توقيت النسخ المتماثل للتغييرات التي تحدث في المجراة في التنمية، ويمكن أيضا استخدامها لتقييم التغيرات في أنواع الخلايا الفردية أو نماذج المرض أو خطوط المسخ. هذه الأساليب سيمكن دراسات التحقيق في آليات ومحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وصيانة خلال التنمية، وتوقيت النسخ المتماثل لدور تلعبه في الطفرات وتوموريجينيسيس، وآثار مقاومة توقيت النسخ المتماثل في التنمية والمرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للخلايا لتقسيم بنجاح، يجب أن أولاً بدقة وإخلاص النسخ المتماثل الجينوم أكمله. حدوث ازدواج الجينوم في نمط استنساخه، المعروفة باسم ال DNA النسخ المتماثل توقيت البرنامج1. ويرتبط توقيت تكرار الحمض النووي مع منظمة الكروماتين وعلامات جينية والتعبير الجيني2،3. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل تحدث في جميع أنحاء التنمية، والبرامج ذات الصلة إلى حد كبير إلى النسخي والتعديلات لعلامات الكروماتين وتنظيم4،5. وعلاوة على ذلك، يرتبط توقيت النسخ المتماثل مع الترددات حيث، وهي تلاحظ تغييرات في توقيت في أنواع مختلفة من السرطان6،،من78. وعلى الرغم من هذه الملاحظات، الآليات والمحددات للنسخ المتماثل لتوقيت إنشاء وتنظيم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، والدور الذي تؤديه في التنمية ومرض غير محدد. وباﻹضافة إلى ذلك، حتى مؤخرا في النسخ المتماثل على نطاق الجينوم توقيت التغييرات التي تحدث في جميع أنحاء تطوير الفقارية فقط بحثت في نماذج الثقافة الخلية.

الزرد، دانيو rerio، مناسبة تماما لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو أثناء التطوير، كما يمكن أن تسفر عن زوج التزاوج واحد من مئات أجنة التي تتطور سريعاً مع العديد من أوجه التشابه إلى التنمية الثدييات9، 10. وعلاوة على ذلك، في جميع أنحاء تطوير الزرد، هناك تغييرات في دورة الخلية، تنظيم الكروماتين والنسخي البرامج التي تشترك في علاقات مع الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها11. الزرد أيضا نموذج وراثية ممتازة، كما هم خاصة قابلة للتلاعب من قبل ترانسجينيسيس، والطفرات والتحولات المستهدفة، والشاشات الوراثية حددت العديد من الجينات المطلوبة لتطوير الفقارية12. ولذلك، يمكن استخدام الزرد لتحديد الجينات المشاركة في النسخ المتماثل توقيت إنشاء وصيانة ومراقبة آثار رفع الضوابط عن توقيت النسخ المتماثل في التنمية الفقاريات. يمكن أيضا استخدام خطوط محوره وراثيا لتقييم توقيت النسخ المتماثل من أنواع الخلايا الفردية المعزولة في تيميبوينتس التنموية المختلفة، أو في ظروف المرض. الأهم من ذلك، هناك نماذج مختلفة من الزرد من الأمراض البشرية التي يمكن استخدامها للتحقيق في دور النسخ المتماثل توقيتها في المرض تشكيل وتطور9،،من1314.

في الآونة الأخيرة، تم إنشاؤها الملامح توقيت النسخ المتماثل الأولى من الزرد، تجعله كنظام نموذجي لدراسة النسخ المتماثل توقيتها في فيفو15. لتحقيق هذا الهدف، تم جمع الخلايا من الأجنة الزرد في مراحل متعددة من التنمية، وفي نوع خلية عزلها من الزرد الكبار. ثم تم فرز الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز) استناداً إلى محتوى الحمض النووي لعزل السكان المرحلة G1 و S. استخدام نموذج G1 كعنصر تحكم عدد نسخ، نسخ عدد الاختلافات في مرحلة ثانية السكان كانت مصممة وتستخدم للاستدلال على النسخ المتماثل النسبي توقيت16. التغييرات في توقيت النسخ المتماثل يمكن مقارنتها مباشرة ثم بين نماذج إنمائية مختلفة وأنواع الخلايا، وكان يستخدم هذا لتحديد التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تحدث في فيفو طوال إعداد الفقاريات. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الأخرى الأساليب الجينومية، أساسا أنه يتطلب وضع العلامات مع النظير thymidine أو إيمونوبريسيبيتيشن للحمض النووي4،6.

هنا مفصلة على الشخصية على نطاق الجينوم الحمض النووي النسخ المتماثل توقيتها في البروتوكولات عالية الدقة في الزرد. استخدمت هذه البروتوكولات لتحديد العلاقات مع ميزات الجينوم وجينيه في الجينوم الزرد، فضلا عن تحديد ملامح التغييرات في هذه العلاقات التي تحدث في جميع أنحاء التنمية. هي أيضا بسهولة تكييف هذه البروتوكولات لدراسة التغيرات في توقيت النسخ المتماثل في سلالات متحولة من الزرد ونماذج المرض. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الأساليب أساسا التي يمكن توسيعها عند دراسة توقيت النسخ المتماثل في أنواع محددة من الخلايا، بفرز أول أنواع خلايا فردية من الزرد. يمكن أن تكون الزرد ممتازة في فيفو نموذج نظام لدراسة توقيت النسخ المتماثل وتكشف الوظائف البيولوجية لهذا سمة جينية هامة في نهاية المطاف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كل الحيوانات عولجت يتفق بشكل صارم مع بروتوكولات وافق أوكلاهوما البحوث الأساس المؤسسي الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة.

1. إعداد الزرد الكبار لتربية

  1. استخدام مجموعة كبيرة من الزرد البالغين الذكور والإناث من سلالة واحدة لتربية. هناك اختلافات صغيرة في التركيب الوراثي الزرد حتى سلالة واحدة، واستخدام مجموعة كبيرة لضمان النتائج تمثيلاً للتنوع الجيني للسكان، ولا تقتصر على مجموعة فرعية صغيرة من السكان.
  2. في الليلة السابقة سيتم جمع الأجنة، وضع عشرات من تربية الكبار في تربية الدبابات، استخدم أعدادا متساوية تقريبا من الذكور والإناث. اعتماداً على التجربة، استخدام إحدى استراتيجيات تربية التالية.
    1. تربية استراتيجية 1: ضع الزرد عدد قليل من الذكور والإناث في خزانات تربية الفرد، وفصل الذكور عن الإناث مع مقسم. إذا تم استخدام هذا النهج، إعداد العديد من الدبابات تربية مختلفة وتجميع الأجنة من كل منهما لضمان التنوع البيولوجي هو الممثل للسكان.
    2. تربية الاستراتيجية 2: تجمع العشرات من الزرد الذكور والإناث في خزان لتربية كبيرة. تستخدم هذه الاستراتيجية ما دام هناك عدد كبير بما فيه الكفاية للأجنة، فمن المعقول أن نفترض أنها جاءت من مجموعة متنوعة من المؤسسين وهم ولذلك وراثيا تمثيلية للسكان.

2-توقيت ماتينجس-جمع وفرز والإسكان أجنة الزرد للتجارب

  1. أداء ماتينجس موقوت، ابتداء من أقرب دورات الضوء في الصباح. تجاهل أي الأجنة التي تولد بين عشية وضحاها.
  2. تسمح الأسماك تتوالد في المياه الضحلة (3-5 سم) لمدة 10 دقائق، مع قاع كاذبة للأجنة للهروب من خلال.
  3. بعد 10 دقيقة، جمع الأجنة التي تتدفق من خلال مصفاة والشطف في صفيحة 10 سم مع زجاجة غسيل. تجمع جميع الأجنة التي يتم جمعها في نفس الوقت نقطة، وضع علامة عليها مع مرور الوقت لجمع، والمكان فورا في حاضنة في 28.5 درجة مئوية.
  4. يمكن توقع مئات أجنة من زوج التزاوج واحد في يوم واحد. السماح للكبار إلى تولد في 10 دقيقة دورات حتى عدد الأجنة التي تم الحصول عليها أقل من عشرين.
  5. حوالي 1-1.5 ح بعد جمع وفرز الأجنة لإزالة أجنة ميتة والمخصبة. لفرز الأجنة، إزالة من الحاضنة ومراقبة تحت مجهر تشريح.
    1. مكان في كثافة الأجنة 100 كل لوح 10 سم وعدد الأجنة.
    2. إضافة جديدة E3 المتوسطة (مم كلوريد الصوديوم، 0.17 مم بوكل، 0.33 مم كاكل2، 0.33 مم MgSO4من 5) وإرجاع الأجنة للحاضنة 28.5 درجة مئوية.

3-ديتشوريوناتي، ديلك، وإصلاح الأجنة الزرد

ملاحظة: تم تصميم هذا الجزء من البروتوكول للأجنة قبل 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf). ليس هناك حاجة لإزالة تشوريونس الأجنة في مراحل لاحقة من التنمية (بعد 48 هبف)، كما أنها بطبيعة الحال كثيرا ما تسقط. ليست هناك حاجة ديلك أو إزالة تشوريونس في الأسماك الأكبر سنا بعد 5 أيام الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية).

  1. عند الأجنة الذين يبلغون سن الإنمائية المرجوة، تحقق من المرحلة المناسبة للتنمية شكلياً تحت مجهر خفيفة وفقا "مراحل التنمية الجنينية من الزرد"17.
  2. نقل الأجنة نظموا يصل إلى 1500 إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتغسل عدة مرات مع E3.
    1. إضافة 1 مل E3 و 20 ميليلتر من حل برنس (30 ملغ/مل) لكل 100 الأجنة ودوامه بلطف. ما يصل إلى 1500 الأجنة يمكن أن تكون ديتشوريوناتيد في أنبوب واحد مع 15 مل E3.
    2. وضع أنبوب على جانبها وترتيب الأجنة في طبقة حتى لضمان أقصى السطح إلى نسبة الحجم. بلطف تحرض أنبوب انخفضت كل 2-3 دقيقة حتى تشوريونس جميع الخروج من الأجنة. الوقت الإجمالي ديتشوريونيشن ستختلف تبعاً للنشاط برنس.
  3. إزالة المادة طافية وشطف الأجنة 3 مرات مع 10 مل E3 بلطف. وضع الأجنة على الجليد لما تبقى من هذا الفرع من البروتوكول.
  4. إزالة E3 وتغسل الأجنة مع المخزن المؤقت دييولكينج المثلج الطازجة (0.5 × الحل "غينزبورغ الأسماك المسابقة"، دون الكالسيوم: 55 مم كلوريد الصوديوم، 1.8 مم بوكل، 1.25 مم ناكو3).
    1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت دييولكينج المثلج لاجنة تصل إلى 500.
    2. استخدام P1000، بلطف "الماصة؛" الأجنة صعودا وهبوطاً 5-10 مرات لعرقلة كيس الصفار.
    3. نقل مل 1 إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 500 x ز لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة بيليه طاف ويغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج (الفوسفات مخزنة المالحة، درجة الحموضة 7.0) إزالة الحل للمسابقة. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و g x 500 لمدة 5 دقائق.
  6. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. ضع الأنبوبة في الجليد.
  7. أضف 3 مل إيثانول المثلج (EtOH) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أنبوب دوامة من EtOH برفق على إعداد منخفض.
    1. استخدام P1000، ببطء (قطره 1 في الثانية الواحدة) بالتنقيط الزرد الجنين خلية تعليق في EtOH أثناء فورتيكسينج برفق.
    2. إضافة إجمالي 1 مل من تعليق خلية الجنين، لحل تثبيت نهائي 75% EtOH.
  8. بعد 1 مل خلية تعليق المضاف، بلطف أنبوب دوامة لخلط ووضع في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1. من المستحسن وضع الأنابيب إلى جانبهم لضمان أقصى السطح إلى نسبة الحجم وتقليل عدد الأجنة والخلايا التي تلتصق ببعضها البعض. تخزين خلايا الأجنة في-20 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

4-تلطيخ الحمض النووي ونظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الأجنة

ملاحظة: تم تصميم هذا الجزء من البروتوكول للأجنة في 1 إدارة الشرطة الاتحادية.

  1. إزالة خلايا الأجنة ثابتة EtOH من-20 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في ز 1500 x 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. ضع الأنبوبة في الجليد وإزالة المادة طافية بعناية. برفق باستخدام P1000، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل BSA برنامج تلفزيوني الباردة الطازجة (1 x PBS، ألبومين المصل البقري 1%).
    2. الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجة مئوية و 1500 غ س لمدة 5 دقائق ثم ضع على الجليد.
  2. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في يوديد propidium (PI) تلطيخ الحل (50 ميكروغرام/مل PI، 100 ميكروغرام/مل رناسي A، PBS، درجة الحموضة 7.0)، استخدام 200 ميليلتر لكل 1000 الأجنة.
    1. السماح للخلايا لاحتضان في حل بي مدة 30 دقيقة على الجليد، والاختلاط بلطف كل 5 دقائق.
    2. ضع مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية على الجليد. بلطف "الماصة؛" الخلايا لخلط وتصفيتها من خلال الشبكة.
      ملاحظة: إذا تم جمع أنابيب متعددة الأجنة من تيميبوينت نفسه في المادة 3 من البروتوكول، الجمع بين هذه الأجنة في هذه المرحلة حيث يتم فرزها جميعا معا.
    3. استخدام الشقة داخل نهاية المكبس حقنه، بلطف تعطيل أي كتل المتبقية من الخلايا في الشبكة.
    4. شطف الخلايا عن طريق التصفية مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة-جيش صرب البوسنة لكل 1000 من الأجنة.
    5. 40-ميكرون عبر أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد وتصفية تعليق خلية من 50 مل أنبوبة مخروطية الشكل لمرة ثانية في أنبوب 15 مل.
  3. باستخدام خلية مناسبة فرز الصك، تعيين الإثارة الليزر للكشف عن 561-شمال البحر الأبيض المتوسط والانبعاثات إلى 610/20 للكشف عن يوديد propidium.
    1. ميكس 15 مل أنبوب خلايا ملطخة بإيجاز قبل فورتيكسينج ومكان في الصك عند 4 درجة مئوية.
    2. تشغيل معدل الخلايا في تدفق بطيء، من الناحية المثالية 1.0 مل/دقيقة، للحصول على ملف تعريف دورة الخلية نظيفة وتجنب خلط G1 أو G2/M الخلايا مع S المرحلة السكان.
    3. أولاً، بوابة لمنتدى التعاون الأمني-أ x SSC-(منطقة مبعثر إلى الأمام بالجانب مبعثر المنطقة) لإزالة الأنقاض (الشكل 1A).
      ملاحظة: يمكن تكون الخلايا من الأجنة متفاوتة الأحجام تبعاً لنوع المرحلة وخلية. مرشح الكثافة محايدة (ND) قد تحتاج إلى تبديل بين 1.0 و 1.5 تبعاً لحجم الخلايا الحالية. بوابة منطقة كبيرة لجمع معظم الخلايا وإزالة الحطام.
    4. بوابة ثانية، للتعاون بين بلدان الجنوب-المنطقة (SSC-أ) بمنطقة PI (PI-أ)، لإزالة الحطام وخلية دوبليتس (الشكل 1B).
    5. ثالثا، بوابة للتعاون بين بلدان الجنوب، بالتعاون بين بلدان الجنوب-العرض (W) لإزالة أي doublets الخلية المتبقية (الشكل 1).
  4. عرض السكان المبوب في الرسم بياني مع عدد الخلايا (العدد) في منطقة يوديد المحور الصادي و propidium (PI-أ) على المحور س. 24 هبف الأجنة، لهذا ينبغي أن تعطي صورة نمطية دورة الخلية كما في الشكل 1.
    1. لفرز السكان المرحلة S، تعيين البوابة من الجانب الأيمن من ذروة G1 إلى الجانب الأيسر من ذروة G2، بما في ذلك سوى قدر ضئيل من السكان G1 و G2. للأجنة هبف 24، هذا سوف تتضمن عادة حوالي 10-15 في المائة من السكان بوابات (انظر الشكل 1).
    2. لفرز السكان G1، تعيين البوابة على الجانب الأيسر من ذروة G1، لا لتمرير أعلى الذروة. قم بضبط عرض البوابة G1 ضيقة قدر الإمكان (انظر الشكل 1).
    3. عودة البوابة G1 و S المرحلة السكان لضمان المناسبة الأولى النابضة (الشكل 1E).
  5. فرز G1 و S السكان المرحلة إلى 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مع 3 مل من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة. ينبغي أن يكون الهدف الحصول على بين 500,000 و 1 مليون أو أكثر من الخلايا تم فرزها كل جزء (المرحلة G1 و S).
  6. بعد الانتهاء من فرز، أنابيب الطرد المركزي في 1500 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: بيليه الخلية الصغيرة سيكون من الصعب أن نرى، ومن المهم تجنب الإخلال بأنه، لذلك يفضل استخدام دوار دلو يتأرجح عبر دوار زاوية ثابتة.
  7. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. نقل الخلايا إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. بعناية إزالة جميع السائل من أنبوب وتجميد بيليه الجافة عند-20 درجة مئوية. تخزين بيليه في-20 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

5-الحمض النووي العزلة والعلاج رناسي، وتنقية الحمض النووي

  1. إزالة خلية بيليه من-20 درجة مئوية، ومكان على الجليد.
    1. إضافة 400 ميليلتر من مخزونات النشر الاستراتيجي المخزن المؤقت (مم تريس-HCl (pH 8.0)، 10 مم يدتا، 1 م كلوريد الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% من 50) بيليه وريسوسبيند.
    2. إضافة بروتيناز ك إلى تركيز نهائي من 0.2 مغ/مل ومزيج من فورتيكسينج بإيجاز.
    3. احتضان عينات من 56 درجة مئوية ل 2 ح، دوامة كل 15 دقيقة.
  2. بعد ح 2، أداء استخراج الفينول كلوروفورم بإضافة 400 ميليلتر من الفينول-كلوروفورم (25:24:1 الفينول: كلوروفورم: إيسواميل "الكحول"، مشبعة 10 ملم تريس، pH 8.0، 1 مم يدتا).
    1. دوامة للعينة s والطرد المركزي 20 في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق مراحل منفصلة.
    2. بعناية إزالة المرحلة المائية العليا (400 ميليلتر) ونقل إلى أنبوب 1.5 مل.
  3. أداء EtOH هطول الأمطار بإضافة 40 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (5.2 درجة الحموضة)، 2 ميليلتر من الجليكوجين، ومل 1 من EtOH.
    1. الدوامة مزيج دقيق ووضع في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعجل بالحمض النووي. يمكن أيضا أن تكون عجلت عينة في-80 درجة مئوية أو على الثلج الجاف ح 1.
    2. عينة للطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 16,000 ز س لمدة 30 دقيقة للحمض النووي بيليه.
    3. تجاهل بيليه طاف ويغسل مع 1 مل 70% EtOH. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية وز س 16,000 لمدة 5 دقائق.
    4. تجاهل بيليه طاف وأيردري في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  4. حل بيليه في 96 ميليلتر من الماء يعقم، وإضافة 4 ميليلتر من رناسي A (2 مغ/مل).
    1. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
  5. القيام باستخراج الفينول كلوروفورم بإضافة 100 ميليلتر من الفينول كلوروفورم والإجراء التالي في الخطوات 5.2.1-5.2.2.
  6. تنفيذ EtOH هطول الأمطار بواسطة ميليلتر 10 إضافة خلات الصوديوم م 3، 1 ميليلتر الجليكوجين و 250 ميليلتر EtOH واتباع الإجراء في الخطوات 5.3.1-5.3.5.
  7. ريسوسبيند بيليه في 60 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، يدتا 10 ملم (pH8.0)) وتحديد تركيز الحمض النووي باستخدام أسلوب الأسفار-على أساس كمي. تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم تحديد كمية الحمض النووي باستخدام الأصباغ ربط الحمض النووي القائم على الأسفار، أو وسائل أخرى أكثر موثوقية من الأساليب المستندة إلى مطياف الأشعة فوق البنفسجية.

6-إعداد مكتبات الحمض النووي وتسلسل الجيل القادم

ملاحظة: عينة G1 نسخة رقم مرجع لكل مصدر من مصادر بيولوجية مطلوب لكل تشغيل التسلسل (أي وزن، وخط الخلية متحولة، محوره وراثيا،، إلخ). قارن جميع عينات المرحلة S من نفس المصدر البيولوجي في نفس تسلسل تشغيل على نفس مرجع G1. يتطابق البيولوجية تشغيل اثنين على الأقل لكل عينة لضمان الاتساق بين العينات.

  1. تمييع 1 ميكروغرام للحمض النووي لوحدة تخزين نهائي 50 ميليلتر ونقل إلى أنبوب متخصصة ل sonication.
  2. قص الحمض النووي لهدف 250-300 بي بي في أولتراسونيكاتور مركزة، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة والبروتوكول.
  3. التحقق من نوعية وحجم المنفصمة الحمض النووي باستخدام جهاز التفريد الآلي، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة والبروتوكول. ضمان وجود ذروة كبيرة ~ 250-300 بي بي للحمض النووي الجينومي المنفصمة.
  4. تعد المكتبات التسلسل باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة الحمض النووي مع أوليجوس متعدد لتعاقب على منصة إيلومينا، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  5. التحقق من جودة الإعدادية المكتبة باستخدام الجهاز الآلي التفريد، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. ضمان وجود ذروة كبيرة ~ 400-450 شركة بريتيش بتروليوم، وهناك قمم الحد الأدنى مبلمر (80-85 bp) و dimers محول (~ 120 bp).
  6. التحديد الكمي للمكتبات باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي مكتبة الحمض النووي لتسلسل الحمض النووي من الجيل التالي، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  7. متعدد ميليلتر 15 مخفف من مكتبة إلى تركيز 5 نانومتر والجمع بين المكتبات كما هو مطلوب لتحقيق المطلوب فريد قراءة تعيين تهم كل عينة.
    ملاحظة: سوف تحدد عدد فريد على تعيين ما يلي كل عينة القرار. استخدام عدد قليل من 5 مليون المعينة ما يلي لتقييم توقيت النسخ المتماثل للجينوم الزرد. من المستحسن أن تبدأ مع 10 مليون على ما يلي.
  8. أداء إقران-نهاية 100 شركة بريتيش بتروليوم الجينوم كله تسلسل الحمض النووي من عينات على منصة تسلسل جيل القادم، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

7-تحليل البيانات التسلسل

ملاحظة: تهدف الإرشادات الموجودة في هذا المقطع كمبدأ توجيهي للتحليل. استخدام أساليب إضافية لمحاذاة التسلسل، التصفية، التجهيز، إلخ. وسيتناول هذا الجزء من البروتوكول الأسلوب المفضل للتحليل في هذا العمل. إذا استخدمت أساليب إضافية، ضبط المعلمات والوظائف التي تناسب هذه الأغراض. يتم إدخال الأوامر أدناه في أوبوتنو أو ماك المحطة الطرفية، مع الحزم المناسبة مثبتة.

  1. الحصول على أحدث الإصدارات من الجينوم الزرد (danRer10، وحتى عندما كتب هذا البروتوكول) من مستعرض الجينوم التسخن باستخدام الأوامر التالية:
    مجلد مشترك ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. إلغاء ضغط الملف fa.gz باستخدام الأمر التالي:
      gunzip danRer10.fa.gz
    2. محاذاة البيانات تسلسل الجينوم استخدام التحالف-الفنزويلية باستخدام الأوامر التالية:
      التحالف mem-t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. تحويل ملف.sam إلى الملف.bam باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
    عرض سامتولس input.sam-بكالوريوس > output.bam
    1. فرز الملفات تسلسل محاذاة باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
      فرز سامتولس output.bam > output_sorted.bam
    2. فهرسة الملف.bam باستخدام سامتولس باستخدام الأمر التالي:
      سامتولس فهرس output.bam
  3. مارك PCR التكرارات مع بيكار باستخدام الأوامر التالية:
    جافا--Xmx2g--جرة picard.jar ماركدوبليكاتيس \
    INPUT=input.bam
    OUTPUT=output.bam
    REMOVE_DUPLICATES = false
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. إنشاء الملفات النصية (.txt) لما يلي لكل كروموسوم باستخدام الأمر التالي:
    لأني في {1.25}؛ هل معدن الكروم = "مركز حقوق الإنسان" $i؛ صدى $CHROM؛ عرض سامتولس input.bam $CHROM | قص--و 2,4,5,7,8,9 > ريادشر ${i}.txt؛ عمله
    ملاحظة: الأعمدة الموجودة في ملف.txt الناتج هي العلم، زوج الموقع، مابق، مركز حقوق الإنسان وموقع زوج وحجم الشظايا، على التوالي.
  5. قراءة ملفات txt. في Matlab (أو أي برامج أخرى مشابهة) باستخدام الدالة تيكستسكان.
    1. تصفية تعيين منخفضة الجودة ما يلي بتحديد عتبة مابق من 30.
    2. قم بإزالة ما يلي مع إشارات للمحاذاة لا الأولية أو PCR التكرارات تعيين زوج كروموسوم مختلفة.
    3. تصفية أية قراءات مع الزوج تتجاوز عتبة مسافة من شركة بريتيش بتروليوم عام 2000.
    4. تقييم الإحصاءات الناتجة عن ذلك ما يلي: تحديد عدد لقراءة الإحصاءات والتغطية، وإدراج حجم ونوعية (الشكل 2).
  6. تحديد التغطية القراءة في windows bp ثابتة 100 لكل عينة بإحصاء عدد يقرأ في 100 شركة بريتيش بتروليوم فترات عبر طول كل كروموسوم.
    1. حساب المتوسط عدد مرات لكافة إطارات القراءة.
    2. تصفية مناطق التغطية العالية بإزالة windows أكبر من الانحرافات المعيارية 5 من الوسيط.
  7. تحديد المناطق لتحليل العينات المرجعية G1 بإيجاد قطاعات على طول كل كروموسوم مع 200 ما يلي: استخدام النوافذ المنزلقة.
    1. تحديد عمق القراءة في كل عينة المرحلة S بإحصاء عدد القراءات مرحلة ثانية في windows عدد مرات القراءة 200 تعريف للإشارة G1 المصاحبة لها.
  8. البيانات الأولية باستخدام الدالة كسابس في البرنامج، مع عامل استيفاء (ف) من 10-16على نحو سلس.
  9. تطبيع البيانات ممهدة لدرجة z مع متوسط 0 والانحراف المعياري 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام بيانات توقيت نشر النسخ المتماثل، يتم توفير النسخ المتماثل الممثل توقيت التشكيلات الجانبية وتدابير مراقبة الجودة15. وتشمل الخطوات الأولية لمعالجة محاذاة البيانات تسلسل الجينوم، حساب طول القراءة والجينوم تغطية الإحصاءات، وتصفية منخفضة الجودة، مزاوج، وبكر مكررة ما يلي. قراءة الإحصاءات لنموذج تسلسل الزرد نموذجية مبينة في الشكل 2. بعد تصفية، ممهدة قراءة التهم مصممون في ويندوز متغير الحجم والبيانات وتطبيعها. النسخ المتماثل النموذجية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد توفير نظام نموذجية جديدة وفريدة من نوعها في فيفو لدراسة توقيت تكرار الحمض النووي. عندما يتم تنفيذ ماتينجس موقوت مفصلة في هذا البروتوكول التجريبي، يمكن جمع آلاف أجنة في يوم واحد للتجارب. هذه الأجنة تطوير شكل متزامن من خلال دقة توقيت ووضوح تتسم مراحل التنمية. يمكن تقسيم الزرد بسهولة ودقة مورفولوجيا ستيريوميكروسكوبي، باستخدام أجنة الزرد وتطور خارجياً بصريا واضحة. تفاصيل هذا البروتوكول استخدام الأجنة الزرد لدراسة توقيت النسخ المتماثل في جميع أنحاء تطوير الفقاريات.

وتشمل مجالات البرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كان يدعمها المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم "المعاهد الوطنية للصحة" عن طريق المنح 5P20GM103636-02 (بما في ذلك الدعم الأساسي التدفق الخلوي) و 1R01GM121703، فضلا عن جوائز من مركز أوكلاهوما "الخلايا الجذعية من البالغين" البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومفيشر العلميBP358-10
KClفيشر ScientificP217-500
CaCl 2< / sub>Fisher ScientificC79-500
MgSO4< / sub>EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3< / sub>Fisher ScientificBP328-500
PronaseSigma10165921001محلول البروتياز
مخزن بالفوسفات (PBS)SigmaD1408
الإيثانول (EtOH)KOPTECV1016
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA9647-100G
بروبيديوم يوديد (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Proteinase KNEBP8107S
الفينول: كلوروفورمسيجماP3803-100ML
أسيتات الصوديومJTBaker3470
GlycogenAmbionAM9510
RNase AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130الكواشف لقياس الحمض النووي القائم على التألق
Covaris AFA microTUBECovaris520045أنبوب متخصص للصوتنة
Covaris E220 SonicatorCovarisE220Focus ultrasonicator
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAآلة الرحلان الكهربائي الآلي
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582الكواشف لآلة الرحلان الكهربائي الآلي
NEBNext Ultra DNA Library Kit ل IlluminaNEBCat # E7370Lمجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي
NEBNext Multiplex Oligos Kit ل Illumina (مجموعة بادئات الفهرس 1)NEBCat # E7335Sمتعددة oligos لمجموعة
إعداد مكتبة الحمض النوويNEBNext Multiplex Oligos Kit ل Illumina (مجموعة بادئات الفهرس 2) NEBCat # E7500Soligos متعددة الإرسال الإضافية لمجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي
NEBNext Library Quant Kit ل IlluminaNEBE7630Lمجموعة القياس الكمي لإعداد المكتبة
Agencourt AMPure XPالخرز Beckman CoulterA63882
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY & ndash ؛ 401 & ندش ؛ 2501الجيل التالي من منصة تسلسل الحمض النووي
40 & مايكرو ؛ m Falcon Nylon Cell StrainerFisher Scientific08-771-1
VWR طبق بتري يمكن التخلص منه 100 × 25 ممVWR89107-632
6.0 مل حقنة ل Nichiryo Model 8100VWR89078-446
Posi-Click Tubes ، 1.7 مل ، لون طبيعيDenville ScientificC2170 (1001002)Vortex Genie 2 Scientific Industries خالية من Dnase / Rnase
SI-0236
زجاجات غسيلVWR16650-022بولي إيثيلين منخفض الكثافة ،
مصفاةVWR470092-4406.9 سم ، خزان شبكي
ناعم Corssingخزان AquaneeringZHCT100خزان تربية فردي
iSpawnTechniplastN / Aخزان تربية كبير
FACSAria IIBD biosciencesN / Aآلة فرز الخلايا
المجهر القصي البري M5aمجهر تشريح وايلد هيربروجN / A
الفلور ThermoScientificQ33216طريقة قائمة على التألق الكمي لتحديد تركيز الحمض النووي
MatlabMathworksالإصدار 2017a
Matlab Statistics ToolboxMathworksالإصدار 11.1
Matlab Curve Fitting ToolboxMathworksالإصدار 3.5.5
محلول ملحي واسعة الفم مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  4. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).
  5. Hiratani, I., et al. Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis. Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).
  6. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  7. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  8. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  9. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  10. Link, B. A., Megason, S. G. Zebrafish as a Model for Development. Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).
  11. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  14. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  15. Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation. Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).
  16. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Zebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

مقالات ذات صلة